外周血染色體標(biāo)本制作

.,人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析MetaphaseChromosomePreparationandAnalysisofKaryotype,.,一、實驗?zāi)康?.熟悉人類外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法。2.熟悉人類染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析。,.,二、實驗原理,染色體是在顯微鏡下可見細(xì)胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。因此，必須獲得染色體標(biāo)本才能進(jìn)行檢查分析，通常情況下，都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行核型分析。正常情況下，人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，使其恢復(fù)增殖能力。,.,二、實驗原理,因此，可采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時細(xì)胞進(jìn)入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋帶，表明每條染色體的特征。,.,在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，為了使細(xì)胞質(zhì)透明，離解胞間層，使組織軟化，且使染色體彼此鋪展開而又能清楚地顯示縊痕，往往需要對正在分裂或已經(jīng)收獲的細(xì)胞作一系列預(yù)處理。有時，在對細(xì)胞進(jìn)行固定的時候，為了使固定劑迅速滲透到組織中，以便于研究染色體的特殊結(jié)構(gòu)，也需要作預(yù)處理；其目的是使細(xì)胞的核外條件及染色體本身的狀態(tài)更適于分析和研究的需要。在細(xì)胞培養(yǎng)（培養(yǎng)基中加有PHA）后72小時，合成DNA的細(xì)胞占總數(shù)的45，有絲分裂的速率相當(dāng)于每小時1%，被激活的淋巴細(xì)胞占總數(shù)的90%，是收獲分裂期細(xì)胞、制備染色體標(biāo)本的最佳時期。,.,從收獲到制片需經(jīng)過加紡錘體抑制劑、低滲處理、固定、滴片等幾個主要環(huán)節(jié)，現(xiàn)將各步驟的原理、所用試劑及相關(guān)注意事項詳述如下。,.,1.紡錘體抑制劑,1.1基本原理和機制使染色體散開并清楚地呈現(xiàn)次縊痕，憑借的原理是改變細(xì)胞質(zhì)的粘度。因為在細(xì)胞分裂時，隨著紡錘體的形成，染色體緊靠在一起，很難進(jìn)行分析。紡錘體的形成取決于細(xì)胞質(zhì)和紡錘體成分的粘度之間的平衡。因此，改變細(xì)胞質(zhì)的粘度就能破壞紡錘體，使染色體依然呈游離狀態(tài)，或者更確切地說，染色體不再粘附至細(xì)胞內(nèi)的任何結(jié)合力上。所以在隨后制作標(biāo)本時一旦受到壓力，染色體就很易鋪展開來。同時，由于染色體的不同區(qū)段上水合作用的能力不一，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)的粘度發(fā)生變化時，就會使縊痕區(qū)顯示得更為清楚。,.,1.紡錘體抑制劑,細(xì)胞分裂中紡錘體是由微管組成的。微管管壁由13條原絲縱向平行排列構(gòu)成，主要成分為微管蛋白，而微管蛋白分微管蛋白和微管蛋白兩種。微管蛋白和微管蛋白組成的異二聚體構(gòu)成微管亞單位，若干個異二聚體相接連成原絲。微管蛋白與微管蛋白在化學(xué)結(jié)構(gòu)上極為相似，兩者42%序列相同。其中微管蛋白肽鏈中第201位為半胱氨酸，為秋水仙素結(jié)合部位。如果結(jié)合的部位被其結(jié)合，微管不僅不能繼續(xù)聚合，而且會引起原有微管解聚。,.,故秋水仙素具有干擾微管裝配，破壞紡錘體形成和終止細(xì)胞分裂的作用。以秋水仙素為代表的紡錘體抑制劑能引起有絲分裂過程中紡錘絲斷裂或抑制紡錘體的形成，但不影響染色體的復(fù)制和著絲粒的分裂使正在分裂的細(xì)胞停留在中期，以獲得大量分裂相供分析之用。秋水仙素積累分裂中期的作用，幾乎對所有植物器官和許多動物的器官都是十分有效的。,1.紡錘體抑制劑,.,1.2主要的紡錘體抑制劑及其作用特點秋水仙素秋水仙素（colchicine）是一種生物堿，因最初從百合科植物秋水仙（Colchicumautumnale）中提取出來，故名。分子式C22H25O6N。純秋水仙素呈黃色針狀結(jié)晶，熔點157。易溶于水、乙醇和氯仿，難溶于熱水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。這種由秋水仙素引起的不正常分裂，稱為秋水仙素有絲分裂（C-mitosis）。