《酶與細胞固定化》PPT課件.ppt

第六章酶、細胞、原生質(zhì)體固定化,游離酶的缺點：,(1)酶的催化效率不夠高,(2)酶的穩(wěn)定性較差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）。,(4)產(chǎn)物的分離純化較困難，酶在催化反應結(jié)束后與產(chǎn)物混在一起，給產(chǎn)物的進一步分離純化帶來一定的困難。,(3)酶使用后通常不能回收，這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)，從而導致酶的使用效率低，產(chǎn)品成本高。,第一節(jié)酶的固定化第二節(jié)微生物、植物和動物細胞固定化第三節(jié)原生質(zhì)體固定化,第一節(jié)酶的固定化,一、固定化酶的優(yōu)缺點二、酶的固定化方法三、固定化酶性質(zhì)四、固定化酶的應用,酶的固定化：借助各種物理或化學方法，將酶固定于水不溶性載體上的過程。,固定化酶(immobilizedenzyme)：固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行催化反應的酶。（固定化酶又叫水不溶性酶）,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性載體,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技術(shù),固定化酶的優(yōu)點,一、固定化酶的優(yōu)缺點,固定化酶缺點,缺點,比較適應水溶性底物和小分子底物。,固定化成本高。,酶固定化時酶的活力有所損失。,二、酶的固定化方法,1.吸附法,2.包埋法,3.共價偶聯(lián)法,4.交聯(lián)法,固定化方法,吸附法,結(jié)合法,交聯(lián)法,包埋法,網(wǎng)格型,微囊型,離子鍵結(jié)合法,物理吸附法,共價鍵結(jié)合法,1、吸附法,（1）定義：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。,物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、大孔合成樹脂等。,優(yōu)點：酶的活性中心不易被破壞，酶活力損失小。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。,（3）制備方法：,a.靜態(tài)法(statiaprocedure)：沒有攪拌、振搖情況下，將載體直接加入酶溶液，通過自然吸附、解吸、再吸附等過程、制備固定化酶。該法操作簡便，但效率低，耗時，吸附量小且不均勻。b.電沉積法(electrodepositionprocedure)：在酶溶液中放置兩個電極，在電極鄰近加入載體，接通電源，酶移向電極并沉積到載體表面，以制備固定化酶。該法可提高吸附時局部濃度，增加吸附量，但要注意酶在電場中的穩(wěn)定性。,c.混和振搖裝載法(mixingorshakingbathloading)：是實驗室常用方法，載體與酶液混和后，要在攪拌下或搖床連續(xù)振搖下完成固定化。該法固定化較為均勻，要注意攪拌或振搖速率，既不破壞酶和載體結(jié)構(gòu)，又要達到充分混和目的。d.反應器裝載法(reactorloadingprocess)：這是工業(yè)上常用方法，它將固定化和其后的應用連在一起，即先將載體裝于反應器中，再加上酶液，然后通過循環(huán)流振動方式使酶和載體達到充分混和。,(1)定義：將酶分子包埋在各種多孔載體中，制成一定形狀的固定化酶的技術(shù)，主要用于水溶性小分子底物轉(zhuǎn)化反應。,2、包埋法：(entrapment),(2)包埋法的類型：酶被包埋成網(wǎng)格型稱為凝膠包埋法；酶被包埋成微膠囊型稱為微膠囊包埋法。包埋過程不發(fā)生反應,凝膠包埋法（網(wǎng)格型）：將酶包埋在凝膠內(nèi)部的微孔中。微膠囊包埋法（微囊型）：將酶包埋在高分子半透膜中。,a.凝膠包埋：,使用的多孔載體及其特點,海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠E(orcell)KCl溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：過硫酸鉀Acr+Bis+E(orcell)IE(orIC)二甲氨基丙腈,b.微囊型包埋(microencapsulation)：又稱半透膜包埋法：,將酶包埋于由各種高分子聚合物（直徑幾十微米幾百微米，厚約25mm的半透膜）制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉膠膜制備方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性劑乳化液包埋法。分述如下：,界面沉降法：利用高聚物在水相和有機相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而將酶包埋于中。例：以火棉膠（硝酸纖維素）包埋酶時，先將酶的水溶液在含有硝酸纖維素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纖維素在酶液液滴周圍凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉膠囊。,界面聚合法：將疏水性和親水性單體在界面進行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。例：以尼龍膜包埋酶時，將酶液及親水性單體（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，將疏水性單體（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等與水混溶的有機溶劑。