人真皮三維重建及仿生人工真皮研制

1、人真皮三維重建及仿生人工真皮研制背景:人類皮膚是由表皮層、真皮層和皮下組織組成的。皮膚厚度約為 1 到 4毫米, 約占了 15%的總體重。角質(zhì)層的厚度約為 10到 15微米。它位于表皮的最外層 ,阻止水分丟失以及 外來物質(zhì)入侵。毛囊、皮脂腺和汗腺是特殊化的表皮結(jié)構(gòu)。 它們主要位于真皮層和皮下組織 , 并且和表皮層相連。真皮層由細(xì)胞、纖維成分 （ 主要是膠原纖維和彈性纖維 ）, 以及大量基質(zhì)成分 組成。表皮和真皮層的交界是表皮 - 真皮連接。皮膚的組織成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)均對皮膚正常的功能非常重要。 真皮結(jié)構(gòu)的差異 性體現(xiàn)在不同的深度 （乳頭層（淺層真皮）; 網(wǎng)織層（深層真皮）, 以及真皮損傷與 否（

2、正常皮膚 ;瘢痕組織） 。膠原纖維和彈性纖維是真皮纖維結(jié)締組織的主要成分 , 并且與創(chuàng)面愈合、瘢 痕形成以及皮膚的生物力學(xué)特性密切相關(guān)。比如 , 膠原纖維束的厚度和方向在真 皮的淺層和深層 ,橫切面和縱切面 , 以及在正常真皮和瘢痕組織中均不同。彈性纖維直徑在瘢痕組織中明顯小于正常皮膚 : 淺層真皮中為 （0.54 0.04卩 mvs.1.08 0.04 卩 m）;深層真皮中為（1.16 0.02 卩 mvs.1.99 0.07 卩 m）。真 皮形態(tài)結(jié)構(gòu)也會影響皮膚的生物力學(xué)性能。但是,據(jù)我們所知 ,真皮結(jié)構(gòu)在毛囊附近和遠(yuǎn)離毛囊區(qū)是否不同尚未見報道。 組織工程皮膚是治療大面積皮膚缺損 , 提高

3、愈合后美觀效果的最有希望的方法之組織工程支架的物理特性 ,如支架組成成分、孔隙率、孔徑和孔壁厚度 ,直接 關(guān)系到支架的制作方法 , 并且顯著影響營養(yǎng)物質(zhì)滲透、生物力學(xué)性能、生物降解 性、細(xì)胞增殖和構(gòu)成。 與正常皮膚有相似的組成成分和微觀結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚 有望更能促進創(chuàng)面愈合。因此, 進一步了解皮膚微觀結(jié)構(gòu)會有利于制作下一代效果更好的組織工程皮 膚。在第一部分研究中 , 我們利用連續(xù)組織切片完成了人真皮中膠原纖維和彈性 纖維的三維重建 , 并且定量分析了毛囊和真皮深度對纖維分布的影響。本論文中提到的膠原纖維特指 I 型膠原纖維。我們還利用 micro-CT(micro-computed tom

4、ography) 測量了人脫細(xì)胞真皮 ADM(acellular dermal matrix) 孔隙率、孔徑和孔壁厚度。組織工程支架的結(jié)構(gòu)顯著影響組織的性能和接種細(xì)胞的活性。 目前真皮支架 傾向于設(shè)計成具有均一孔徑的均勻結(jié)構(gòu)。然而,根據(jù)我們第一部分研究結(jié)果 ,在不同深度 ,人真皮纖維空隙和纖維結(jié)構(gòu) 都不是均勻的。在第二部分研究中 , 我們制作了一種含成纖維細(xì)胞的、具有不同 孔徑梯度和三層結(jié)構(gòu)的仿生真皮支架。該支架模仿了人真皮的天然結(jié)構(gòu)(類似于“ sandwich ”結(jié)構(gòu))：外層具有較大 的孔徑 , 中間層具有較小的孔徑。 組織學(xué)實驗和 westernblotting 證實了 , 該仿生 真皮支

5、架通過促進肉芽組織生成和上皮化 , 進而顯著促進了創(chuàng)面愈合。我們的結(jié)果提示，該具有梯度孔徑和“ sandwich”結(jié)構(gòu)的含細(xì)胞的仿生真皮 支架有望用于組織工程真皮構(gòu)建。在第三部分研究中 , 我們試圖制作一種能夠促 進血管化的人工真皮。因為，“sandwich”人工真皮并沒有顯著促進血管生成。為了解決“sandwich” 人工真皮難以促進血管生成的問題 , 我們創(chuàng)新性的用一個簡便的方法 , 制作了含 血管活性腸肽微膠囊的聚己內(nèi)酯 (polycaprolactone,pcl) 納米纖維膜。血管活性腸肽 (vasoactiveintestinalpeptide,vip) 據(jù)報道可促進血管生成。 靜電

