豬瘟檢測與防治

1、重慶市高教自考本科畢業(yè)論文論文題目：豬瘟檢測與防治準考證號：5 姓名：普傳貴 指導(dǎo)教師姓名 彭潔 職稱 講師 考生單位 云南省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 郵 編 電話 專業(yè)名稱 畜牧獸醫(yī) 論文提交日期 2015年3月 論文答辯日期2013年4月 主考單位 重慶西南大學(xué) 二零一五年四月十日目錄摘要51.病原學(xué)特征52流行病學(xué)63.臨床癥狀64.病理變化75.豬瘟實驗室常規(guī)診斷技術(shù)85.1免疫熒光試驗免疫熒光試驗（FAT）85.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）95.3常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）105.4實時熒光定量PCR 技術(shù)115.4核酸探針技術(shù)核酸探針技術(shù)125.5

2、基因芯片檢測技術(shù)126.豬瘟的防治13參考文獻16 豬瘟檢測與防治 普傳貴摘要：豬瘟是威脅養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病，對于疫情嚴重的豬場，只有采取乳豬超前免疫，才能夠控制豬瘟的流行。豬瘟是威脅養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病，對于疫情嚴重的豬場，只有采取乳豬超前免疫，才能夠控制豬瘟的流行。關(guān)鍵詞：豬瘟 ；診斷；防治；豬瘟又稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科瘟毒病屬的豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染病。國際獸醫(yī)局將其列為A類16種法定傳染病之一，豬是該病毒唯一的自然宿主。急性病例呈敗血癥的臨診癥狀，剖檢可見內(nèi)臟器官出血、壞死和梗死。慢性經(jīng)過的病例，主要是纖維素性壞死性腸炎。常有副傷寒及巴氏桿菌病繼發(fā)

3、感染。1.病原學(xué)特征豬瘟病毒屬黃病毒科、瘟病毒屬。本病毒對外界環(huán)境的抵抗力較強，既能在冷凍條件下存活，也能在煙熏烤曬加工的肉品中存活；但不耐熱，僅部分毒株可抵抗56溫度。pH3.O或pH11.O可滅活；對乙醚、氯仿、 -丙烯內(nèi)脂敏感；能被2氫氧化鈉、1福爾馬林、碳酸鈉(4無水或10結(jié)晶碳酸鈉+01去污劑)、離子和無離子去污劑、含1碘伏的磷酸滅活。 2流行病學(xué)（1）從發(fā)病區(qū)域上看，多為養(yǎng)豬密集的專業(yè)村，小型個體養(yǎng)殖場，疫源常常是外引豬所致，發(fā)病后，表現(xiàn)癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)不及時或誤診，采取措施不當(dāng)。（2）從發(fā)病時間看，全年發(fā)病最高峰是春季的3-4月份，其次是秋季的8-10月份。（3）從發(fā)病年齡看，春

4、季以斷奶豬2060日齡多發(fā)。常常是引進豬未免或免后幾天即開始發(fā)病，全群癥狀不一，死亡不高。秋季發(fā)病豬年齡不一，育肥豬也可發(fā)病，多為混合感染。（4）從發(fā)病群體看，發(fā)病率主要在個體養(yǎng)殖戶和專業(yè)養(yǎng)殖村，疫源引進控制措施不當(dāng)，綜合防疫意識不強，使病毒得以擴散。其次為中 、小型混合型養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)密度大，隔離措施不到位。大型種豬場發(fā)病率較低，綜合防治能力大型種豬場發(fā)病率較低，綜合防治能力強，基本能控制豬瘟的發(fā)生。 3.臨床癥狀急性型：高熱稽留(4142)。食欲減退，偶爾嘔吐。嗜睡、擠堆。呼吸困難，咳嗽。結(jié)膜發(fā)炎，兩眼有膿性分泌物。全身皮膚黏膜廣泛性充血、出血。皮膚發(fā)紺，尤以肢體末端(耳、尾、四肢及口鼻部)