然后，將這兩種互不相溶的液體混和在一起。加入乳化劑乳化，使酶液分散成小液滴。此時，親水性的已二胺與疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，將酶包埋在小球內(nèi)。再加Tween20，使乳化破壞，用離心分離即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。,表面活性劑乳化液膜法：在酶的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達到包埋的目的。該法不含化學反應，簡便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性。,脂質(zhì)體包埋：將酶包埋于脂質(zhì)體(Liposome)中的方法。脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體。脂質(zhì)體包埋的特點：具有一定的機械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應用方面受到重視。,與凝膠包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點：1）固定化酶顆粒小。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過敏反應，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學價值。缺點：反應條件要求高,制備成本也較高。,包埋法是目前應用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反應，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。,1）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素,3.結(jié)合法,載體通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合的固定化方法。,1）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素,優(yōu)缺點：催化效率損失小；結(jié)合力弱，改變pH和離子強度可使酶脫落。,借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)。,2）共價結(jié)合法,A.載體：親水載體優(yōu)于疏水載體如:天然高分子衍生物:纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺聚苯乙烯機械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍,親水性好，有一定機械強度,2）偶聯(lián)方法：,芳香氨基羥基羥甲基氨基,載體上的功能基團,酶分子上的非必需側(cè)鏈基團,游離氨基胍基酚羥基巰基咪唑基羥基,重氮法疊氮法鹵化氫法烷化法縮合法,常用的偶聯(lián)反應,重氮法：這是帶芳香氨基載體的主要反應，即載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，然后再在溫和的條件下和酶分子上相應的基團如酚羥基、咪唑基或氨基直接進行偶聯(lián)。（見示意圖）,載體活化后，活潑的重氮基團可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應值得固定化酶。ROCH2C6H4N+=N+EROCH2C6H4NNE,亞硝酸可由亞硝酸鈉和鹽酸反應生成：NaNO2+HClHNO2+NaCl,疊氮法：含有酰肼基團的載體可用亞硝酸活化，生成疊氮化合物。以羧甲基纖維素為例，先將羧甲基纖維素甲酯化，再與肼反應生成羧甲基纖維素的酰肼衍生物，然后再與亞硝酸反應得到疊氮化合物，這種產(chǎn)物能在低溫、pH7.58.5的情況下和酶的氨基直接偶聯(lián)。疊氮衍生物也能和羥基、酚羥基或巰基反應。,ROCH2COOH+CH3OHROCH2COOCH2+H2OCMCCMC甲酯,R-O-CH2-COO-CH2+NH2-NH2R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OHCMC甲酯肼CMC酰肼衍生物,ROCH2CONHNH2+HNO2ROCH2CON3+2H2O,ROCH2CON3+H2NEROCH2CONHEROCH2CON3+HOEROCH2COOEROCH2CON3+SHEROCH2COSE,溴化氰法(常用)：帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等常用的反應。在堿性條件下載體羥基和溴化氰反應生成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶的氨基進行共價偶聯(lián)反應。,烷基化法：含羥基的載體也可在堿性條件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反應，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。,縮合法：利用羰二亞胺的活化作用，使氨基與羧基直接偶聯(lián)縮合成肽鍵的反應，適用于帶羧基或氨基的載體。,優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點：反應條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。