在這樣的有絲分裂中，染色體雖然縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成兩個子細(xì)胞，因而使染色體加倍。,1.紡錘體抑制劑,.,秋水仙素的作用與其濃度和作用時間相關(guān)，在高濃度時可以延緩著絲點分裂，低濃度時則抑制細(xì)胞紡錘體的形成。在秋水仙素作用下，染色單體縮短，著色變深以致外形清晰。但不同染色體縮短的程度不一，長的染色體比短的染色體濃縮得更明顯些。從能收集到足夠的中期細(xì)胞考慮，秋水仙素處理的時間宜長些，所用的濃度宜高些；但從能得到較為細(xì)長的染色體考慮，處理的時間宜短，所用的濃度宜低。因而秋水仙素處理的方法應(yīng)同時兼顧這二個方面。如果處理的時間太短則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少；與此相反，如果處理的時間太長分裂細(xì)胞雖多，但染色體縮得太短，以致形態(tài)模糊，就難以獲得優(yōu)良的顯帶標(biāo)本。,.,與其它預(yù)處理化學(xué)物相比較秋水仙素的另一個優(yōu)點是，在廣泛的溫度范圍內(nèi)都是有活性的。在熱帶地區(qū)的夏季，那怕氣溫高達(dá)43.3，對秋水仙素的活性也無顯著影響，有人將秋水仙素加入保存在8-9的組織中，發(fā)現(xiàn)中期細(xì)胞的數(shù)目比保存在室溫但未加秋水仙素的組織要多得多，而且染色體的結(jié)構(gòu)也很清楚。乙酰甲基秋水仙堿是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的功能跟秋水仙素一樣但對細(xì)胞的毒害作用只有秋水仙素的1/30一1/40。4-610-6的濃度即可得到所希望的效應(yīng)。除了秋水仙素以外，另一些化學(xué)物也可作為紡錘體抑制劑。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸長春花堿等，它們在人體細(xì)胞均可產(chǎn)生良好效果。,.,1.3處理過程培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20g/ml的秋水仙素0.050.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最終濃度為0.40.8g/ml，置5%CO2、37C0.5C培養(yǎng)箱中處理24h。,.,1.4注意事項應(yīng)當(dāng)注意的是經(jīng)秋水仙素處理后的細(xì)胞雖可用各種不同的固定液(金屬固定液或非金屬固定液)予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素從組織或細(xì)胞上沖洗掉，否則沉積在細(xì)胞表面的秋水仙素不僅會影響染色體的形態(tài)，而且還會阻礙固定液的穿透性。為此，在低滲處理后，應(yīng)盡早地加快速穿透液，如甲醇-冰醋酸固定液。要不然在固定的時候，細(xì)胞核仍可能進(jìn)入代謝期。,.,2.低滲溶液,經(jīng)過秋水仙素處理后，細(xì)胞內(nèi)的染色體比較適合于觀察了，但還是不能滿足要求。因為人類細(xì)胞的染色體數(shù)目多，形狀小，最大的染色體約7-8微米，加之主要的觀察與分析均在油鏡下進(jìn)行，這就要求標(biāo)本中的染色體彼此散開，并且盡可能處于同一平面上。這些均有賴于低滲處理。,.,2.1基本原理和機制1965年，徐道覺發(fā)現(xiàn)未作低滲處理時，伴隨染色體的一些零亂的物質(zhì)類似于核糖核蛋白體的顆粒，顯然是有絲分裂中核仁崩潰時的殘存物。而低滲處理后，這些物質(zhì)就消失了。可見，低滲處理不只是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，而且還可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開，這樣就能看清楚每一個扭曲的染色體?，F(xiàn)在知道，覆蓋在染色體上的核仁物質(zhì)大大地阻礙著染色體的分散。,.,2.2主要的低滲液低滲溶液是指滲透壓和離子強度均低的溶液?？梢允撬?、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀(0.65mol/L)、氯化鉀(0.075mol/L)、稀釋的平衡鹽溶液或培養(yǎng)基。處理時間一般為8-40分鐘，處理時的溫度為23-37。在早期的一些研究中，大多用檸檬酸鈉或檸檬酸鉀作為低滲液。也有些學(xué)者主張用稀釋的人血清，認(rèn)為這樣可使染色體的形態(tài)特征更為清晰。自1965年后，人們改用KCl為低滲掖。其優(yōu)點是染色體的輪廓清楚，可染色性增強，染色時間短。在相差顯微鏡下觀察KCl低滲處理標(biāo)本的效果比其它低滲液更好些，也適合于顯微分光光度分析，當(dāng)用顯帶染色時能充分顯示帶型的特點。KCl的濃度以0.075molL為宜，但不同組織所需的處理時間未必相同。