5、最顯著。先短暫便秘，排球狀帶黏液(膿血或假膜碎片)糞塊；后腹瀉排灰黃色稀糞。大多在感染后515天死亡，小豬病死率可達100。 亞急性型：多年來一些地區(qū)散發(fā)一種所謂“無名高熱”癥，經(jīng)研究證明多為豬瘟。因其潛伏期長，癥狀較輕不典型，病死率一般不超過50，抗菌藥物治療無效，稱為“溫和型”豬瘟。病豬呈短暫發(fā)熱(一般為4041，少數(shù)達41以上)，無明顯癥狀。母豬感染后長期帶毒，受胎率低、流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎或畸形胎；所生仔豬先天感染，死亡或成為僵豬。慢性型：體溫時高時低，呈弛張熱型。便秘或下痢交替，以下痢為主。皮膚發(fā)疹、結(jié)痂，耳、尾和肢端等壞死。病程長，可持續(xù)1月以上，病死率低，但很難完全恢復(fù)。不死的豬

6、，常成為僵豬。多見于流行中后期或豬瘟常發(fā)地區(qū)。 4.病理變化急性型：白細胞及血小板減少。全身性出血、淤血，尤以(耳根、頸部、胸腹下、四肢內(nèi)側(cè))皮膚、淋巴結(jié)、喉頭、膀胱、腎、回盲處明顯。脾不腫大，邊緣有暗紫色稍突出表面的出血性梗死，為豬瘟特征性病變，但一般不常見，僅5070病例出現(xiàn)梗死病變。常見全身淋巴結(jié)腫大、出血，切面周邊出血顯著，雜有貧血變化，呈紅白相間的大理石狀，多見于頜下、頸部和腹腔淋巴結(jié)。 慢性型：主要為壞死性腸炎，一般在回盲瓣口、盲腸及結(jié)腸黏膜上形成同心輪狀的紐扣狀潰瘍，突出于黏膜面，顏色黑褐,中央凹陷。通常無出血及炎性病變。全身性淋巴組織萎縮。仔豬常見胸腺萎縮，肋軟骨連接處外生骨疣

7、。5.豬瘟實驗室常規(guī)診斷技術(shù)5.1免疫熒光試驗免疫熒光試驗（FAT）豬瘟熒光抗體染色技術(shù)是將提純后的抗CSFV 抗體IgG 標記上熒光物質(zhì)，制成豬瘟熒光抗體染色試劑。用該試劑去著染豬病料（如病豬扁桃體、淋巴結(jié)、腎等）的冰凍切片或觸片，然后利用熒光顯微鏡觀察組織細胞內(nèi)是否有亮綠色熒光。如果被觀察的組織細胞內(nèi)有亮綠色熒光，就是豬瘟病毒熒光抗體染色陽性，說明被檢病料中有CSFV 感染。反之，被觀察的組織細胞內(nèi)沒有亮綠色熒光，就是豬瘟病毒抗體染色陰性。利用熒光抗體技術(shù)檢測病豬內(nèi)臟器官可能存在的CSFV，對CSF 的早期診斷具有十分重要的意義。豬瘟熒光抗體染色技術(shù)在CSFV 感染早期檢出率較高，不僅能檢

8、出強毒抗原，還能檢出低毒力病毒感染的帶毒母豬，豬瘟的常規(guī)診斷需要45 d，而該項技術(shù)可在12 h 內(nèi)作出判斷，既快速又客觀、準確，在規(guī)?；i場臨床上得到了廣泛應(yīng)用。所以目前許多規(guī)模化大豬場利用熒光抗體染色技術(shù)，有計劃地對豬場進行豬瘟凈化。Robert son 等首次將FA 運用于豬瘟病料和組織培養(yǎng)物的檢測。張淑霞等從抗豬瘟高免血清中提取IgG，標記熒光素（FITC），制備出了豬瘟熒光抗體（CSFV-FA）。該抗體能夠檢測人工感染豬扁桃體中的病毒抗原，而且這種熒光反應(yīng)能夠被抗CSF 高免血清特異性抑制。應(yīng)用CSFV-FA 可在病死豬的扁桃體、脾、腎、回腸末端等器官的觸片或冰凍組織切片中發(fā)現(xiàn)病毒抗

9、原，也可先將可疑病料經(jīng)無菌處理后接種于細胞培養(yǎng)物，隨后再用CSFV-FA 檢測出感染細胞中的豬瘟病毒抗原。FAT 法簡單、快速、可靠，許多國家將它作為執(zhí)行豬瘟消滅計劃的法定診斷試驗。15.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有高度敏感性和特異性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡單且無放射性危害，特別是商品試劑盒和自動化儀器的應(yīng)用，使其成為一種適用于各級檢驗部門的免疫標記技術(shù)。隨著檢驗醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，酶聯(lián)免疫測定的技術(shù)方法也得到發(fā)展和更新，Dot-ELISA、發(fā)光酶聯(lián)免疫測定、免疫印跡法、BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法都不斷得到應(yīng)用。周宗元等應(yīng)用豬瘟兔化弱毒PEG 沉淀抗原HRP-S