,4.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子之間、酶分子與惰性蛋白或酶分子與載體間發(fā)生交聯(lián)，形成共價鍵連接來制備固定化酶的方法。雙功能試劑：常用的是戊二醛,戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應,使酶蛋白交聯(lián)。,此法與共價偶聯(lián)法利用的均是共價鍵。,在沒有其它載體參與，僅通過酶分子間交聯(lián)形成的固定化酶，顆粒很小，而且機械性能不佳，為克服這一缺點，一般可先將酶吸附于載體上，或者包埋于膠內(nèi)或微囊內(nèi)，然后再交聯(lián)制成固定化酶“網(wǎng)”膜或“網(wǎng)”顆粒。這種方法又稱為雙重固定化法。,交聯(lián)反應既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)（修飾）。酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)（固定化）。,缺點：(1)反應條件激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。,優(yōu)點：制備簡單、結(jié)合牢固、可以長時間使用。,酶和細胞固定化示意圖,各種固定化方法的優(yōu)缺點比較,各種固定化方法的優(yōu)缺點比較,三、固定化酶的性質(zhì)酶分子經(jīng)固相化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)。酶分子處在一個與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會影響酶原有的性質(zhì)。,1.活力：,大多數(shù)酶固定化后，酶活性下降。原因：（1）構(gòu)象改變；（2）空間位阻（3）活性中心與載體結(jié)合,評價固定化酶的指標：,相對活力低于75%，沒有實際應用價值。,2.穩(wěn)定性：,(2)固定化后半衰期增長，保存穩(wěn)定性好。,影響原因：固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，并且固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形。抑制酶自身降解，酶與載體固定化后失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了其自身的降解過程。固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲，但是如果固定化觸及到酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位，也可能導致酶穩(wěn)定性下降。,3.最適反應pH：,酶經(jīng)固定化后，其作用的最適pH常會發(fā)生偏移，影響固定化酶最適pH的因素：,(1)載體性質(zhì)對最適pH影響：帶負電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。不帶電荷載體:最適pH一般不改變。,(2)產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH影響；酶催化反應產(chǎn)物為酸性：最適pH向堿性偏移。酶催化反應產(chǎn)物為堿性：最適pH向酸性偏移。酶催化反應產(chǎn)物為中性：最適pH不改變。,影響原因：固相酶顆粒在水溶液中，是被一層幾乎不流動的液體包圍著，這層不流動液體叫做擴散層。載體的帶電性質(zhì)之所以會影響固定化酶的最適pH值，是由于在使用帶負電荷的載體時，載體會吸引反應液中的氫離子(H+)到其附近，致使固定化酶所處反應區(qū)域的pH值比周圍反應液的pH值低一些，這樣就必須把反應液的pH值提高一些，才能使酶充分發(fā)揮其催化功能。故此，固定化酶的最適pH顯得比游離酶的最適pH值高一些。反之，帶正電荷的載體對氫氧根負離子有吸引作用，由它制備的固定化酶的最適pH值要比游離酶的最適pH值低一些。,影響原因：固定化載體成為擴散阻礙，使反應產(chǎn)物向外擴散受到一定的限制所造成的。當反應產(chǎn)物為酸性時，由于擴散受到限制而積累在固定化酶所處的催化區(qū)域內(nèi)，使此區(qū)域內(nèi)的pH值降低，必需提高周圍反應液的pH值，才能達到酶所要求的pH值。為此，固定化酶的最適pH值比游離酶要高一些。反之，反應產(chǎn)物為堿性時，由于它的積累使固定化酶催化區(qū)域的pH值升高，故此使固定化酶的最適pH值比游離酶的最適pH值要低一些。,4.最適反應溫度：,最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。,同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。,5.動力學常數(shù)：Km與Vm,固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加。,Vm固定化前后相同或接近（也有例外）。,6.底物特異性,固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經(jīng)固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經(jīng)固定化后專一性會發(fā)生變化。,影響原因：固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。酶固定在載體上以后，使大分子底物難于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量較小的底物受空間位阻作用的影響較小或不受影響，故與游離酶的作用沒有顯著不同。