,.,2.3低滲處理過程秋水仙素處理2-4小時后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用滴管將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到10ml離心管并置離心機內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心10min。離心后用滴管吸棄上清液，培養(yǎng)物沉積在管底。然后加入37溫育的低滲液8毫升，用滴管吹打成單個細(xì)胞懸液，置37C水浴處理20-30min，使紅細(xì)胞破碎，白細(xì)胞膨脹。,.,2.4影響低滲效果的因素影響低滲處理的效果是以下三個因素：低滲溶液的化學(xué)組成、低滲的強度和處理的時間。處理時間太短則染色體鋪展不好，處理時間過長會引起細(xì)胞破裂甚至由于染色體脹得太大而致形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊。因此，在實際操作中，對某一種組織究竟應(yīng)選用哪一種低滲溶液，需事先進(jìn)行預(yù)試驗。,.,3.固定,固定是組織、細(xì)胞或其成分選擇性地固定于某一特定階段的過程。其目的是殺死細(xì)胞但又要避免所研究的成分受到破壞。不同物種對固定劑的反應(yīng)是不一的，哺乳類動物染色體的固定尤其需要特定的方法，這是因為每種生物的細(xì)胞質(zhì)成分彼此各異的緣故。生物類型本身的復(fù)雜性及多細(xì)胞生物中細(xì)胞內(nèi)的變化較大，以致很難在細(xì)胞水平上分析固定的效應(yīng)。,.,3.1基本原理與機制用于固定的化學(xué)物對細(xì)胞都具有殺死作用，這類化學(xué)物可分成二大類：一類能使染色體固縮，或使核酸和蛋白質(zhì)纖絲相脫離，另一類則可維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性。為使染色體結(jié)構(gòu)不受破壞，提高染色體的可見性及嗜堿性，就需要使染色質(zhì)物質(zhì)沉淀。在活體條件下，細(xì)胞內(nèi)不同成分之間的相差并不足以使它們成為一種明顯的單位。可是隨著蛋白質(zhì)的凝結(jié)和沉淀，染色體的折射系數(shù)將發(fā)生很大的變化從而使它們在細(xì)胞內(nèi)成為明顯的小體。正因為如此，迄今所用的固定劑都具有交鏈蛋白質(zhì)的特性，都能使染色質(zhì)沉淀。盡管常用的染色體固定劑往往是數(shù)種化學(xué)物的混合物，但其中至少有一種化學(xué)物必須具備這一特性。,.,固定劑的另一重要特性是能迅速地穿透組織或細(xì)胞，并在一瞬間內(nèi)殺死它們，這樣方能使正在分裂的細(xì)胞立即阻留在各自的時相上。瞬間殺死是很重要的，否則核分裂仍可繼續(xù)下去并到達(dá)所謂的“休止相”或“代謝相”，那就無從研究染色體了。,.,可是，隨著細(xì)胞的死亡而出現(xiàn)的另一些變化(特別是蛋白質(zhì)的自溶作用)，往往會破壞染色體的原來結(jié)構(gòu)。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的酶參與蛋白質(zhì)的合成，而當(dāng)細(xì)胞死亡時，由于介質(zhì)變?yōu)樗嵝裕@些酶便在相反方向起作用，即使復(fù)合蛋白質(zhì)裂解為簡單的氨基酸。因為多肽是染色體的主要成分之一，所以這種變性效應(yīng)最終將引起染色體結(jié)構(gòu)的破壞。因此，作為一種固定劑也應(yīng)能防止蛋白質(zhì)的自溶作用。此外，在細(xì)胞致死的同時，細(xì)菌的活動致使細(xì)胞內(nèi)成分的分解。因此一種好的固定劑應(yīng)當(dāng)既能起到防腐作用，又能阻止細(xì)菌的分解作用。,.,最后，理想的固定劑還應(yīng)能有助于達(dá)到優(yōu)良的染色效果，即能增強染色體的嗜堿性。例如，甲醛雖具有優(yōu)良固定劑的其它所有特性，但卻會降低染色體的嗜堿性，所以不能單獨用作染色體的固定劑。顯而易見，沒有哪一種化學(xué)物能同時具備以上這些條件，因而通常是將數(shù)種可以共存的液體混合起來，使之成為染色體研究中真正有效的固定劑。盡管如此，那怕是最佳固定劑仍難免有不足之處。首先，細(xì)胞被殺死后發(fā)生的基本變化很難予以避免；其次，可能會抽提出一些彌散成分；最后即使操作十分謹(jǐn)慎，仍難以保持酶活性不變；此外，某些化學(xué)物還會導(dǎo)致細(xì)胞的皺縮。,.,細(xì)胞的膨脹和染色體的皺縮是決定固定劑質(zhì)量的兩個重要因素。以往曾認(rèn)為滲透壓是促使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)膨脹或破壞的決定性因索，為此選用等滲液作為固定劑，其實這種看法是不正確的。事實證明，稀釋的醋酸具有20個大氣壓，照?？墒辜?xì)胞和組織膨脹，而只有2.5個大氣壓的苦味酸卻可使組織大大地收縮。