10、PA 建立了HRP-SPA-ELISA 檢測CSFV 抗體的方法，通過對5 份陰性血清和32 頭仔豬注射疫苗前后不同時期的256 份血清進行檢測，證明本法有較高的敏感性和特異性。余興龍等以在大腸桿菌中高效表達的CSFV 的E2 基因產(chǎn)物為抗原，以HRP 標記的的兔抗豬IgG 為二抗，建立了檢測CSFV 抗體的間接ELISA 方法，結(jié)果表明用E2 基因產(chǎn)物蛋白作為診斷豬瘟的抗原，具有特異性高、易純化和成本低等特點。陸芹章等（2004）制備了豬瘟單克隆抗體，以ACI-ELISA法檢測CSFV，并用PCR 方法作比較，結(jié)果表明30 份豬瘟陰、陽性病料的ACI-ELISA 試驗結(jié)果與PCR 檢測結(jié)果相

11、符本方法與動物接種、免疫熒光、血清中和等CSF 常規(guī)診斷方法比較，更加快速、準確、經(jīng)濟，且一次可檢測大量樣品，同時比PCR 方法耗時短、費用低，便于推廣。陳振海（2005）等以CSFV GST-Erns 融合蛋白作抗原進行間接ELISA，結(jié)果表明用該方法檢測CSFV 抗體具有很高的特異性和敏感性。目前，已有很多采用基于中和性單抗的競爭ELISA 方法來檢測某些病原中和抗體的報道，說明利用CSFV 中和性單抗作為競爭抗體檢測CSFV 中和抗體是可行的。梁冰冰等利用桿狀病毒表達豬瘟病毒（CSFV），以重組E2 蛋白作為包被抗原，辣根過氧化物酶標記的E2 蛋白中和性單克隆抗體作為競爭抗體，建立了一種

12、用于檢測CSFV 中和抗體的重組E2 蛋白競爭抑制ELISA（CI-ELISA）方法，該法操作簡便、快速，適于現(xiàn)場應(yīng)用，同時具有一般ELISA 的操作優(yōu)點，可以用于大量現(xiàn)場樣品的檢測和流行病學(xué)監(jiān)測。2.2 分子生物學(xué)診斷方法。55.3常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）成功測定了多株CSFV 的全基因序列，為豬瘟的致病機理、免疫機制、檢測防控提供了堅實的基礎(chǔ)。因為在臨床檢測中要經(jīng)常檢測RNA 病毒，而通常所用的PCR 試劑盒是DNA 聚合酶，不能以RNA 為模板直接擴增，故在進行PCR 前，先將病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所以建立了RT-

13、PCR 技術(shù)。隨著人們對CSFV 分子生物學(xué)研究的深入，尤其是對CSFV Alfort株和Bresica 株基因組全序列的成功測定，使得RT-PCR 技術(shù)在CSFV 的研究中被廣泛應(yīng)用。RT-PCR 作為檢測CSFV 的一種方法，其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好，操作也很簡單，整個過程在1 d 內(nèi)即可完成，能達到快速檢測的目的，并且適合于各種含毒材料的檢測，也可用于臨床。此外，RT -PCR 技術(shù)還可區(qū)別與CSFV 相關(guān)的病毒，如BVDV，以及能引起和CSF 相似臨床癥狀的豬病病毒，如亞洲CSFV、偽狂犬病病毒，其靈敏度可達100%。25.4實時熒光定量PCR 技術(shù)熒光定量PCR 技術(shù)是近年來發(fā)

14、展起來的一種核酸定量技術(shù)，因其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確等優(yōu)點成為核酸檢測中的重要工具。它是在常規(guī)PCR 引物之外加入一個兩端帶有熒光標記的寡核苷酸探針。該技術(shù)的研究也逐漸成為豬瘟診斷方法研究的方向。由于實時定量熒光PCR 儀可以同時檢測多種熒光，因此可以進行多重檢測，即在同一個反應(yīng)體系中，將不同探針標記上不同的熒光基團，這樣就可以同時檢測多種疾病的病原，這也是疫病診斷的一個研究方向。Risatti 等（2003，2005）建立了一種實時熒光定量RT-PCR 方法檢測CSFV，并與病毒分離作了比較，證明其敏感性高于病毒分離100%/72.4%），特異性略低于病毒分離（98.9% /