,四、固定化酶的應用,1.在食品工業(yè)中的應用,2.在醫(yī)藥領(lǐng)域的應用,3.生物傳感器,4.環(huán)境保護,（1）乳制品中乳糖不耐癥：有些人體內(nèi)缺乏乳糖，在飲用牛奶后會發(fā)生腹瀉、腹脹（酸奶不會）。這是因為不能消化牛奶中的乳糖，-半乳糖苷酶：又稱乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，用于制造低乳糖奶。采用固定化乳糖酶可連接生產(chǎn)低乳糖奶，已于1977年實現(xiàn)工業(yè)化。,（2）在啤酒中糖化需要-淀粉酶，而麥芽中的-淀粉酶不足，需添加外源性的淀粉酶來補充，因此可將發(fā)酵液連續(xù)通過固定化淀粉酶反應器。例如，在制造啤酒時，可以試用固定化微生物淀粉酶替代麥芽水解淀粉酶。另外，采用固定化蛋白質(zhì)分解酶類來水解蛋白質(zhì)或多肽也正在研究之中。啤酒經(jīng)長時間存放后，含有的多酚類和多肽結(jié)合在一起，產(chǎn)生所謂冷濁。現(xiàn)在主要是應用木瓜酶來防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，但長期往啤酒中添加這類蛋白質(zhì)分解酶，會對蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生不良影響。為克服這一缺點，目前，正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解決啤酒的防濁問題。,（3）固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應用固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種，它可以用來催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖糖漿。自1972年這項技術(shù)產(chǎn)生以來，科學家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提取的葡萄糖異構(gòu)化酶，并大量應用于工業(yè)生產(chǎn)中，今后幾十年中它將是應用最廣，市場份額最大的固定化酶。,（4）在油脂改性中的應用脂肪酶可以催化酯交換、酯轉(zhuǎn)移和水解等反應，所以在油脂工業(yè)中有廣泛應用，1，3-特異性脂肪酶可酶促酯交換反應，將棕櫚油改性為可可酯。代可可酯是生產(chǎn)巧克力的原料，價格甚高，而棕櫚價廉，因此這一工藝受到較大重視，已開展了較多工作。,（5）用固定化酶酶促生產(chǎn)阿斯巴甜阿斯巴甜是雙肽甜味劑，在工業(yè)上用化學法合成?，F(xiàn)在，已開始用酶法合成，用固定化酶進行藕合反應，得到阿斯巴甜。,（6）固定化酶在茶葉加工中的應用。目前，固定化酶法已經(jīng)開始應用于茶飲料中，例如，固定化的單寧酶和果膠酶。單寧酶是一種水解酶，可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵。將單寧酶應用于茶葉飲料可以改善茶飲料的品質(zhì)。據(jù)報道用固定化的單寧酶處理紅茶，可提高茶湯中可溶性鐵和鈣的含量。若在綠茶加工中使用單寧酶，可以部分消除夏秋茶苦澀味道，可提高茶飲料品質(zhì)。果膠酶是作用于果膠質(zhì)的D-半乳糖醛酸殘基之間的糖苷鍵，使高分子的聚半乳糖醛酸降解為小分子物質(zhì)。茶葉中的水溶性果膠與茶葉的品質(zhì)密切相關(guān)。,（7）在果汁中的應用柑橘類產(chǎn)品加工中出現(xiàn)苦味是柑橘加工中的重要問題。造成苦味的物質(zhì)有兩類：一類為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi)酯化合物（A環(huán)和B環(huán)）；另一類為果實中的黃酮苷。脫苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物質(zhì)，而固定化酶法主要是利用不同酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物質(zhì)。工業(yè)上采用固定化柚皮苷酶減少柑橘類果汁中的柚皮苷含量。,2、醫(yī)藥領(lǐng)域的應用,（1）作為治療藥物固定化酶由于其高穩(wěn)定性，低免疫性，使其在作為治療藥物時，較之溶液酶，表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。,作為治療藥物，溶液酶具有一些“致命”弱點：酶作為異體物質(zhì)，反復應用會導致免疫反應酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白酶水解破壞。由于稀釋效應，藥物酶無法集中于靶器官組織以達到治療所需的最適高濃度。溶液酶的這些缺點，通過選擇適宜的載體與方法將它們固定化以后就能逐一地加以解決。,（2）作為“人工臟器”固定化酶可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)，其應用主要有兩方面：a.用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝產(chǎn)物如清除尿毒癥病人體內(nèi)積累的尿素；進行這類應用時除了要考慮半壽期、免疫過敏等問題外，還要在“人工臟器”中偶聯(lián)多種組成成分以徹底除去毒性產(chǎn)物。如處理尿素時，除了脲酶外，還要解決尿素分解生成氨的問題，這就需要另外加入谷氨酰胺合成酶或加入去氨的樹脂等。,b.除去(一種或多種)氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然后再流回體內(nèi)。