這提示一種固定劑的效果如何與滲透壓的關(guān)系很小。另一方面，苦味酸使蛋白質(zhì)沉淀的作用很強而醋酸卻沒有這一作用?？梢姡沟鞍踪|(zhì)沉淀這一特性在導(dǎo)致染色體收縮方面可能起重要作用。因此，在選用哪些化學(xué)物作為固定劑時，需要權(quán)衡以上這些因素。,.,用作固定劑的化學(xué)物有非金屬和金屬兩類。前者如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如鉻酸、鋨酸、氯化鉑、氯化汞、硝酸鈾等。其中有幾種化學(xué)物還可作為蒸氣固定劑，也即在接觸水或其它溶劑之前使可溶性物質(zhì)先轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，這樣就可在原位制作標(biāo)本。在細(xì)胞化學(xué)研究上，大多數(shù)非金屬固定劑(除甲醛外)比之于金屬固定劑有一優(yōu)點是，在固定之后無需在水中沖洗標(biāo)本。,.,3.2固定液的種類醋酸作為混合固定液的一種成分，醋酸的優(yōu)點在于：（1）可以與已知的任何一種固定劑同時使用，并且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（2）濃度可以很低（1%）也可以很高（99%）；（3）具有很強的穿透性能，比乙醇的穿透性還高。醋酸能使核酸沉淀使組蛋白溶解，但卻不能固定細(xì)胞質(zhì)蛋白。在染色體結(jié)構(gòu)的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色體收縮，使染色體的結(jié)構(gòu)免于被破壞。經(jīng)醋酸固定的物質(zhì)還能抵銷乙醇的硬化作用。,.,醋酸是染色體的一種理想的固定劑，它可使染色體結(jié)構(gòu)保持完整，且多半不致破壞核蛋白。這種固定劑的一個缺點是會導(dǎo)致染色體片段的過分膨脹，因此如果要研究染色體的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，必須把它與乙醇或類似的化學(xué)物一道使用，后者能使組織收縮和硬化。在研究減數(shù)分裂的染色體時，如果目的是了解染色體的行為，而不是其結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，用醋酸作為固定劑當(dāng)然是十分恰當(dāng)?shù)?。在分析粗線期的染色體時要求染色體的細(xì)節(jié)清晰，醋酸也不愧是一種理想的固定劑。此外，醋酸還是苯胺類染料的一種優(yōu)良溶劑。正因為具有這一特性，它是染料和固定液混合物中必需的一種成分，例如醋酸洋紅、醋酸奧辛和醋酸間苯二酚藍(lán)等。,.,甲醇在植物染色體研究中極少應(yīng)用，可是卻廣泛地用于動物染色體的固定。甲醇是從木材分解蒸餾制得的，是焦木酸的一種成分。雖然乙醇會使染色體收縮得很厲害，而甲醇卻可使染色體膨脹。在制備固定液時往往需要一種膨脹劑以補償另一些化學(xué)品的收縮效應(yīng)，所以甲醇這一特性是非常有用的。它的有效濃度為70至100。它是一種無色有毒的液體且可以任何比例與水混合。但不能與氧化劑一道，否則很快會氧化成甲酸。,.,乙醇廣泛地用作染色體固定劑的一種成分。它的有效濃度與甲醇一樣。乙醇有一個最重要的優(yōu)點是能迅速地穿透人組織。它可以沉淀蛋白質(zhì)，還具有脫水性可使蛋白質(zhì)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的變性，還能使組織硬化。作為一種還原劑，在有氧化劑存在時乙醇會很快被氧化為乙酸。所以它不能與許多金屬固定劑(鉻酸或四氯化鋨)相混用。乙醇不能有效地固定染色質(zhì)，原則上不能與醋酸、甲醛或氯仿混合使用?？墒抢涞囊掖脊潭ǚㄍ鼙４婺承┟福驗槊傅姆磻?yīng)基團(tuán)般是不受它破壞的。在對染色體的酶進(jìn)行研究時，宜用80冷乙醇固定1小時或更多時間；如用于單層培養(yǎng)物，往往以純乙醇或95的乙醇固定1-15分鐘為宜。,.,卡諾固定液?？ㄖZ固定液由1份冰醋酸和3份甲醇或乙醇混合而成。這種固定液適用于所有的動植物和人類染色體的固定。固定的時間為15分鐘到24小時，溫度為室溫或稍冷。必要時可以改變酸和醇的比例，例如改成1:2或1:4等。隨著醋酸比例的增高，固定液膨脹的效能加大，有利于染色體的鋪展；但是如果控制不當(dāng)則會導(dǎo)致細(xì)胞破碎，反而不利于分析。卡諾固定液的一個缺點是經(jīng)這種方式固定的組織不能被許多堿性染料的水溶液染上色，除非用一些特殊的媒染劑。這是因為固定液中缺乏有助于染色體嗜堿性的金屬成分。,.,3.3固定的過程預(yù)固定：低滲30分鐘后，在離心管中加入1滴管約2ml的卡諾固定液，并將其混和均勻，使之與細(xì)胞充分接觸。繼續(xù)水浴5分鐘左右。離心，1500rpm，10min，棄上清液。再固定：在離心管中加入加入固定液6-8毫升，用吸管輕輕打散管底細(xì)胞，使之與細(xì)胞充分接觸，再次離心，1500rpm，10min，棄上清液。