雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)

1、第四講第四講 雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)第一節(jié)、免疫的基本知識(shí)第一節(jié)、免疫的基本知識(shí)一、免疫系統(tǒng)：分非適應(yīng)性免疫和適應(yīng)性免疫兩類。一、免疫系統(tǒng)：分非適應(yīng)性免疫和適應(yīng)性免疫兩類。 1、非適應(yīng)性免疫是由非特異性反應(yīng)的細(xì)胞介導(dǎo)的。如：巨、非適應(yīng)性免疫是由非特異性反應(yīng)的細(xì)胞介導(dǎo)的。如：巨噬細(xì)胞的吞噬作用，泌細(xì)胞分泌的溶菌酶，以及中性細(xì)胞造噬細(xì)胞的吞噬作用，泌細(xì)胞分泌的溶菌酶，以及中性細(xì)胞造成的細(xì)胞裂解機(jī)制。成的細(xì)胞裂解機(jī)制。 2、適應(yīng)性免疫：是針對(duì)特定分子，而且可經(jīng)反復(fù)暴露于外、適應(yīng)性免疫：是針對(duì)特定分子，而且可經(jīng)反復(fù)暴露于外源分子使之加強(qiáng)淋巴細(xì)胞合成細(xì)胞表面受體或分泌特異性

2、蛋源分子使之加強(qiáng)淋巴細(xì)胞合成細(xì)胞表面受體或分泌特異性蛋白結(jié)合外源分子。這些分泌的蛋白稱為抗體；可與抗體結(jié)合白結(jié)合外源分子。這些分泌的蛋白稱為抗體；可與抗體結(jié)合的分子被稱為抗原。當(dāng)一個(gè)分子被用于誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)時(shí)，的分子被稱為抗原。當(dāng)一個(gè)分子被用于誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)時(shí)，這個(gè)分子就被叫做免疫原。這個(gè)分子就被叫做免疫原。3、免疫系統(tǒng)含有、免疫系統(tǒng)含有109以上淋巴細(xì)胞遍布全身，保證了它們?cè)谝陨狭馨图?xì)胞遍布全身，保證了它們?cè)谌魏尾课欢寄苎杆俜磻?yīng)。淋巴細(xì)胞由骨髓中的原始干細(xì)胞不任何部位都能迅速反應(yīng)。淋巴細(xì)胞由骨髓中的原始干細(xì)胞不斷產(chǎn)生，經(jīng)血液及淋巴系統(tǒng)循環(huán)，暫時(shí)停頓并積聚于稱作淋斷產(chǎn)生，經(jīng)血液及淋巴系統(tǒng)循環(huán)，

3、暫時(shí)停頓并積聚于稱作淋巴器官的特異化的結(jié)構(gòu)中，在哺乳動(dòng)物中就是淋巴結(jié)和肝臟。巴器官的特異化的結(jié)構(gòu)中，在哺乳動(dòng)物中就是淋巴結(jié)和肝臟。在免疫反應(yīng)過(guò)程中，免疫原積聚于一個(gè)淋巴器官中，這個(gè)淋在免疫反應(yīng)過(guò)程中，免疫原積聚于一個(gè)淋巴器官中，這個(gè)淋巴器官就變成了免疫反應(yīng)的焦點(diǎn)。巴器官就變成了免疫反應(yīng)的焦點(diǎn)。 B細(xì)胞：分泌抗體，并在細(xì)胞表面攜帶同一抗體的修飾型，細(xì)胞：分泌抗體，并在細(xì)胞表面攜帶同一抗體的修飾型，功能相當(dāng)于受體。功能相當(dāng)于受體。 毒性毒性T細(xì)胞：攜帶結(jié)合抗原的細(xì)胞表面受體。細(xì)胞：攜帶結(jié)合抗原的細(xì)胞表面受體。 輔助輔助T細(xì)胞：在控制細(xì)胞：在控制B細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)方面起關(guān)細(xì)胞反