,3、生物傳感器生物傳感器是利用生物物質(zhì)作為識別元件將被測物濃度與可測量電信號關(guān)聯(lián)起來的裝置，生物傳感器中研究最多的是酶傳感器，其核心技術(shù)也是酶的固定化。Chen等將高聚物聚乙二醇二縮水甘油醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸等做成薄膜，用薄膜將葡萄糖氧化酶固定在金電極上，通過檢測電信號可以測定血液中的葡萄糖含量。宋正華等將具有分子識別功能的-葡萄糖苷酶和發(fā)光胺，分別固定在殼質(zhì)胺和大孔陰離子交換樹脂的填充柱中,組成流動注射系統(tǒng)，可以方便地確定苦杏仁甙的含量。,4、環(huán)境保護固定化酶一個很大的用途是處理廢水中一些有毒有害物質(zhì)，防止污染。其中漆酶的固定化應用較為廣泛，酚類化合物是廢水中一類常見的高含量污染物，漆酶可以催化氧化酚類化合物，而且不用加入過氧化物酶。在廢水處理中,由于組分復雜而且經(jīng)常變化，利用單一的固定化酶，很難收到好的處理效果。因此，要用多酶固定化體系組合處理，才能使有機物完全礦化和保持無害穩(wěn)定排放。,第二節(jié)細胞固定化,一、基本概念二、細胞固定化方法三、固定化細胞的特點四、固定化微生物細胞的應用五、固定化植物細胞六、固定化動物細胞,細胞固定化技術(shù)：將細胞限制或定位于特定空間位置的方法。,固定化細胞：被限定自由移動的細胞，即采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。,一、基本概念,固定化細胞與固定化酶相比，其優(yōu)點：不需要破碎細胞和分離提純酶，減少了酶活力損失，可大大降低生產(chǎn)成本；保持了胞內(nèi)酶系原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而酶更穩(wěn)定；保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，能催化一系列的反應，大大提高了催化效率，特別是對那些多酶反應、需要輔酶的氧化還原反應以及合成反應等，固定化細胞更具有明顯的優(yōu)勢；固定化細胞的制備與使用通常都比固定化酶更簡便。,二、微生物細胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、交聯(lián)法和無載體法。,1、吸附法(1)定義：將細胞直接與水不溶性載體相結(jié)合的方法。(2)常用吸附劑：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等。,(3)優(yōu)點：操作簡單，對細胞生長、繁殖和新陳代謝沒有明顯的影響。缺點：吸附力弱，吸附容量小，沒有工業(yè)化生產(chǎn)。,2、包埋法（最常用）：(1)定義：將細胞包埋于多孔載體內(nèi)部而制成固定化細胞的方法，稱為包埋法，包埋法能保持多酶系統(tǒng)，是目前制備固定細胞最常用的方法。包埋法又分為凝膠包埋法和半透膜（膠囊）包埋法。,(2)凝膠包埋法：以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內(nèi)，而使細胞固定化的方法。凝膠包埋法常用載體有：瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠等。a.瓊脂凝膠包埋法b.海藻酸鈣凝膠包埋法c.角叉萊膠包埋法d.明膠包埋法e.聚丙烯酰胺凝膠包埋法,(3)半透膜膠囊包埋法：將細胞分散于有機溶劑中成乳化液，此時，細胞被一層液態(tài)膜包圍，形成具有半透膜膠囊的固相細胞。,瓊脂凝膠包埋法,瓊脂,水,溶化,冷卻至4855,加菌懸液,趁熱分散在預冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒。,攤成薄層，冷卻，切成所需形狀。,瓊脂凝膠機械強度較差，氧氣、底物和產(chǎn)物的擴散較困難，其使用受到限制。,海藻酸鈣凝膠包埋法,海藻酸鈉水溶液,滅菌,菌懸液,滴入氯化鈣溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒。,海藻酸鈣凝膠包埋法操作簡便，條件溫和，對細胞無毒性，通過改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑，適合于多種細胞的固定化。,磷酸鹽會使凝膠結(jié)構(gòu)破壞，使用時應控制好培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度，并在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。,角叉菜膠包埋法,角叉菜膠水溶液,冷卻至3550,加菌懸液,趁熱滴定至KCl溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒。,滴到冷的植物油中，成型后再置于KCl溶液中。,角叉萊膠具有一定的機械強度。若使用濃度較低，強度不夠時，可用戊二醛等交聯(lián)劑再交聯(lián)處理，進行雙重固定化。,滅菌,明膠包埋法,明膠水溶液,冷卻至35以上,加菌懸液,冷卻后制成所需形狀。,機械強度不夠時，可用戊二醛等交聯(lián)劑再交聯(lián)處理，進行雙重固定化。,滅菌,聚丙烯酰胺凝膠包埋法,丙烯酰胺,甲叉雙丙烯酰胺,混合,加過硫酸鈣和四甲基乙二胺,靜置成型,固定化細胞機械強度高，可通過改變丙烯酰胺的濃度以調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，適用于多種細胞和酶的固定化。,菌懸液,注意：丙烯酰胺單體對細胞有一定的毒害作用，在聚合過程中，應盡量縮短聚合時間，以減少細胞與丙烯酰胺單體的接觸時間。