并重復(fù)上述操作一次。,.,氣干法固定完成后就進(jìn)入制片階段。早期人們多采用擠壓法，后來則很快被氣干法取代?，F(xiàn)今這一技術(shù)在哺乳類和人類細(xì)胞遺傳學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用，以致擠壓法已幾乎為人們所忘卻。氣干法主要用于那些容易做成細(xì)胞懸液的組織例如骨髓、外周血淋巴細(xì)胞，腹水和生殖上皮細(xì)胞。通過體外培養(yǎng)技術(shù)可使組織塊生長成單層細(xì)胞，或者經(jīng)酶解而變成細(xì)胞懸液。一旦制成細(xì)胞懸液就可進(jìn)行預(yù)處理和固定，然后作氣干法制片。,4.制片,.,4.制片,制片過程已固定的細(xì)胞懸液離心，倒去大部分上清液，使管底的小量固定液中懸浮著大量細(xì)胞。清潔載玻片事先應(yīng)置于冷的二蒸水或純酒精中。用時以清潔鑷子夾取載玻片置于墊板之上，載玻片與墊板應(yīng)成一定的角度（約1015度）。用吸管吸取數(shù)滴細(xì)胞懸液滴在載玻片上。這樣滴上的細(xì)胞懸液可順著濕的表面自上而下流散開來。滴片完畢后將墊板連同載玻片放入75烤箱，烤片3小時，使固定液揮發(fā)。氣干法制片比擠壓法省事，效果也很好。在一個載玻片上，大約2/3的面積就足以容納0.2毫升全血培養(yǎng)物中的所有細(xì)胞。由此制得的標(biāo)本細(xì)胞密度較高，適于觀察與分析。,.,三、實驗用品1采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機、托盤天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號筆、玻片架、火柴、10ml注射器。2RPMI1640液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素（500U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低滲液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液（PH6.8）。32.5胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸、1N氫氧化鈉。,.,四、實驗步驟1.采血及接種培養(yǎng)1.1在酒精燈火焰上，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素濕潤至管壁。1.2常規(guī)消毒后，采集外周靜脈血5ml，轉(zhuǎn)動注射器使血液與肝素混勻。1.3在超凈工作臺中，預(yù)先將RPMI1640液體培養(yǎng)基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中，再滴加25滴全血（6號針頭），水平搖動混勻。,.,1.采血及接種培養(yǎng)1.4置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4872小時。培養(yǎng)過程中每天水平搖動培養(yǎng)物12次，使血液均勻懸浮，再繼續(xù)培養(yǎng)。1.5終止培養(yǎng)前24小時，加入秋水仙素，使終濃度達(dá)到0.2g/ml。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時。,.,2制片2.1收集細(xì)胞時，去掉瓶塞，用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液，充分混勻培養(yǎng)物，再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。2.21000rpm離心8分鐘（注意先配平）。2.3棄上清液，加入37預(yù)溫的0.075mol/LKCl溶液8ml，用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后，置37恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。2.4加入1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混勻，1000rpm離心8分鐘。2.5棄上清液，加入8ml固定劑，吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后，室溫下固定20分鐘。,.,2制片2.61000rpm離心8分鐘。2.7棄上清液，重復(fù)固定一次。2.8棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細(xì)胞制成懸液。2.9吸取少量細(xì)胞懸液，滴23滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，氣干。