4、應(yīng)方面起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。鍵的調(diào)節(jié)作用。 體液介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)：體液反應(yīng)引發(fā)產(chǎn)生可結(jié)合外體液介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)：體液反應(yīng)引發(fā)產(chǎn)生可結(jié)合外來(lái)抗原的循環(huán)抗體，由來(lái)抗原的循環(huán)抗體，由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，由輔助淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，由輔助T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞介導(dǎo)是抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。介導(dǎo)是抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)：毒性細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)：毒性T淋巴細(xì)胞結(jié)合于外來(lái)淋巴細(xì)胞結(jié)合于外來(lái)或感染的細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞裂解，輔助或感染的細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞裂解，輔助T細(xì)胞參與該反細(xì)胞參與該反應(yīng)。應(yīng)。二、免疫系統(tǒng)能特異性地對(duì)無(wú)數(shù)種分子反應(yīng)。二、免疫系統(tǒng)能特異性地對(duì)無(wú)數(shù)種分子反應(yīng)。 免疫系統(tǒng)持續(xù)地受無(wú)數(shù)抗原

5、刺激。免疫系統(tǒng)的一個(gè)主要形免疫系統(tǒng)持續(xù)地受無(wú)數(shù)抗原刺激。免疫系統(tǒng)的一個(gè)主要形式是它能合成大量的抗體及細(xì)胞表面受體。各個(gè)帶有不同抗式是它能合成大量的抗體及細(xì)胞表面受體。各個(gè)帶有不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體和原結(jié)合位點(diǎn)的抗體和T細(xì)胞受體與外來(lái)分子的結(jié)合提供了免細(xì)胞受體與外來(lái)分子的結(jié)合提供了免疫反應(yīng)特異性的基礎(chǔ)。疫反應(yīng)特異性的基礎(chǔ)。三、個(gè)別淋巴細(xì)胞識(shí)別個(gè)別抗原三、個(gè)別淋巴細(xì)胞識(shí)別個(gè)別抗原一個(gè)細(xì)胞識(shí)別一個(gè)抗原，因?yàn)閱我涣馨图?xì)胞上的所有抗一個(gè)細(xì)胞識(shí)別一個(gè)抗原，因?yàn)閱我涣馨图?xì)胞上的所有抗原受體是相同的。原受體是相同的。在成熟淋巴細(xì)胞表面的所有受體都是糖蛋白，體細(xì)胞基在成熟淋巴細(xì)胞表面的所有受體都是糖蛋白，體細(xì)胞

6、基因重組、突變及基因轉(zhuǎn)錄后加工等使受體產(chǎn)生因重組、突變及基因轉(zhuǎn)錄后加工等使受體產(chǎn)生107個(gè)以上的個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)?？乖禺愋酝ㄟ^(guò)確保只有一個(gè)類型的受體在一結(jié)合位點(diǎn)?？乖禺愋酝ㄟ^(guò)確保只有一個(gè)類型的受體在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)被合成的過(guò)程來(lái)維持。個(gè)細(xì)胞內(nèi)被合成的過(guò)程來(lái)維持。雖然雖然B細(xì)胞表面抗體和細(xì)胞表面抗體和T細(xì)胞表面受體都具有類似的結(jié)構(gòu)細(xì)胞表面受體都具有類似的結(jié)構(gòu)，但它們是由不同的基因家族編碼的，其表達(dá)具有細(xì)胞型，但它們是由不同的基因家族編碼的，其表達(dá)具有細(xì)胞型的特異性。的特異性。B細(xì)胞上的表面抗體能結(jié)合可溶性抗原，而細(xì)胞上的表面抗體能結(jié)合可溶性抗原，而T細(xì)細(xì)胞受體僅僅識(shí)別在其它細(xì)胞表面展示的抗原胞受體