6、紡絲技術(shù)制備的納米纖維膜也可作為理想的創(chuàng)面敷料。根據(jù)以上材料的生物學(xué)特性 , 我們首先把多巴胺 (dopamine,da) 包被在納米 纖維表面 , 然后利用有強吸附能力的多巴胺吸附血管活性腸肽 (vip) 。隨后 ,pcl 納米纖維膜浸泡于丙酮中 , 包裹血管活性腸肽的微膠囊隨即在原位生成。我們用高效液相色譜法測量得到了包封率 (encapsulationefficiency) 是 (31.8 2.2)%, 載藥率 (loadingcapacity) 是(1.71 0.16)%。多肽釋放實驗提示 血管活性腸肽的釋放時間顯著延長。激光掃描共聚焦顯微鏡 (laserscanningconfoca

7、lmicroscope) 、掃描電鏡 (scanningelectronmicroscope) 以及細(xì)胞增殖檢測 (cellcountingkit-8proliferationassays) 顯示細(xì)胞的粘附和增殖均顯著提高。 該可控性釋放血管活性腸肽的 pcl-da-vip 納米纖維膜有望用于創(chuàng)面處理和血管 組織再生。目標(biāo): 該研究的其中一個目的是獲得人真皮天然結(jié)構(gòu)信息。另一個目的是,利用獲得的天然結(jié)構(gòu)信息 , 制作仿生人工真皮。第一部分人真皮顯微三維結(jié)構(gòu)研究方法 :1. 通過連續(xù)切片、圖像配準(zhǔn)、圖像 分割, 三維成形和三維可視化重建人真皮顯微三維結(jié)構(gòu) ;2. 通過“分區(qū)法”研究真 皮不同分區(qū)

8、的纖維分布差異 ; 根據(jù)距離毛囊遠(yuǎn)近分區(qū) :靠近毛囊區(qū) (closetohairfollicles,c-hf) 和遠(yuǎn)離毛囊區(qū)(farawayfromhairfollicles,f-hf); 根據(jù)真皮深度分區(qū) : 從淺層真皮到深層真皮( 從乳頭層到網(wǎng)織層 );3. 通過 micro-ct 測量人脫細(xì)胞真皮 (adm) 的孔隙率、孔徑、 孔壁厚度。結(jié)果 :1. 獲得了人真皮顯微結(jié)構(gòu)三維重建立體圖 ;2. 獲得人真皮主要成 分空間分布規(guī)律 :彈性纖維在靠近毛囊區(qū)明顯低于遠(yuǎn)離毛囊區(qū) ; 膠原纖維和彈性 纖維在真皮深層和淺層的含量均明顯低于真皮中間層。3.獲得人真皮的孔隙率、孔徑、孔壁厚度 : 人真皮的

9、孔隙率是 68.3%;平均孔 徑是131.2卩m,中位孔徑是95卩m;平均孔壁厚度是207.2卩m第二部分基于人 真皮顯微三維立體圖的“ sandwich ”結(jié)構(gòu)仿生真皮支架的制備 , 及其在創(chuàng)面愈合 中的作用。方法:1. 不同孔徑膠原支架的制備 ,支架孔徑測量和微觀結(jié)構(gòu)觀察 ,支架體外 生物降解性能測試 ;2. 單層人工真皮支架的生物學(xué)功能實驗 :體外實驗 :培養(yǎng)和接 種小鼠成纖維細(xì)胞 ; 細(xì)胞在支架中分布的研究 ; 細(xì)胞增殖效率測定。體內(nèi)實驗 :含 細(xì)胞的單層人工支架在體研究。3. 三層人工真皮支架的生物學(xué)功能實驗 : 體外實驗 :培養(yǎng)和接種小鼠成纖維 細(xì)胞,細(xì)胞在支架中分布研究 ,細(xì)胞增

10、殖效率測定 ;體內(nèi)實驗:含細(xì)胞的三層人工 真皮制備,含細(xì)胞的三層人工真皮在體研究,創(chuàng)面愈合測量，h&e染色和masson染 色, 免疫組織化學(xué)研究 ,westernblotting 研究。結(jié)果 :1. 單層人工真皮支架 :(1) 孔徑對于支架體外生物降解的影響 :孔徑越小,抗膠原酶降解能力越強 ;(2) 孔徑 對于體外細(xì)胞粘附和增殖的影響 :較小孔徑支架細(xì)胞接種效率更高 ,但是較大孔 徑更利于細(xì)胞增殖 ;(3) 孔徑對于體內(nèi)創(chuàng)面愈合的影響 : 不同孔徑的單層支架對創(chuàng) 面愈合未檢測到顯著差異。2. 三層人工真皮支架 :(1) 三層人工支架對于體外細(xì)胞粘附和增殖的影響 : 較 小孔徑的三層支架細(xì)胞