15、100%）。日本學(xué)者Ophuis 等（2006）應(yīng)用熒光定量RTPCR方法對攻毒豬各組織臟器中的病毒進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早在攻毒后1 d 就在扁桃體中檢測到了病毒的存在。Cho 等應(yīng)用不同熒光基團標記的兩條TaqMan-MG 探針建立了一種能鑒別韓國CSFV 野毒株和LOM 疫苗株的熒光RT-PCR 方法。35.4核酸探針技術(shù)核酸探針技術(shù)在分子標記的基礎(chǔ)上，以病毒RNA 基因組為模板制備探針，在cDNA 合成之后，進行Southern blot，特異的核酸探針會在不同病毒基因組cDNA 上產(chǎn)生特異的條帶。此方法具有特異性強、準確可靠的優(yōu)點，但診斷費用較高。此法可用于不同毒株的分離和鑒定。Cru

16、ciere 等、Dable 等、Colijn 等利用CSFV 基因組RNA 構(gòu)建cDNA，與BVDV 進行序列分析和比較，合成了6 個探針，按照它們在病毒基因組的位置，根據(jù)特異的雜交條帶可以區(qū)別CSFV、BVDV 和BDV。我國趙啟祖等研制了石門血毒P80 核酸探針，可對病毒RNA 進行定量檢測，靈敏度達220 pg。核酸探針技術(shù)有特異性強、準確可靠的優(yōu)點，但需要合成核酸探針，診斷費用較高。5.5基因芯片檢測技術(shù)基因芯片是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項高新技術(shù)，在基因表達譜、功能基因組、疾病基因診斷等基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中已經(jīng)顯示出重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。它被譽為又

17、一次生命科學(xué)領(lǐng)域的革命，世界各國爭相投入研究?；蛐酒侵冈谝粋€很小的表面，通常是硅化玻璃，覆蓋上成千上萬的寡核苷酸，每一個固定在芯片上的特定位置都可以找到這個點，每個寡核苷酸反應(yīng)芯片上有成千上萬的拷貝互補信息，包括cDNA 芯片、寡核苷酸芯片、基因組芯片，主要目標是用于DNA 序列的測定、病原檢測、基因表達譜鑒定、基因突變體的檢測分析，以及基因組的功能研究等?；蛐酒夹g(shù)為動物疾病診斷提供了新的技術(shù)理念，出現(xiàn)可以替代傳統(tǒng)方法的新技術(shù)，并形成新產(chǎn)品。目前，我國也正在研究應(yīng)用基因芯片檢測技術(shù)來診斷豬瘟，這將對我國豬瘟的防控具有深遠意義。6.豬瘟的防治（1）加強飼養(yǎng)管理加強飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生工作十分重

18、要，尤其是規(guī)?；i場，舍內(nèi)定期大消毒，糞肥指定地點生物熱處理，以減少豬瘟病的傳播機會。（2）制定合理的免役程序豬瘟預(yù)防主要是疫苗免疫接種。一是仔豬一出生就預(yù)防接種；二是滿月接種一次；三是春秋兩防要接受上門防疫員的補種一次；四是要做好疫苗儲藏、運輸、保管等工作，保證其生物學(xué)效價。操作時必須堅持嚴格消毒、一豬一針，確保注射有效。（3）加強豬瘟的免疫監(jiān)測進行免疫監(jiān)測，就是定期從免疫豬群中抽樣檢查苗豬的抗體產(chǎn)生是否達到保護水平。對注射疫苗后抗體產(chǎn)生達不到保護水平的豬仔應(yīng)及時補種，如補種后抗體水平仍上去的豬仔可以疑為先天感染或免疫耐受，應(yīng)堅決淘汰。（4）消滅傳染源豬瘟治療目前尚無特效藥，有些慢性豬瘟，豬

19、雖能長期存活，但生長速度極慢，也容易繼發(fā)其它疾病，還成為豬瘟的疫源，因此，凡確診為豬瘟和帶病毒的豬一律撲殺銷毀且深埋，嚴重的可做群體銷毀處理，避免加劇豬瘟的傳播。同時，應(yīng)嚴格消毒病豬場地和圈舍，并空圈3個月以上，在此期間，每20天進行一次嚴格的消毒，確保養(yǎng)殖環(huán)境的凈化和安全，獲得有效地防疫效果。（5）豬瘟的免疫接種，包括被動免疫和主動免疫，是當(dāng)前防制豬瘟的主要手段。被動免疫應(yīng)用高免血清，主動免疫則有疫苗。但因使用高免血清價高，且因應(yīng)用強毒，有造成散毒的危險，現(xiàn)已禁止使用。弱毒疫苗，產(chǎn)生免疫力快，且堅強而持久。關(guān)鍵是要選擇和培育出一株安全性穩(wěn)定、免疫性強的弱毒株。許多弱毒株仍保留一定程度的殘余致