7、僅僅識(shí)別在其它細(xì)胞表面展示的抗原四、免疫系統(tǒng)能將外來(lái)微生物和分子與自身成分區(qū)別開來(lái)。四、免疫系統(tǒng)能將外來(lái)微生物和分子與自身成分區(qū)別開來(lái)。五、系統(tǒng)記憶每一次與外來(lái)抗原的遭遇五、系統(tǒng)記憶每一次與外來(lái)抗原的遭遇 免疫反應(yīng)遇到同一抗原時(shí)一次比一次強(qiáng)，具有特異性。免免疫反應(yīng)遇到同一抗原時(shí)一次比一次強(qiáng)，具有特異性。免疫記憶可以延續(xù)動(dòng)物終生。疫記憶可以延續(xù)動(dòng)物終生。六、免疫反應(yīng)的許多性質(zhì)是通過(guò)克隆選擇確定的六、免疫反應(yīng)的許多性質(zhì)是通過(guò)克隆選擇確定的 一種抗原活化一種淋巴細(xì)胞。當(dāng)淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合一種抗原活化一種淋巴細(xì)胞。當(dāng)淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合抗原時(shí)，抗原時(shí)，B淋巴細(xì)胞就被活化，分泌抗體被刺激而增殖（急淋巴

8、細(xì)胞就被活化，分泌抗體被刺激而增殖（急劇分裂克?。?。劇分裂克?。?。七、一個(gè)有效免疫系統(tǒng)的成熟是由廣泛的細(xì)胞間信息交換來(lái)七、一個(gè)有效免疫系統(tǒng)的成熟是由廣泛的細(xì)胞間信息交換來(lái)調(diào)節(jié)的。調(diào)節(jié)的。第二節(jié)、抗體分子第二節(jié)、抗體分子抗體是具有共同結(jié)構(gòu)和功能形式的一大類糖蛋白。抗體分抗體是具有共同結(jié)構(gòu)和功能形式的一大類糖蛋白。抗體分成五類：成五類：IgG、IgM、IgA、IgE和和IgD（見表（見表2-1）。）。一、一、IgG類抗體有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)類抗體有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)區(qū)域被稱作含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)區(qū)域被稱作Fab片段，涉及到免片段，涉及到免疫調(diào)節(jié)的蛋白區(qū)稱作疫調(diào)節(jié)的蛋

9、白區(qū)稱作Fc片段，在片段，在Fab和和Fc片段之間的部分稱片段之間的部分稱作鉸鏈區(qū)。作鉸鏈區(qū)。重鏈分子量為重鏈分子量為5.5kDlt；輕鏈分子量為；輕鏈分子量為2.5kDlt。二、不同類型抗體的區(qū)別二、不同類型抗體的區(qū)別IgG、IgM、IgA、IgE和和IgD因重鏈形式不同而有所區(qū)別。因重鏈形式不同而有所區(qū)別。它們的重鏈分別稱作它們的重鏈分別稱作、和和。重鏈的不同使這些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在重鏈的不同使這些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在完成反應(yīng)成熟的不同階段發(fā)揮作用。這些差異主要是由于完成反應(yīng)成熟的不同階段發(fā)揮作用。這些差異主要是由于Fc片段上的蛋白序列不同所致。片段上的蛋白序

10、列不同所致。輕鏈只有兩種：輕鏈只有兩種：、。 三、抗體輕鏈的分子結(jié)構(gòu)三、抗體輕鏈的分子結(jié)構(gòu)比較輕鏈的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，輕鏈有一個(gè)恒定區(qū)和一個(gè)可比較輕鏈的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，輕鏈有一個(gè)恒定區(qū)和一個(gè)可變區(qū)。輕鏈由變區(qū)。輕鏈由220個(gè)氨基酸組成，分為兩個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)由大個(gè)氨基酸組成，分為兩個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)由大約約110個(gè)氨基酸組成。個(gè)氨基酸組成。-NH2末端那半部分是異源性的，稱為末端那半部分是異源性的，稱為可變區(qū)（可變區(qū)（V）；羧基末端那部分稱為恒定區(qū)（）；羧基末端那部分稱為恒定區(qū)（C）。）。恒定區(qū)有兩種類型：一種是決定恒定區(qū)有兩種類型：一種是決定輕鏈的，另一種是決定輕鏈的，另一種是決定輕鏈的。輕鏈的。輕鏈基