11、接種效率更高 , 但是細(xì)胞增殖未檢測到顯著差異。 (2) 三層 人工支架對于體內(nèi)創(chuàng)面愈合的影響：“ san dwich ”人工真皮支架顯著促進了創(chuàng)面 愈合。第三部分可控性釋放血管活性腸肽的聚己內(nèi)酯 (pcl-da-vip) 納米纖維膜的 制備及其生物學(xué)功效的體外實驗研究方法 :1. 聚己內(nèi)酯 (pcl-da-vip) 納米纖維膜 的制備和材料特性 ; 通過高效液相色譜儀檢測載藥率 (loadingcapacity(lc) 、包 圭寸率(encapsulationefficiency(ee)和體外血管活性腸肽釋放曲線。2.體外實驗: 通過細(xì)胞增殖檢測試劑盒 (cck-8), 檢測 pcl-da-

12、vip 納米纖維膜對進體外培 養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:1. 聚己內(nèi)酯 (pcl-da-vip) 納米纖維膜的制備和材料特性 :(1) 隨著丙酮 處理時間的增加 ,生成的微膠囊的直徑逐漸降低 : 在用丙酮處理后 10 分鐘、1小 時、6小時，分別在纖維膜內(nèi)部生成了直徑為(2.4 0.7)卩m,(1.1 0.3)卩m和 (0.5 0.1)卩m的微膠囊;(2)高效液相色譜儀檢測到血管活性腸肽的包封率為 31.8%,載藥率為 1.71%;(3) 原位產(chǎn)生的血管活性腸肽微膠囊顯著延長了 vip 的釋 放:未經(jīng)丙酮處理不含有微球的pcl-da-vip 納米膜,其vip的釋放量顯著高于其 他組。 (

13、4) 如果不利用多巴胺的強粘附作用 ,vip 難以直接結(jié)合到纖維膜表面 : 帶 有微球的pcl-vip納米膜(不經(jīng)過da的處理，讓vip直接粘附在pcl膜),其vip 的釋放量明顯少于其它組。2.體外實驗：聚己內(nèi)酯(pcl-da-vip)納米纖維膜，顯著促進體外細(xì)胞增殖：在細(xì)胞接種后培養(yǎng)的第7天,pcl-da-vip 納米膜組細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他組。結(jié)論： 本研究中，我們獲得了人真皮主要纖維成分(膠原纖維和彈性纖維)的3d重建結(jié) 構(gòu)圖。根據(jù)此結(jié)構(gòu)信息，我們制作了“ sandwich ”結(jié)構(gòu)的仿生真皮支架并研究其生 物學(xué)功效。同時針對部分慢性創(chuàng)面血管生成障礙的病理因素 , 設(shè)計制備了可控性 釋放

14、血管活性腸肽的聚己內(nèi)酯 （pcl-da-vip） 納米纖維膜 , 并研究其生物學(xué)功效我們獲得了以下信息 :1 、人天然真皮中的纖維分布規(guī)律 , 以及制備仿生真皮 支架所需要的部分參數(shù)。 （1） 人真皮中 , 靠近表皮的部分 （淺層）和靠近皮下組織的 部分（ 深層） 比真皮中間部分 （中層）含有更少的膠原纖維和彈性纖維 ;（2） 膠原纖 維和彈性纖維所占人真皮的比例分別是28.96%和 8.06%;（3）Micro-CT 測量得到的,人真皮的孔隙率是68.3%;平均孔徑是131.2卩m,中位孔徑是95卩m;平均孔壁 厚度是207.2卩m。2、人工真皮支架對細(xì)胞生物學(xué)行為和創(chuàng)面愈合的影響。 （1）

15、 不同孔徑的單層支架：孔徑越小，抗膠原酶降解能力越強；較小孔徑（87.7卩m）支架細(xì)胞接種效率 更高，但是較大孔徑（166.9卩m）更利于細(xì)胞增殖；不同孔徑（166.9卩m,120.4卩 m,87,7卩m）的單層支架對創(chuàng)面愈合未檢測到顯著差異。不同孔徑組合的三層支架：較小孔徑的三層支架（87.7/87.7/87.7卩m）細(xì) 胞接種效率更高，但是細(xì)胞增殖未檢測到顯著差異；“Sandwich”仿生結(jié)構(gòu)的三層 膠原支架顯著促進了創(chuàng)面愈合。3、我們報告了一種創(chuàng)新的簡便方法制備含有血管活性腸肽（VIP）微膠囊的聚己內(nèi)酯（PCL）納米纖維膜（PCL-DA-VIP）;結(jié)論顯示： 可控性釋放血管活性腸肽的PCL-DA-VIP納米纖維膜，顯著促進體外細(xì)胞增殖?？偨Y(jié):首先,我們獲得了人真皮主要纖維成分（膠原纖維和彈性纖維）的3D重 建結(jié)構(gòu)圖。然后，根據(jù)獲得的結(jié)構(gòu)信息，制作了“ Sandwich”仿生人工真皮。實驗證明 , 模仿天然真