腫瘤基因檢測的解讀流程

1、腫瘤基因檢測的解讀流程從臨床進入基因檢測流程是入口，檢測結(jié)果結(jié)合臨床信息進行合理解讀是出口，這一入一出之間需經(jīng)歷檢測前臨床咨詢部分、實驗室部分、信息分析部分、臨床解讀部分共四個環(huán)節(jié)。其中的第四部分臨床解讀部分即是根據(jù)檢測結(jié)果、患者信息、醫(yī)生共識綜合判斷，臨床和遺傳咨詢有效銜接、充分溝通，最終出具臨床解讀報告。在做成臨床解讀報告之前，首先需要將解讀的各個環(huán)節(jié)進行明確，包括解讀的步驟流程，解讀的技術(shù)細(xì)節(jié)。這樣才有可能真正的做到解讀的規(guī)范化，使解讀過程有據(jù)可依，有章可循，才能出具一份好的臨床解讀報告，基因檢測才能更好的服務(wù)患者和臨床醫(yī)生。從大的框架講，基因檢測數(shù)據(jù)解讀可分為三個步驟：原始數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)

2、、基于數(shù)據(jù)庫的解讀與患者個體表征/臨床病例結(jié)合的解讀。1、讀懂原始數(shù)據(jù)將測序的原始序列數(shù)據(jù)（FASTQ）去除接頭及低質(zhì)量序列，經(jīng)BWA軟件比對至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人類基因組參考序列上，Picard去除重復(fù)序列，使用GATK檢測SNV與Indel變異，使用ANNOVAR進行變異注釋。最后獲得一份.vcf文件（圖1）。圖1 從測序的原始序列數(shù)據(jù)到vcf文件的流程一份vcf文件包含如下基本信息。Chr：變異所在的染色體Start：變異在染色體上的起始位置End：變異在染色體上的結(jié)束位置Ref：參考基因組的序列Alt：檢測樣本基因組的序列Func.r

3、efGene：變異所處參考基因的功能區(qū)（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此處的exonic特指外顯子編碼氨基酸區(qū)，不包括外顯子的UTR區(qū)）Gene.refGene：變異所處參考基因名稱（如果是基因間，則是兩側(cè)的基因）GeneDetail.refGene：非外顯子區(qū)處于特定轉(zhuǎn)錄本中的具體位置（如果是基因間，則是距離兩側(cè)的基因的距離）ExonicFunc.refGene：外顯子區(qū)的變異類型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stopl

4、oss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果這一欄是一個“.”的話，就說明該變異不在外顯子區(qū)AAChange.refGene：氨基酸水平的改變（同一個基因可能具有多個轉(zhuǎn)錄本，氨基酸改變的位置在不同的轉(zhuǎn)錄本中有可能不一樣）經(jīng)注釋后的vcf文件還會包含如下信息：CLINSIG：該變異在ClinVar數(shù)據(jù)庫中的臨床意義（Benign，Likely benign，Uncertain significance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-r

5、esponse）CLINDBN：該變異所引起的疾病名稱CLINACC：該變異的登記號和版本號（VariantAccession and Versions）CLINSDB：該變異所引起疾病所在數(shù)據(jù)庫名稱CLINSDB：該變異所引起疾病所在數(shù)據(jù)庫中的IDPopFreqMax：該變異人群中的最大等位基因頻率1000_All：該變異在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中的人群等位基因頻率1000_AFR：該變異在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中非洲人群的等位基因頻率1000_AMR：該變異在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中美國人群的等位基因頻率1000_EAS：該變異在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中東亞人群的等位基因頻率1000_EUR：該變

6、異在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中歐洲人群的等位基因頻率1000_SAS：該變異在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫中南亞人群的等位基因頻率Snp138：該變異在dbSNP數(shù)據(jù)庫中的IDCosmic70：該變異在癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫COSMIC中的IDESP6500siv2_ALL：該變異在美國國家心肺血液研究所的ESP6500數(shù)據(jù)庫中的人群等位基因頻率ESP6500siv2_AA：該變異在美國國家心肺血液研究所的ESP6500數(shù)據(jù)庫中的非洲裔人群等位基因頻率ESP6500siv2_EA：該變異在美國國家心肺血液研究所的ESP6500數(shù)據(jù)庫中的歐洲裔人群等位基因頻率ExAC_All：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中的人群等