11、因位于第輕鏈基因位于第6染色體上，而染色體上，而輕鏈的基因則位輕鏈的基因則位于第于第16染色體上。染色體上。四、抗體重鏈的分子結(jié)構(gòu)四、抗體重鏈的分子結(jié)構(gòu)重鏈的序列也存在可變區(qū)和恒定區(qū)（圖重鏈的序列也存在可變區(qū)和恒定區(qū)（圖2-1）。）。IgG重鏈含重鏈含有一個(gè)可變區(qū)和三個(gè)恒定區(qū)，每區(qū)含有一個(gè)可變區(qū)和三個(gè)恒定區(qū)，每區(qū)含110個(gè)氨基酸，其它重個(gè)氨基酸，其它重鏈含有附加的恒定區(qū)。鏈含有附加的恒定區(qū)。IgG重鏈序列也顯示重鏈序列也顯示鏈有四種亞類，即：鏈有四種亞類，即：IgG1、IgG2a、IgG2b和和IgG3。鼠重鏈多肽編碼區(qū)在第。鼠重鏈多肽編碼區(qū)在第12染色體上。染色體上。 五、重鏈和輕鏈的可變區(qū)

12、形成抗原結(jié)合位點(diǎn)五、重鏈和輕鏈的可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)重鏈的可變區(qū)和一個(gè)輕鏈的可變區(qū)結(jié)合形成一個(gè)抗原一個(gè)重鏈的可變區(qū)和一個(gè)輕鏈的可變區(qū)結(jié)合形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?？勺儏^(qū)的異質(zhì)性提供了動(dòng)物有效進(jìn)行免疫反應(yīng)所結(jié)合位點(diǎn)?？勺儏^(qū)的異質(zhì)性提供了動(dòng)物有效進(jìn)行免疫反應(yīng)所需的無(wú)數(shù)結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)。序列異質(zhì)性并不是由整個(gè)可變區(qū)需的無(wú)數(shù)結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)。序列異質(zhì)性并不是由整個(gè)可變區(qū)的每一部分決定的，而是集中在與抗原接觸的位點(diǎn)上。多數(shù)的每一部分決定的，而是集中在與抗原接觸的位點(diǎn)上。多數(shù)可變性決定于每一個(gè)鏈的三個(gè)短區(qū)，它們形成輕鏈的三個(gè)超可變性決定于每一個(gè)鏈的三個(gè)短區(qū)，它們形成輕鏈的三個(gè)超變區(qū)和重鏈的三個(gè)超變區(qū)。這些超

13、變區(qū)形成抗原抗體結(jié)合的變區(qū)和重鏈的三個(gè)超變區(qū)。這些超變區(qū)形成抗原抗體結(jié)合的接觸殘基的主體，同時(shí)這些超變區(qū)位于擴(kuò)展進(jìn)入抗原反應(yīng)區(qū)接觸殘基的主體，同時(shí)這些超變區(qū)位于擴(kuò)展進(jìn)入抗原反應(yīng)區(qū)的短環(huán)上。由于它們是實(shí)際的抗原結(jié)合位點(diǎn)，故被認(rèn)為是互的短環(huán)上。由于它們是實(shí)際的抗原結(jié)合位點(diǎn)，故被認(rèn)為是互補(bǔ)決定區(qū)。補(bǔ)決定區(qū)。六、功能性六、功能性、輕鏈和重鏈基因的一個(gè)明顯特征是在所有輕鏈和重鏈基因的一個(gè)明顯特征是在所有細(xì)胞中這些基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接是不同的（見圖細(xì)胞中這些基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接是不同的（見圖2）。）。200個(gè)個(gè)V區(qū)，區(qū)，4個(gè)功能性個(gè)功能性J區(qū)。區(qū)。七、形成七、形成輕鏈輕鏈pre-mRNA外顯子也要重排

