腫瘤基因治療的研究進程及發(fā)展趨勢-郭曉明

免疫學(xué)概論課程論文腫瘤基因治療的研究進程及發(fā)展趨勢姓 名： 郭冬陽 學(xué) 號： 200904123100* 學(xué) 院： 材料與化工學(xué)院 專業(yè)班級： 2009級生物工程（2）班 指導(dǎo)教師： 鄭育聲 分數(shù)： 2012年12 月30 日摘要腫瘤的基因治療就是將一個治療基因“捆綁”在“病毒”上，隨后將這種載有治療基因的“病毒”感染腫瘤患者或腫瘤細胞，使治療基因進入腫瘤細胞，進而“摧毀”腫瘤細胞。這種腫瘤的治療技術(shù)已成為現(xiàn)代廣大腫瘤學(xué)者的研究熱點，其具有特異性、安全性、有效性的特點而受到越來越多的關(guān)注，而且許多實驗及臨床研究取得了滿意的效果。本文將從腫瘤基因治療的方法、我國腫瘤基因治療的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢等方面進行論述。關(guān)鍵詞：腫瘤；基因治療；研究進展；發(fā)展趨勢基因治療是以改變遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)，需要將目的基因傳遞到細胞內(nèi)，這一過程必需載體的協(xié)助才能達到目的，因此載體在基因的轉(zhuǎn)移中擔(dān)任重要角色。隨著免疫學(xué)的發(fā)展和基因技術(shù)研究的不斷加深，結(jié)合病毒載體、免疫基因和轉(zhuǎn)基因等方法在腫瘤的基因治療中取得了許多成就，為腫瘤的治療展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。一、腫瘤基因治療11 腫瘤基因治療的策略（1）免疫基因治療，又稱細胞因子基因治療，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞因子基因，增強機體抗腫瘤免疫能力；（2）自殺基因治療，使肝癌細胞產(chǎn)生對某些藥物前體的特異敏感性而被殺；（3）基因置換或補充，置換突變的基因或補充缺失的抑癌基因；（4）反義苷酸技術(shù)，用于抑制癌基因的表達。12 腫瘤基因治療基因工程的程序 首先取得所需要的基因即目的基因，將其同載體連接，再將經(jīng)過重組的環(huán)狀DNA即質(zhì)粒引入受體細胞，并使目的基因和載體上其他基因的性狀得以表達等幾個環(huán)節(jié)。（1）在內(nèi)切酶的作用下分離制備待克隆的DNA片段；（2）將目的基因與載體在體外連接形成重組DNA；（3）重組DNA進入宿主細胞；（4）篩選、鑒定陽性重組子；（5）重組子的擴增。13 腫瘤基因治療基因工程所需的載體雖然內(nèi)切酶解決了異源DNA體外重組的技術(shù)問題，但是重組之后的異源DNA還必須回到細胞內(nèi)才能顯示出其生物活性。這就要求有一種運送載體來充當(dāng)此角色。微生物中有一種非染色體一種環(huán)狀DNA或病毒可以做為載體，這樣載體的共同特點是：（1）它們都是環(huán)狀DNA；（2）都能專一性的感染某一細胞；（3）都具有某種選擇性標記；（4）都具有一些內(nèi)切酶的酶切位點；（5）都可以隨染色體的復(fù)制而獨立復(fù)制，隨著細胞的分裂而擴增。14 腫瘤基因治療基因工程所需的工具酶 只有在DNA限制性內(nèi)切酶、載體質(zhì)粒、連接酶及其它修飾酶的作用下，才能實現(xiàn)隨心所欲地移動和改造基因。內(nèi)切酶的共同特點是：它們都有專一性的DNA識別順序，都能在DNA鏈當(dāng)中切開DNA，故稱“內(nèi)切”的酶。但切開的方式有兩種：（1）切成粘性末端；（2）切成平末端?；蚬こ萄芯烤褪抢昧藘?nèi)切酶可以專一性地把DNA切割成特定的粘性末端的特點，根據(jù)研究工作的實際需要，把一些不同來源，具有粘性末端的DNA片段重新連接或組合起來，這就是DNA技術(shù)的來由。15 腫瘤基因治療基因工程所需的細胞 293細胞是傳染腺病毒ELA基因的人胚腎上皮細胞系，有致瘤性，是轉(zhuǎn)化細胞。細胞感染病毒后，首先是細胞形態(tài)的變化，由于病毒能增強細胞膜的滲透性，細胞外的離子鈉離子流入胞內(nèi)，細胞可從原來的形態(tài)變?yōu)閳A形，然后由于細胞支架的降解或破裂導(dǎo)致細胞從基質(zhì)上脫落，最后破裂。二、腫瘤基因治療的常用方法21 基因沉默療法RNA干擾是指在生物體細胞內(nèi)，與靶基因同源的外源性或內(nèi)源性雙鏈誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后引起特異性基因沉默。現(xiàn)已闡明RNAi發(fā)生機制的大致模型。1)啟動階段：長dsRNA 或短發(fā)夾RNA進入細胞后，在一種具有RNase活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶作用下，被切割為2123個核苷酸組成的片段，即siRNA。2)效應(yīng)階段：siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，識別mRNA，其中的反義鏈與靶mRNA互補結(jié)合，正義鏈則被置換出來。繼而，RISC中的Dicer在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷。3)級聯(lián)放大：在RNA依賴性RNA 聚合酶的作用下，以mRNA 為模板，siRNA為引物，擴增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶，產(chǎn)生更多的siRNA，從而使效應(yīng)階段反復(fù)發(fā)生，一個完整的mRNA就被降解成2l-23 nt的小片段，導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達沉默。22 自殺基因療法自殺基因療法也稱前藥轉(zhuǎn)換酶基因療法，是指將某些病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細胞，此基因編碼的特異性酶能將對細胞無毒或毒性極低的藥物前體在腫瘤細胞內(nèi)代謝成細胞的毒性產(chǎn)物，以達到殺死腫瘤細胞的目的。自殺基因治療系統(tǒng)的種類很多，主要包括單純皰疹病毒I型胸苷激酶丙氧鳥苷系統(tǒng)、帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激梅新華 腫瘤基因治療的研究進展酶阿糖甲氧基嘌呤系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶5一氟胞嘧啶系統(tǒng)和硝基還原酶系統(tǒng)等。目前研究較多的是HSV tkGCV 系統(tǒng)，研究者正在致力于提高自殺基因療法的效率。在自殺基因的探索中，不少究者發(fā)現(xiàn)，少量的自殺基因轉(zhuǎn)染的癌細胞與未轉(zhuǎn)染的癌細胞按一定的比例混合后培養(yǎng)，不僅轉(zhuǎn)染的癌細胞被殺滅，兩者相互接觸后相鄰的未轉(zhuǎn)染癌細胞也大量死亡，此即“旁觀者效應(yīng)”。治療中，“旁觀者效應(yīng)”是一重要特征，即有毒代謝物通過縫隙連接或凋亡小體從轉(zhuǎn)染細胞移動到鄰近細胞，對其產(chǎn)生殺傷作用，大大提高了自殺基因的殺傷效應(yīng)。23 免疫基因療法免疫基因治療是通過基因重組技術(shù)，增強機體的抗腫瘤免疫功能，達到治療腫瘤的目的，主要包括增強免疫效應(yīng)細胞功能的細胞因子基因療法、調(diào)節(jié)增強抗原識別能力的主要組織相容性復(fù)合物的基因療法和共刺激分子基因療法等。在腫瘤免疫治療中，免疫活性細胞的免疫監(jiān)督和殺傷活性起著重要作用。細胞毒淋巴細胞對腫瘤細胞低反應(yīng)性的一個主要原因是腫瘤細胞表面共刺激分子B-7家族的低表達，導(dǎo)致CD28和CD152以及B-7之間相互作用減弱。細胞毒性T淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細胞，其介導(dǎo)的細胞毒作用需要識別細胞表面的T細胞抗原受體和主要組織相容性復(fù)合體分子。相反，F(xiàn)as-FasL介導(dǎo)的細胞毒作用無特異性。因為腫瘤表面通常表達Fas，所以FasL和CTI 是抗腫瘤的兩大武器。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細胞通過抑制APC，特別是DC的抗原遞呈作用來逃避宿主對其進行的免疫攻擊。DC來源的腫瘤疫苗將是具有巨大潛力的腫瘤免疫治療手段。24 基因替代療法抑癌基因亦稱抗癌基因，是指正常細胞內(nèi)存在的能抑制細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群?；蛱娲委熅褪抢幂d體將缺失的抑癌基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，以達到殺傷腫瘤細胞的目的。目前已分離克隆出20余種抑癌基因，p53基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，腫瘤生成會伴隨p53的缺失。目前研究的抑癌基因還有Fhit及第10號染色體丟失的張力蛋白同源的磷酸酯酶等，但真正應(yīng)用到臨床，還需要大量的研究。sible sites，AAS)，并轉(zhuǎn)染入胃癌細胞株MNK-45，實驗組Survivin RNA 和蛋白水平明顯下降，部分腫瘤細胞呈現(xiàn)凋亡的特征性改變。并且這種作用與AAS的位置有關(guān)系，提示反義Survivin能夠誘導(dǎo)凋亡，抑制腫瘤細胞生長。分化抑制因子又稱DNA結(jié)合抑制因子，屬于螺旋環(huán)一螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，與腫瘤的發(fā)生、侵襲及腫瘤血管生成等方面密切相關(guān)。Id蛋白可成為腫瘤靶向治療的一個新靶點。目前用于反義治療的基因還有Bcl-2、cerb-B2和增殖細胞核抗原等。25 反義基因療法 反義基因療法就是根據(jù)堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定DNA或RNA片斷(反義核酸)，抑制或封閉專一靶基因的技術(shù)。Tong等在體外通過隨機寡核苷酸庫聯(lián)合特定軟件分析，選擇合適的Survivin反義位點在腫瘤生成與轉(zhuǎn)移中新生血管發(fā)揮重要作用，VEGF和轉(zhuǎn)化生長因子是促進新生血管生成的主要生長因子，以VEGF作用最強。與其他基因治療相比，該療法無需直接轉(zhuǎn)染腫瘤靶基因，只需轉(zhuǎn)染腫瘤4周，創(chuàng)造抑制血管生成的環(huán)境。小鼠血管內(nèi)給予針對VEGF受體的siRNA時發(fā)現(xiàn)，VEGF受體表達減少，腫瘤的生長速度和血管生成明顯減少。