7、位基因頻率ExAC_AFR：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中非洲人群的等位基因頻率ExAC_AMR：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中美國人群的等位基因頻率ExAC_EAS：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中東亞人群的等位基因頻率ExAC_FIN：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中芬蘭人群的等位基因頻率ExAC_NFE：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中非芬蘭歐洲人群的等位基因頻率ExAC_OTH：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中除已指定人群之外的人群等位基因頻率ExAC_SAS：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中南亞人群的等位基因頻率CG46：該變異在CG46數(shù)據(jù)庫中的人群等位基因頻率。CG46是由CompleteGenomics（BGI）公司對46個樣本

8、的全基因組測序而建立的數(shù)據(jù)庫，截止2017年，他們已經(jīng)對超過20000個樣本進行了全基因組測序和分析。ICGC_Id：國際癌癥基因協(xié)作組中各研究的IDICGC_Occurrence：該變異在ICGC數(shù)據(jù)庫中的發(fā)生情況。該欄數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)如COCA-CN|1|187|0.00535，指中國結(jié)直腸癌的研究（/），在187例患者中有1例發(fā)生突變，突變比例為0.00535Nci60：該變異在nci60數(shù)據(jù)庫中的等位基因頻率。Nci60是被廣泛用于藥物篩選的人類60種腫瘤細(xì)胞系組合，已經(jīng)進行了全外測序。隨著研究的進步，美國癌癥研究所NCI在2016年宣布NCI-60細(xì)胞系“退休”

9、，PDX新模型“上任”。Interpro_domain：InterPro算法預(yù)測的突變所處的保守結(jié)構(gòu)域（http:/www.ebi.ac.uk/interpro/）dbscSNV_ADA_SCORE：基于adaptive boosting預(yù)測變異對剪接位點改變的可能性dbscSNV_RF_SCORE：基于Random Forest預(yù)測變異對剪接位點改變的可能性。得分代表剪接影響的可能性大小，如果dbscSNV_ADA_SCORE和dbscSNV_RF_SCORE得分均小于0.6，則對剪接位點沒有影響（PMID: 28132688）。Omim_phenotype：在OMIM數(shù)據(jù)庫中該基因（不是該

10、變異）對應(yīng)的表型QUAL：測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算方法為Q = -10log10(e)，可衡量堿基未正確檢出的概率。FILTER：對變異位點做進一步的過濾。無論你用什么方法對變異位點進行過濾，過濾完了之后，在FILTER一欄都會留下過濾記錄，如果是通過了過濾標(biāo)準(zhǔn)，那么這些通過標(biāo)準(zhǔn)的好的變異位點的FILTER一欄就會注釋一個PASS，如果沒有通過過濾，就會在FILTER這一欄提示除了PASS的其他信息（other FILTER flag）。如果這一欄是一個“.”的話，就說明沒有進行過任何過濾INFO&FORMAT：該欄數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)GT:AD:AF:ALT_F1R2:ALT_F2R1:FOXOG:QSS:R

11、EF_F1R2:REF_F2R1。GT：基因型，對于一個二倍體生物，0表示跟REF一樣，1表示表示跟Alt一樣；2表示第二個Alt；AD：對應(yīng)兩個以逗號隔開的值，這兩個值分別表示覆蓋到REF和Alt堿基的reads數(shù)，相當(dāng)于支持REF和支持Alt的測序深度；AF：支持Alt的測序深度占總測序深度的比例，即等位基因豐度NORMAL：與腫瘤組織對應(yīng)的正常組織中的信息，一般通過外周血測序獲得TUMOR：腫瘤組織中的信息此外還可能包含各種算法對非同義突變保守性預(yù)測值，這些算法包括SIFT prediction(T: tolerated; D: deleterious)，PolyPhen HumanDi