2.10將標(biāo)本置Giemsa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。2.11顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。,.,3.G顯帶染色體標(biāo)本制備3.1常規(guī)制片后，將標(biāo)本置70烤箱中干烤2小時，自然冷卻。3.2取2.5胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45ml生理鹽水，用1NHCl或1NNaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色（PH6.87.2），置37預(yù)溫。3.3將玻片標(biāo)本放入胰酶溶液中處理2545秒鐘，不斷輕輕搖動玻片，使胰酶作用均勻。隨著處理標(biāo)本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時間逐漸延長。,.,3.G顯帶染色體標(biāo)本制備3.4取出染色體玻片標(biāo)本，置于37預(yù)溫的生理鹽水中，然后用蒸餾水沖洗玻片（或輕甩，除去多余的胰酶）。3.5將玻片標(biāo)本放入37預(yù)溫的Giemsa染液中，染色2分鐘。3.6自來水沖洗，氣干。3.7顯微鏡觀察。,.,4.結(jié)果分析,.,.,.,.,.,二、G顯帶標(biāo)本的核型分析,一禿二蛇三蝶飛，四象鞭炮五黑腰。六號短臂小白臉，七上八下九苗條。十號長臂三條帶，十一低來十二高，十三十四十五號，三個一樣一二一。十六長臂近點深，十七遠(yuǎn)端帶腳鐐。十八人小肚皮大，十九中間一點腰。二十頭重腳底輕，二十一象葫蘆瓢。二十二一點Y黑腰，Xpq一肩挑。,一、人類外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本制備（略）,.,1號染色體中央著絲粒和次縊痕染色深。短臂：近側(cè)段和中段各有一條深帶，其中段深帶稍寬，在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段可顯出2-3條淡染的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)的深帶為2區(qū)1號帶，中段深帶為3區(qū)1號帶。長臂：次溢痕緊貼著絲粒，染色濃。其遠(yuǎn)側(cè)為一寬的淺帶，中段和遠(yuǎn)側(cè)段各有兩條深帶，以中段第2深帶染色較濃，中段兩條深帶稍靠近。此臂分為4個區(qū)，次溢痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶為2區(qū)1號帶，中段第2深帶為3區(qū)1號帶，遠(yuǎn)側(cè)段第3深帶為4區(qū)1號帶。,一禿,.,2號染色體短臂：可見4條深帶，中段的兩條深帶稍靠近。此臂分為2個區(qū)，中段第2、3深帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶。長臂：可見6-7條深帶，此臂分為3個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區(qū)1號帶。,二蛇,.,3號染色體著絲粒染色濃。在短臂和長臂的中短各有一條明顯而寬闊的淺帶。短臂：一般在近側(cè)段可見兩條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見3條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)近端部的一條較窄，且著色較淡，這是區(qū)別3號染色體短臂的顯著特征。此臂分為2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1號帶。長臂：一般在近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條較寬的深帶。在處理較好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為3條深帶，此臂分為2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1號帶。,三蝶飛,.,4號染色體短臂：可見1-2條深帶，短臂只有1個區(qū)。長臂：可見均勻分布的4條深帶，在處理較好的標(biāo)本上，在2、3深帶間還可顯出一條較窄的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)段第1、2深帶間的淺帶為2區(qū)1號帶；遠(yuǎn)側(cè)段第3、4深帶間的淺帶為3區(qū)1號帶。,四象鞭炮,.,5號染色體短臂：可見1-2條深帶，其遠(yuǎn)側(cè)的深帶寬而且色濃。