14、（圖外顯子也要重排（圖3）。）。V-J-C-J-C。八、形成功能性重鏈基因需要八、形成功能性重鏈基因需要pre-mRNA外顯子的重排（外顯子的重排（圖圖4）。）。50100種可變區(qū)，種可變區(qū)，12個(gè)個(gè)D區(qū)，區(qū)，4個(gè)個(gè)J區(qū)。區(qū)。九、這些重組及其它機(jī)制產(chǎn)生了無(wú)數(shù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。九、這些重組及其它機(jī)制產(chǎn)生了無(wú)數(shù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。十、等位基因排斥確保在任一十、等位基因排斥確保在任一B細(xì)胞中只有重新排列的一細(xì)胞中只有重新排列的一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈被表達(dá)。產(chǎn)生不同重鏈和輕鏈的基因重組個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈被表達(dá)。產(chǎn)生不同重鏈和輕鏈的基因重組不總是產(chǎn)生一個(gè)功能基因，在不總是產(chǎn)生一個(gè)功能基因，在B細(xì)胞分化過(guò)程中，輕鏈重

15、排細(xì)胞分化過(guò)程中，輕鏈重排開始于開始于區(qū)內(nèi)。然后，若二倍體基因中的一個(gè)首先重排，產(chǎn)區(qū)內(nèi)。然后，若二倍體基因中的一個(gè)首先重排，產(chǎn)生一個(gè)功能性等位基因，另一個(gè)拷貝則進(jìn)行重組。若二個(gè)重生一個(gè)功能性等位基因，另一個(gè)拷貝則進(jìn)行重組。若二個(gè)重組都產(chǎn)生非功能性等位基因，那么重組就要組都產(chǎn)生非功能性等位基因，那么重組就要位點(diǎn)開始，以同位點(diǎn)開始，以同樣的機(jī)制產(chǎn)生功能性重鏈。一旦重組產(chǎn)生一個(gè)功能性抗體，樣的機(jī)制產(chǎn)生功能性重鏈。一旦重組產(chǎn)生一個(gè)功能性抗體，一個(gè)未知的機(jī)制就制止進(jìn)一步重組。將抗原性結(jié)合位點(diǎn)固定一個(gè)未知的機(jī)制就制止進(jìn)一步重組。將抗原性結(jié)合位點(diǎn)固定，直到細(xì)胞死亡。這個(gè)機(jī)制叫等位基因排斥。它可以解釋為，直到

16、細(xì)胞死亡。這個(gè)機(jī)制叫等位基因排斥。它可以解釋為什么什么B淋巴細(xì)胞分泌的只有一種抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體和抗體淋巴細(xì)胞分泌的只有一種抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體和抗體只有一種類型的輕鏈。只有一種類型的輕鏈。十一、其它：重組被用于生產(chǎn)各種類和亞類的抗體。十一、其它：重組被用于生產(chǎn)各種類和亞類的抗體。 淋巴細(xì)胞雜交瘤淋巴細(xì)胞雜交瘤與單克隆抗體技術(shù)與單克隆抗體技術(shù) 1960年，法國(guó)的年，法國(guó)的Barski等首先發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型的細(xì)等首先發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型的細(xì)胞在混合培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)自發(fā)融合形成融合細(xì)胞。與此同胞在混合培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)自發(fā)融合形成融合細(xì)胞。與此同時(shí)，日本的時(shí)，日本的Okada也發(fā)現(xiàn)紫外線滅活的仙臺(tái)病毒也發(fā)