12、v prediction (D:Probably damaging, P: possibly damaging; B: benign)、LTR、MutTaster、MutationAssessor、FATHMM、CADD、GERP+等等。2、分析挖掘數(shù)據(jù)對全外顯子檢測（或者屬于較大pannel范疇的情況也可以），可以進行腫瘤突變負(fù)荷（Tumor mutationburden）計算。臨床研究表明，使用PD1/PD-L1抑制劑等免疫治療藥物時，具有較高突變負(fù)荷的患者具有較好的客觀緩解率(ORR)、較長的無進展生存期(PFS)，同時持續(xù)臨床療效(DCB)也更佳。然而，由于目前沒有統(tǒng)一的腫瘤突變負(fù)荷計

13、算方法，在做縱向比較時需謹(jǐn)慎。該分析使用的計算方法為，腫瘤組織中突變豐度大于等于5%，正常組織中突變豐度小于等于1%，ExonicFunc.refGene一欄去除“.”、synonymous SNV、unknown標(biāo)簽的數(shù)據(jù)，PopFreqMax一欄去除人群等位基因頻率大于0.1%的數(shù)據(jù)（注意保留“.”）。此外，免疫治療相關(guān)的一些基因突變（如EGFR、干擾素信號通路的JAK、B2M等）值得關(guān)注。對全外顯子檢測，能夠發(fā)現(xiàn)大量的體細(xì)胞突變。有的突變是致病性的稱為為驅(qū)動突變或司機突變（與之對應(yīng)的稱為乘客突變或繼發(fā)性突變），這些突變或?qū)е翫NA修復(fù)缺陷，或?qū)е录?xì)胞不受調(diào)控的增殖生長，或?qū)е录?xì)胞不能正常

14、凋亡，或?qū)е录?xì)胞侵襲性增強，或?qū)е旅庖咛右?。因而從大量的體細(xì)胞突變中鑒定腫瘤的驅(qū)動基因突變既是基因檢測的重要目的之一，同時也是一項艱難的工作。一般來說一個腫瘤的發(fā)生其驅(qū)動基因突變的數(shù)目為0-8個，且他們不會分布于同一個關(guān)鍵的腫瘤相關(guān)信號通路中（比如BRAF和KRAS，比如APC和CTNNB1）或并行的兩個重要信號通路中（比如PIK3CA和KRAS）。一般來說原癌具有較為明顯突變熱點聚集傾向（比如KRAS和PIK3CA），而抑癌基因的突變位點較為分散（比如RB1和VHL）。對全外顯子檢測目前已經(jīng)在腫瘤中得到較為廣泛的應(yīng)用，如何高效尋找驅(qū)動基因突變急需指導(dǎo)和規(guī)范化的文件，但由于腫瘤細(xì)胞突變多為體細(xì)

15、胞突變，遺傳性突變領(lǐng)域的規(guī)范化文件（后面會具體講）難以照搬使用。因為體細(xì)胞突變的意義和遺傳性突變的意義比如致病性突變這樣的描述有所不同，比如我們可以采用響應(yīng)藥物的突變（responsive）、耐藥突變（resistant）、驅(qū)動性突變（driver）、繼發(fā)性突變（passenger）來描述突變的意義。值得慶幸的是，2017年伊始，分子病理協(xié)會（Association for Molecular Pathology, AMP）、美國臨床腫瘤協(xié)會（American Societyof Clinical Oncology）和美國病理學(xué)家聯(lián)盟（College ofAmerican Pathologis

16、ts）對高通量測序在腫瘤診療領(lǐng)域的應(yīng)用從突變記載（HGVS）、注釋解讀、報告進行了指導(dǎo)和規(guī)范（PMID: 27993330）。該指導(dǎo)規(guī)范中對參考序列數(shù)據(jù)庫（如NCBI）、人群基因頻率數(shù)據(jù)庫（如1000G、ExAC）、腫瘤數(shù)據(jù)庫（如COSMIC、ICGC）、疾病數(shù)據(jù)庫（如HGMD、ClinVar）、預(yù)測軟件（如PolyPhen2、Human Splicing Finder）的使用和注意事項給出了意見。該規(guī)范還推薦對腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞變異劃分為四個級別：具有確定性臨床意義的突變（variants with strong clinical significance，Level A和Level B）、可