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)段有一條深帶，染色較淡；中段可見3條深帶，染色較濃；遠(yuǎn)側(cè)段可見1-2條深帶，近末段的一條著色較濃。此臂分為3個區(qū)，中段第2深帶為2區(qū)1號帶；中段第3深帶與遠(yuǎn)側(cè)段第1深帶之間寬闊的淺帶為3區(qū)1號帶。,五黑腰,.,6號染色體著絲粒染色濃。短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條深帶，近側(cè)段的深帶緊貼著絲粒。在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為2條深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區(qū)1號帶。長臂：可見5條深帶，近側(cè)的一條緊貼著絲粒。遠(yuǎn)側(cè)段末段的一條深帶窄而且著色較淡。此臂分為2個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶。,六號短臂小白臉,.,7號染色體著絲粒染色濃。短臂：有3條深帶，中間的一條深帶窄而且著色極淡，有時不明顯，遠(yuǎn)側(cè)近末段的深帶著色濃而稍寬，宛如“瓶蓋”，這常常是辨別7號染色體的明顯特征。此臂分為2個區(qū)，遠(yuǎn)側(cè)深帶為2區(qū)1號帶。長臂：有3條明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)近末段的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)1號帶；中段的第2深帶為3區(qū)1號帶。,七上,.,8號染色體短臂：有2條深帶，其間有一條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相區(qū)別的主要特征。此臂分為2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1號帶。長臂：近側(cè)段可見2-3條分界不明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段有一明顯而恒定的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1號帶。,八下,.,9號染色體著絲粒染色濃。短臂：遠(yuǎn)側(cè)段可見兩條深帶，在有的標(biāo)本上融合成一條深帶。此臂分為2個區(qū)，近側(cè)的第1深帶為2區(qū)1號帶。長臂：可見兩條明顯的深帶，次溢痕一般不著色，在有些標(biāo)本上呈現(xiàn)特有的狹長“頸部區(qū)”。此臂分為3個區(qū)，近中段的一深帶為2區(qū)1號帶，遠(yuǎn)側(cè)段的一深帶為3區(qū)1號帶。,九苗條,.,10號染色體著絲粒染色濃。短臂：近中段有一條深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：可見明顯的3條深帶，近側(cè)的一條著色最濃。該長臂上的這3條明顯的深帶是與8號染色體相區(qū)別的一個主要特征。此臂分為2個區(qū)，近側(cè)段的第1深帶為2區(qū)1號帶。,十號長臂三條帶,.,11號染色體著絲粒染色濃。短臂：近中段可見一條寬的深帶，在處理較好的標(biāo)本上，這條深帶可分為兩條較窄的深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒，近中段可見一條明顯的較寬的深帶，在這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條寬闊的淺帶。在處理較好的標(biāo)本上，近中段的這條較寬的深帶可分成兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，后者雖常不明顯，但卻是分區(qū)上的一個界標(biāo)。在有些標(biāo)本上近末端處尚可見一條窄的淺色的深帶。此臂分為2個區(qū)，界標(biāo)即2區(qū)1號帶為上述近中段兩深帶之間的那條很窄的淺帶。,十一低來,.,12號染色體著絲粒染色濃。短臂：中段可見一條深帶，此臂只有一個區(qū)。長臂：近側(cè)有一條深帶緊貼著絲粒。中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號染色體比較，這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個主要的特征。在處理較好的標(biāo)本上，中段這條較寬的深帶可顯出3條較窄的深帶，且正中一條著色較濃。在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段還可見1-2條窄的染色較淡的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段正中著色較濃的深帶為2區(qū)1號帶。,十二高,