17、現(xiàn)紫外線滅活的仙臺(tái)病毒(Sandai virus)可以誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞相互融合，在此基礎(chǔ)上用滅可以誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞相互融合，在此基礎(chǔ)上用滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了第一個(gè)種間的雜交細(xì)胞?；畹南膳_(tái)病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了第一個(gè)種間的雜交細(xì)胞。 1976年年Kohler和和Milstein創(chuàng)建了一個(gè)方法，他們將分泌一創(chuàng)建了一個(gè)方法，他們將分泌一種特異性抗體的種特異性抗體的B細(xì)胞和體外持續(xù)生長(zhǎng)的漿細(xì)胞瘤融合，產(chǎn)細(xì)胞和體外持續(xù)生長(zhǎng)的漿細(xì)胞瘤融合，產(chǎn)生的雜交細(xì)胞克隆表達(dá)了抗體生成的正常生的雜交細(xì)胞克隆表達(dá)了抗體生成的正常B細(xì)胞和漿細(xì)胞瘤細(xì)胞和漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的免疫球蛋白基因，同時(shí)也具有在體外無(wú)限增殖的能細(xì)胞的免疫球蛋

18、白基因，同時(shí)也具有在體外無(wú)限增殖的能力。為此創(chuàng)造了雜交瘤力。為此創(chuàng)造了雜交瘤(hybridoma)這個(gè)名詞，以描述一個(gè)這個(gè)名詞，以描述一個(gè)正常抗體生成細(xì)胞和一個(gè)漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。由于正常抗體生成細(xì)胞和一個(gè)漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物。由于他們的重要科學(xué)貢獻(xiàn)，他們的重要科學(xué)貢獻(xiàn)，Kohler和和Milstein在在1984年榮獲了諾年榮獲了諾貝爾醫(yī)學(xué)生理獎(jiǎng)。貝爾醫(yī)學(xué)生理獎(jiǎng)。 一、免疫原性一、免疫原性 許多外源分子、病毒或細(xì)胞單純注射在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)能許多外源分子、病毒或細(xì)胞單純注射在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)能引起強(qiáng)的抗體反應(yīng)，而一些物質(zhì)卻不能，對(duì)于這些情況，引起強(qiáng)的抗體反應(yīng)，而一些物質(zhì)卻不能，對(duì)于這些情況，常

19、可通過(guò)修飾抗原或改變宿主而使免疫系統(tǒng)反應(yīng)增加。常可通過(guò)修飾抗原或改變宿主而使免疫系統(tǒng)反應(yīng)增加。 好的免疫原分子必須具備以下條件：好的免疫原分子必須具備以下條件： 1、抗原結(jié)合于原始、抗原結(jié)合于原始B細(xì)胞表面抗體分子對(duì)于抗體反應(yīng)是細(xì)胞表面抗體分子對(duì)于抗體反應(yīng)是絕對(duì)必要的。這個(gè)結(jié)合決定了產(chǎn)生抗體的特異性。因?yàn)楸斫^對(duì)必要的。這個(gè)結(jié)合決定了產(chǎn)生抗體的特異性。因?yàn)楸砻婵贵w分子上的抗原決定位點(diǎn)與分泌抗體的結(jié)合位點(diǎn)是一面抗體分子上的抗原決定位點(diǎn)與分泌抗體的結(jié)合位點(diǎn)是一致的。致的。 2、它必須能促進(jìn)、它必須能促進(jìn)B細(xì)胞與輔助細(xì)胞與輔助T細(xì)胞間的信息交換。這細(xì)胞間的信息交換。這要求在兩個(gè)細(xì)胞間有物理連接。即有一

20、個(gè)位點(diǎn)被要求在兩個(gè)細(xì)胞間有物理連接。即有一個(gè)位點(diǎn)被II級(jí)蛋白級(jí)蛋白及及T細(xì)胞受體所識(shí)別。細(xì)胞受體所識(shí)別。 3、通常它必須可被降解。、通常它必須可被降解。二、抗原來(lái)源二、抗原來(lái)源 開始一個(gè)免疫程序之前，對(duì)制備抗原的考慮主要于抗原開始一個(gè)免疫程序之前，對(duì)制備抗原的考慮主要于抗原所需的劑量和純度。這應(yīng)基于預(yù)計(jì)產(chǎn)生抗體的用途。如果所需的劑量和純度。這應(yīng)基于預(yù)計(jì)產(chǎn)生抗體的用途。如果僅僅需要識(shí)別相應(yīng)抗原的高特異性抗體，那么抗原必須要僅僅需要識(shí)別相應(yīng)抗原的高特異性抗體，那么抗原必須要相當(dāng)純，或抗原制備物用于制備單克隆抗體。相當(dāng)純，或抗原制備物用于制備單克隆抗體。 1、純抗原、純抗原 2、從聚丙烯酰胺凝膠中純