20、病力，必須同時注射一定量的免疫血清以減輕其反應(yīng)。就全世界來說，豬瘟弱毒疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用。6 （6）豬瘟免疫程序 規(guī)模養(yǎng)豬場免疫：商品豬：2535日齡初免，6070日齡加強免疫一次。種豬：2535日齡初免，6070日齡加強免疫一次，以后每46個月免疫一次。散養(yǎng)豬免疫：每年春、秋兩季集中免疫，每月定期補免。緊急免疫：發(fā)生疫情時對疫區(qū)和受威脅地區(qū)所有健康豬進行一次強化免疫。最近1個月內(nèi)已免疫的豬可以不進行強化免疫。免疫效果監(jiān)測：免疫21天后，進行免疫效果監(jiān)測。豬瘟抗體阻斷ELISA檢測試驗抗體陽性判定為合格，豬瘟抗體正向間接血凝試驗抗體效價25判定為合格。存欄豬抗體合格率達到70%判定為合格。 （7

21、）豬瘟免疫劑量：仔豬加強免疫。仔豬4050日齡再打一次預(yù)防針，劑量為每頭豬23頭份。母豬配種前免疫。母豬配種前需要注射一次豬瘟疫苗，劑量為每頭豬23頭份。此時接種的關(guān)鍵是必須保證所有待配種母豬(后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬)都注射，且最好在配種前一周左右就注射。可使母豬在懷孕期有高度免疫來保護胎兒，同時還可以保證有較高的初奶抗體水平，使乳豬得到母源抗體保護。后備公豬和配種公豬按常規(guī)程序免疫。也就是作種用的公豬每年免疫一至二次(在春季或秋季注射疫苗)，劑量為每頭豬12頭份。商品豬整個飼養(yǎng)期預(yù)防接種2次。第一次在出生后吮吸母乳之前(稱超前免疫)免疫，接種兔化豬瘟弱毒苗，劑量為每頭豬12頭份。第二次在5560

22、日齡再接種34頭份凍干苗。應(yīng)注意不能在轉(zhuǎn)群時注射豬瘟疫苗，應(yīng)在轉(zhuǎn)群前10天或轉(zhuǎn)群后710天接種，以避免因轉(zhuǎn)群應(yīng)激而誘發(fā)豬瘟。7致謝!歷時將近兩個月的時間終于將這篇論文寫完，在論文寫作的過程中遇到了很多的困難和障礙，都在老師和同學(xué)們的幫助下度過了，尤其要感謝我的論文指導(dǎo)老師鄭錦玲老師，她對我進行了無私的指導(dǎo)和幫助。不厭其煩的幫助進行論文的修改和改進。在此向幫助和指導(dǎo)過起我的指導(dǎo)老師表示最衷心的感謝！ 感謝這篇論文所涉及到的各位學(xué)者，如果沒有各位學(xué)者的研究成果的幫助和啟發(fā)，我將很難完成本篇論文的寫作。 由于我學(xué)的知識水平有限，所寫論文難免有不足之處，懇請老師給予批評和指正！ 參考文獻1 何若鋼，張恒博，李秀寶，等. 熒光抗體技術(shù)在豬瘟凈化的應(yīng)用研究J.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008-9.2 俞伏松，車勇，江斌，等.PT-RCR和免疫熒光抗體試驗檢測豬瘟病毒的比較研究J.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2007-3.3 朱小甫，李曉成，陳德坤，等.豬瘟診斷技術(shù)研究進展J.中國動物檢疫，2007-2.4 楊曉梅，林毅，鄧小東，等.豬瘟 PPA-ELISA和DOT-ELISA檢測豬瘟抗體的比較及其應(yīng)用J.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000（增刊）. 5 陳龍賓，王愛華，蘇小庚，等.豬瘟病毒膠體金免疫層據(jù)檢測方法的建立及應(yīng)用J.中國獸醫(yī)科技，2007-6.6 楊林，趙德明，熊永忠.豬瘟診斷技術(shù)的研究進展J.畜