26 多藥耐藥相關(guān)的基因療法多藥耐藥(MDR)是指在化療藥物治療腫瘤中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞的非特異普遍耐藥性。導(dǎo)致腫瘤細胞MDR 的一個重要原因是MDR1基因擴增和過度表達。MDR相關(guān)的基因治療一般集中在抑制腫瘤細胞的MDR1基因表達，從而增加常規(guī)化療的效果。郭華等以MDR1基因mRNA為靶點設(shè)計合成2個反義肽核酸(PNA)序列，利用PNA-DNA 雜交，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染腦神經(jīng)母細胞瘤耐藥細胞株SK-N-SH。檢測顯示，SK-NSH 細胞P-gP表達明顯降低，MDR1mRNA表達輕度下降，細胞內(nèi)多柔比星(ADM)聚集濃度明顯增加，PNA在MDR1基因抑制中的特殊作用為逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR提供了新的途徑。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF 1)對于腫瘤MDR 形成有多方面的作用，以HIF-1為靶點的腫瘤治療，為克服腫瘤放、化療抵抗提供了新思路。27 抗腫瘤新生血管形成療法反義基因療法就是根據(jù)堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定DNA或RNA片斷(反義核酸)，抑制或封閉專一靶基因的技術(shù)。Survivin是一種凋亡抑制基因，它在正常組織中不表達，而在胚胎發(fā)育組織和多數(shù)人類腫瘤組織中均有程度不同的表達。28 抗端粒酶療法端粒是位于染色體末端的復(fù)合結(jié)構(gòu)，調(diào)控細胞的有絲分裂，隨著細胞分裂將逐步縮短，最后導(dǎo)致細胞凋亡。故端粒的持續(xù)存在是腫瘤細胞增殖的基礎(chǔ)。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠以自身RNA為模板合成端粒的末端重復(fù)序列5-TTAG-3 ，以補償端粒片段的缺失，在正常組織中通常處于抑制狀態(tài)，但在惡性腫瘤和永生化的細胞中常處于激活狀態(tài)。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的活性限速成分。迄今已發(fā)現(xiàn)6種類型的核酶，其中錘頭狀核酶由于結(jié)構(gòu)簡單，設(shè)計方便，成為基因治療的首選。三、我國腫瘤基因治療的現(xiàn)狀 我國是較早開展基因治療研究和臨床試驗的國家。早在1985年，吳曼院士就提出了腫瘤是基因治療的重要目標。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，在基因?qū)牒突蛑委熝芯亢团R床試驗等方面都取得了很大進展，目前我國已有重組腺病毒-p53抗癌注射液,TK基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤,以樹突狀細胞為基礎(chǔ)的腫瘤細胞治療與基因治療、IL-2基因工程胃癌細胞瘤苗、HSV-tk基因治療肝癌等幾個腫瘤基因治療方案進入了臨床試驗階段，并建立了生物領(lǐng)域病毒載體研發(fā)基地，主要開展腺病毒相關(guān)病毒載體用于治療腫瘤的實驗和臨床試驗研究。目前我國已經(jīng)有30余個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因治療方案，并在進行臨床試驗。四、腫瘤基因治療的發(fā)展趨勢近年來，載體系統(tǒng)的不斷完善和發(fā)展，相關(guān)的基因治療研究和試驗報道層出不窮，然而真正意義上的突破卻不容樂觀，主要有：（1）沒有十分理想的治療基因，不同個體發(fā)生腫瘤免疫逃逸的機理可能不同，目前還沒有一個公認的與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因。（2）體內(nèi)基因傳染效率較低，限制了治療基因的表達。（3）對腫瘤發(fā)病機理的認識還遠遠不夠。（4）導(dǎo)入的目的基因難以控制，腫瘤細胞的靶向性不強，損害正常細胞的功能。根據(jù)以上目前腫瘤基因治療的研究主要集中在：（1）尋找新的更有效的治療基因；（2）尋找更好的載體增加傳染效率；（3）選擇更合適的導(dǎo)入途徑。 總之，由于腫瘤是多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜的基因疾病，依靠單一方法并不能達到理想的抗腫瘤效果，因此多種治療聯(lián)合、針對腫瘤的不同特征進行個體治療也已成為基因治療發(fā)展的一個趨勢。參考文獻1 楊家駒，段振玲，腫瘤的基因治療進展，醫(yī)學(xué)綜述，2005，11（10）：883-8852 劉賓娜，腫瘤的基因治療，牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，28（5）：72-743 李允光,濮德敏,劉雪梅等RNAi沉默環(huán)氧酶-2對宮頸癌Hela細胞細胞周期影響的實驗研究J中華腫瘤防治雜志，2007.14(20)：1535-I5384 Sioud 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