21、化抗原。、從聚丙烯酰胺凝膠中純化抗原。 3、半抗原：半抗原若被偶聯(lián)于大的蛋白分子上就能被、半抗原：半抗原若被偶聯(lián)于大的蛋白分子上就能被用于誘發(fā)抗體。半抗原起抗原決定簇作用，與用于誘發(fā)抗體。半抗原起抗原決定簇作用，與B細(xì)胞表面細(xì)胞表面抗體結(jié)合，載體提供抗體結(jié)合，載體提供II級(jí)級(jí)T細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)?？傊?，半細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)?？傊?，半抗原應(yīng)被偶聯(lián)于可溶性載體上，如抗原應(yīng)被偶聯(lián)于可溶性載體上，如BSA。 4、合成多肽也要連接到載體上。、合成多肽也要連接到載體上。三、動(dòng)物免疫三、動(dòng)物免疫1、動(dòng)物選擇、動(dòng)物選擇 Balb/c小鼠，小鼠，68周齡；兔子生后約周齡；兔子生后約12周。周。 動(dòng)物數(shù)：小鼠動(dòng)物數(shù)：

22、小鼠46只；兔子只；兔子24只。只。2、佐劑、佐劑 免疫反應(yīng)的非特異性刺激物叫做佐劑，誘導(dǎo)對(duì)可溶性抗原免疫反應(yīng)的非特異性刺激物叫做佐劑，誘導(dǎo)對(duì)可溶性抗原的抗體反應(yīng)必須使用佐劑。但對(duì)顆粒性抗原或全細(xì)胞抗原則的抗體反應(yīng)必須使用佐劑。但對(duì)顆粒性抗原或全細(xì)胞抗原則不是必須的。不是必須的。 佐劑包含兩種因素：一是佐劑是儲(chǔ)備性物質(zhì)以防止抗原迅佐劑包含兩種因素：一是佐劑是儲(chǔ)備性物質(zhì)以防止抗原迅速代謝；二是佐劑必須是可以非特異性地刺激免疫反應(yīng)的物速代謝；二是佐劑必須是可以非特異性地刺激免疫反應(yīng)的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)時(shí)一般是將水溶液注入到佐劑中。質(zhì)。實(shí)驗(yàn)時(shí)一般是將水溶液注入到佐劑中。3、抗原劑量、抗原劑量 對(duì)于兔，若有大

23、量可溶的純抗原可用，一般認(rèn)為每次免疫對(duì)于兔，若有大量可溶的純抗原可用，一般認(rèn)為每次免疫于佐劑中有于佐劑中有0.51.0mg劑量是可取的；對(duì)于小鼠來(lái)講，劑量劑量是可取的；對(duì)于小鼠來(lái)講，劑量則降則降10倍，為倍，為50100g。4、抗原的形式、抗原的形式5、注射途徑：需考慮三個(gè)問(wèn)題。、注射途徑：需考慮三個(gè)問(wèn)題。 1）要注射多大劑量；）要注射多大劑量； 2）與免疫原同注的是什么緩沖液，還有其它什么成分；）與免疫原同注的是什么緩沖液，還有其它什么成分； 3）免疫原釋放入淋巴系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)的速度如何？）免疫原釋放入淋巴系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)的速度如何？ 對(duì)于兔，大體積注射常采用皮下多點(diǎn)注射。對(duì)于兔，大體積注射常