17、能具有臨床意義的突變（variants with potential clinical significance，Level C和Level D）、臨床意義不明的突變（variants of unknown clinical significance）、良性或可能良性的突變（variants deemed benign or likely benign），并詳細(xì)闡述如何將檢測到突變結(jié)合數(shù)據(jù)庫以歸類到這四個級別中。其中具有確定性臨床意義/可能具有臨床意義的突變包括四個等級的證據(jù)：Level A：可作為預(yù)測藥物反應(yīng)或耐藥性的FDA批準(zhǔn)的針對特定類型腫瘤（適應(yīng)癥）的治療的突變；或者已經(jīng)被包括在專業(yè)指

18、南中（如腫瘤的NCCN）作為特定類型腫瘤的治療、診斷或預(yù)后的突變；Level B，可作為預(yù)測藥物反應(yīng)或耐藥性的基于充分研究和專家共識的治療的突變，或者是基于充分研究和專家共識的具有特定疾病診斷、預(yù)后意義的突變；Level C，可作為預(yù)測藥物反應(yīng)或耐藥性的FDA或?qū)I(yè)協(xié)會批準(zhǔn)的跨適應(yīng)癥的治療的突變，或者是已經(jīng)作為臨床試驗的入組參考標(biāo)準(zhǔn)，或者是基于多項研究的具有特定疾病診斷、預(yù)后意義的突變；Level D，基于臨床前研究、案例報道的可能具有臨床意義的突變；或者有研究表明該突變有助于疾病診斷和預(yù)后判斷。目前，尋找腫瘤驅(qū)動基因突變的具體策略可以說是多種多樣（圖2）。通過尋找熱點基因的熱點突變（recu

19、rrent mutation）是一種較為確定的策略，相關(guān)的研究證據(jù)較為充分。例如EGFR的突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個外顯子上（1821），目前發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30多種。缺失突變主要發(fā)生在外顯子19上，最常見的是del E746-A750，替代突變最常見的是發(fā)生在外顯子21上的L858R，復(fù)制或插入突變發(fā)生在外顯子20上。發(fā)生在外顯子20上的替代突變T790M為耐藥突變，研究還發(fā)現(xiàn)L858Q、D761Y、T854A等耐藥突變。HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌中主要突變方式是擴增或者表達上調(diào)，鮮有突變，在2030%的乳腺癌中存在HER2基因明顯擴增或過表達，但

20、是在肺癌中，其激活機制為擴增、過表達及點突變，點突變在肺癌中的發(fā)生概率約占2-4%，多發(fā)生在其激酶結(jié)構(gòu)域中，常見的激活性點突變包括p.S310, p.L755，p.G776L, p.V777L，p.S855I，p.N857S 等。BRAF V600E突變臨床意義在Pubmed中有上百遍報道。BRAF突變存在于1%3%的非小細(xì)胞肺癌中。V600E是最常見的腫瘤驅(qū)動突變，在肺癌中也有多種其他類型的BRAF突變被報道，包括G466V、G469A和D594G。盡管性藥物例如vemurafenib在包含BRAF V600E突變的黑色素瘤中高度有效，但這些藥物對BRAF其他位點突變，或者V600E突變肺癌

21、中的腫瘤驅(qū)動活性還需評估。圖2 鑒定驅(qū)動基因突變策略（PMID: 24479672）熱點基因的熱點突變在很多數(shù)據(jù)庫中有不完全的收錄，這些數(shù)據(jù)庫有Civic數(shù)據(jù)庫，OncoKB數(shù)據(jù)庫，Personalized cancer therapy數(shù)據(jù)庫，Clinical Knowledgebase數(shù)據(jù)庫等等。預(yù)測變異對蛋白質(zhì)功能的影響，可以作為尋找腫瘤驅(qū)動突變的一種有益補充方法。比較常見的預(yù)測工具如SIFT、PolyPhen2、MutationAssessor等等，這些算法的原理一般是基于氨基酸的進化保守性，有的考慮到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的功能（例如TP53蛋白的有害突變多位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域），還有的會考慮蛋