24、采用皮下多點(diǎn)注射。 對(duì)于鼠，大體積注射常采用腹腔注射，若需緩慢釋放則對(duì)于鼠，大體積注射常采用腹腔注射，若需緩慢釋放則采用肌注或皮下注射，若需立即釋放宜采用靜脈注射。采用肌注或皮下注射，若需立即釋放宜采用靜脈注射。 對(duì)于鼠來(lái)說(shuō)，第二次和第三次免疫應(yīng)間隔至少對(duì)于鼠來(lái)說(shuō)，第二次和第三次免疫應(yīng)間隔至少3周。周。 對(duì)于兔來(lái)說(shuō)，每對(duì)于兔來(lái)說(shuō)，每36周注射一次。周注射一次。 超免疫化動(dòng)物血清主要含超免疫化動(dòng)物血清主要含IgG抗體。其實(shí)質(zhì)部分為特異性抗體。其實(shí)質(zhì)部分為特異性抗體?？乖禺惖目贵w?？乖禺惖腎gG水平可達(dá)水平可達(dá)1mg/ml，這幾乎等于血清中，這幾乎等于血清中總總IgG水平的水平的10%。DNA

25、合成合成 氨基酸、氨基酸、核苷酸庫(kù)核苷酸庫(kù) dGTP、dTTP次黃嘌呤次黃嘌呤H H 肌苷酸肌苷酸 胸腺嘧胸腺嘧啶核苷啶核苷T T脫氧核苷酸脫氧核苷酸次黃嘌呤磷酸核糖次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶(HGPRT) 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷激酶激酶（TK）氨基氨基蝶呤蝶呤A A 雜種細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合帶有一定的隨機(jī)性，雜種細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合帶有一定的隨機(jī)性，除不同親本細(xì)胞間的融合外，還伴有各親本細(xì)胞的除不同親本細(xì)胞間的融合外，還伴有各親本細(xì)胞的自身融合。因此，在緊隨細(xì)胞融合之后，必須設(shè)法自身融合。因此，在緊隨細(xì)胞融合之后，必須設(shè)法把含有兩親本細(xì)胞染色體的雜種細(xì)胞分離或篩選出把含有兩親本細(xì)胞染色體

26、的雜種細(xì)胞分離或篩選出來(lái)。最簡(jiǎn)便的辦法無(wú)疑是應(yīng)用選擇培養(yǎng)基，使親本來(lái)。最簡(jiǎn)便的辦法無(wú)疑是應(yīng)用選擇培養(yǎng)基，使親本細(xì)胞死亡，而僅讓雜種細(xì)胞存活下來(lái)。為此，已先細(xì)胞死亡，而僅讓雜種細(xì)胞存活下來(lái)。為此，已先后利用親本細(xì)胞的藥物抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型和溫度敏后利用親本細(xì)胞的藥物抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型和溫度敏感性等遺傳標(biāo)記，建立了多種選擇系統(tǒng)，并已成功感性等遺傳標(biāo)記，建立了多種選擇系統(tǒng)，并已成功地用于雜種細(xì)胞的篩選。地用于雜種細(xì)胞的篩選。 由抗藥性細(xì)胞組成的雜種的篩選：由抗藥性細(xì)胞組成的雜種的篩選： Szybslski等（等（1962）在研究抗藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗嘌）在研究抗藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗嘌呤類似物呤類似物8-氮鳥嘌呤或氮鳥嘌呤或6-巰基鳥嘌呤突變型細(xì)胞缺乏巰基鳥嘌呤突變型細(xì)胞缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），而抗嘧啶類），而抗嘧啶類似物似物5-溴脫氧尿嘧啶突變型細(xì)胞缺乏胸腺嘧啶核苷溴脫氧尿嘧啶突變型細(xì)胞缺乏胸腺嘧啶核苷激酶激酶TK），它們均可為），它們均可為HAT培養(yǎng)基所殺死。在此培養(yǎng)基所殺死。在此基礎(chǔ)上，基礎(chǔ)上，Littlefield（1964）進(jìn)一步應(yīng)用）進(jìn)一步應(yīng)用HAT培養(yǎng)基