22、白的空間結(jié)構(gòu)。對于檢測到的變異各算法預(yù)測值在上述的vcf文件中可查閱。對于SIFT，值越小變異有害性的可能性越大，推薦閾值0.05；對于PolyPhen2，值越大變異有害性的可能性越大，推薦閾值0.3；對于MutationAssessor，值越大變異有害性的可能性越大，推薦閾值8，需要注意的是，不同的參考文獻閾值可能不同（PMID: 23819521）。將基因放在信號通路中分析，這對于不是十分常見的小眾腫瘤驅(qū)動基因?qū)ふ矣泻艽髱椭?。在美國，每年有大約18,000名患者被確診為腦膜瘤。它們約占原發(fā)性腦腫瘤的三分之一，女性患病比率高一倍。但是一直以來對于腦膜瘤的遺傳突變了解甚少。在一項研究中（PMI

23、D: 23334667），科學(xué)家們對17個腦膜瘤樣本進行了全基因組或是外顯子組測序。在這些腫瘤中發(fā)現(xiàn)改變基因后，研究人員隨后又對另外兩組腫瘤進行了測序。研究人員發(fā)現(xiàn)，相比大多數(shù)類型的腫瘤，腦膜瘤具有較少數(shù)量的遺傳改變或損傷。在一些腫瘤中，他們發(fā)現(xiàn)兩個在已知致癌信號通路中發(fā)揮作用的基因存在突變。在3個腫瘤中發(fā)現(xiàn)的SMO，是Hedgehog信號的成員。在5個腫瘤中發(fā)現(xiàn)了AKT1，該基因參與了與乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌相關(guān)的PI3K-AKT-mTOR信號。第6個腫瘤具有一個從前已知的，與mTOR信號通路相關(guān)的突變?？偟膩碚f，這些突變基因信號通路構(gòu)成了所研究的15%腦膜瘤的重要驅(qū)動子。對于遺傳性腫瘤，可

24、以借助遺傳病致病基因鑒定的方案，流程即1、了解臨床資料2、核心表型轉(zhuǎn)化為中文人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語(CHPO)3、基因檢測及其質(zhì)控4、生信分析5、遺傳學(xué)分析，包括關(guān)聯(lián)候選基因、遺傳變異位點分析解讀和家系驗證6、表型相似度分析。2013年ACGM推薦的與遺傳性腫瘤/遺傳病相關(guān)基因包括BRCA1、BRCA2、TP53、STK11、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、MUTYH、VHL、MEN1、RET、PTEN、RB1、SDHC、SDHD、TSC1、TSC2、WT1、NF2等（PMID：23788249）。查找正常對照組織突變豐度（N_Freq）40%，比對遺傳性腫瘤相關(guān)突變基因，是否有遺傳

25、性腫瘤相關(guān)胚系突變，查看并按照下述步驟進行確認(rèn)。按照基因名+c._或基因名+p._進行g(shù)oogle搜索或進入NCBI、HGMD、OMIM等網(wǎng)站查閱是否有相關(guān)致病性報道，按照ACMG指南進行位點致病性判定或可借助InterVar在線輔助判定（僅適用于exon范圍內(nèi)突變）。發(fā)現(xiàn)遺傳性腫瘤相關(guān)的基因突變，還應(yīng)推薦家族其他直系血親進行基因檢測做進一步的確認(rèn)。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American Collegeof Medical Genetics and Genomics, ACMG）和分子病理協(xié)會（Association forMolecular Pathology, AMP）在2015年

26、對臨床實驗室的基因檢測進行了指導(dǎo)和規(guī)范（PMID: 25741868）。該指導(dǎo)規(guī)范主要就是適用于孟德爾遺傳病相關(guān)基因變異或者是生殖系變異。指導(dǎo)規(guī)范推薦記載突變遵循統(tǒng)一的規(guī)范人類基因組變異協(xié)會（Human GenomeVariation Society, HGVS），并將變異根據(jù)人群基因頻率（population data）、軟件預(yù)測（computational data）和功能試驗（functional data）等參數(shù)分為五個級別：致病性突變（pathogenic）、可能致病性突變（likelypathogenic）、意義不明突變（uncertain significance）、可能良性突變（likely benign）和良性多態(tài)性突變（benign）。這五個級別如何認(rèn)定？該規(guī)范列出了致病性/可能致病的各種情況的支持證據(jù)，證據(jù)強度依次包括超強證據(jù)（PVS1）、強證據(jù)（PS1-4，注意這里的數(shù)字不代表證據(jù)強度的區(qū)別，僅表示同一證據(jù)強度的不同的證據(jù)情況，下同）、中度證據(jù)（P