,3、無載體法(1)基本概念：在沒有載體的情況下，借助物理或化學方法，將細胞直接固定化的方法。這種固定化，既可發(fā)生在細胞結(jié)構(gòu)上，也可通過細胞聚集來完成。包括去自溶酶法和絮凝法。,(2)去自溶酶法：細胞所具有的酶系，從廣義上講已是一種固相酶，因此用簡單的加熱、凍凍，-射線幅射等物理手段處理細胞，使細胞的自溶酶系失活，防止目的酶被水解，由此得到的細胞實體，為固相細胞。,(3)絮凝法：向待固定的細胞液中加入絮凝劑，使細胞凝聚在一起，過濾，收集絮凝細胞，裝柱，即為可使用的固相細胞。常用絮凝劑：活性硅膠、聚賴AA、聚丙烯酰胺等。,目前已報道的有絮凝性的微生物有：霉菌（赫曲霉、醬油曲霉、米曲霉）放線菌（灰色鏈霉菌、酒紅鏈霉菌、石灰壤諾氏卡菌、椿象蟲諾卡氏菌）細菌（嗜蟲短桿菌、產(chǎn)堿細菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、紅平紅球菌、金黃色葡萄球菌及運動發(fā)酵單胞菌）酵母菌（啤酒酵母及葡萄汁酵母、粟酒裂殖酵母、異常漢遜酵母等）,三、固定化微生物細胞的特點：,（1）保持了其完整結(jié)構(gòu)和自然狀態(tài)，穩(wěn)定性好。,（2）細胞密度增大，能夠提高產(chǎn)物產(chǎn)率。,（3）發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復使用或者連續(xù)使用較長時間。,（4）保持了細胞內(nèi)原有的酶系、輔酶系和代謝調(diào)控體系，可以按照原理的代謝途徑進行新陳代謝，并進行有效的代謝調(diào)節(jié)控制。,（5）提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性，有利于菌種的傳代保存。,四、固定化微生物細胞的應用,1、利用固定化微生物細胞生產(chǎn)各種產(chǎn)物：固定化微生物細胞能進行正常的生長，繁殖和新陳代謝，所以利用固定化細胞可以如同游離細胞那樣發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝物。由于微生物固定化后，受載體的影響，故固定化微生物只用于生產(chǎn)各種能夠分泌到細胞外的產(chǎn)物。其中主要有下面幾類物質(zhì)：,(1)酒精酒類：固定化酵母等微生物可用于生產(chǎn)酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒等。有的已完成中試，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。(2)氨基酸：固定化氨基酸生產(chǎn)菌可用于生產(chǎn)谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、異亮氨酸等氨基酸。(3)有機酸：固定化黑曲霉等微生物可生產(chǎn)蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有機酸。,(4)酶和輔酶：固定化微生物可用于生產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶、磷酸二酯酶、天門冬酰氨酶等胞外酶以及輔酶A，NAD，NADP、ATP等輔酶(5)抗生素：固定化微生物在生產(chǎn)青霉素，四環(huán)素，頭孢霉素、桿菌肽、氨芐青霉素等抗生素方面的研究，成果顯著。(6）固定化微生物細胞還可以用于甾體轉(zhuǎn)化及有機溶劑、維生素、化工產(chǎn)品等的生產(chǎn)。,2、固定化微生物細胞制造微生物傳感器：微生物傳感器是由固定化微生物細胞與各種能量轉(zhuǎn)換器(電極，燃料電池，場效應管等)密切結(jié)合而成的傳感裝置。微生物傳感器分為呼吸活性測定型和電極活性測定性兩種。,呼吸活性測定型：利用固定在高分子膜上的微生物細胞的呼吸作用，測定氧氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測定物質(zhì)的量。這種呼吸活性測定型傳感器由固定化微生物膜和氧電極或二氧化碳電極結(jié)合而成。,電極活性測定型：利用固定的微生物細胞的新陳代謝作用，測定電極活性物質(zhì)的量的變化從而確定樣品中欲測物質(zhì)的含量，這種傳感器由固定化微生物膜與生物燃料電池、離子選擇電極和氣體電極等組成。,微生物傳感器已成功地用于測定可發(fā)酵性糖，葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、頭孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸鹽，生化需氧量(BOD)、細胞數(shù)量等。,四、固定化植物細胞,1、固定化植物細胞方法：主要為吸附法與包埋法。,(1)吸附法：吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細胞吸附在中空纖維的外壁上。,(2)包埋法：包埋法是將植物細胞包埋在瓊脂，角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中。包埋方法與微生物細胞包埋時基本相同此法已在植物細胞固定化，以及發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝物方面廣泛采用。,2、固定化植物細胞特點,(1)提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定性載體的保護可減輕剪切力和其他外界因素對植物細胞的影響,(2)固定化植物細胞發(fā)酵可以簡便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，以利于生產(chǎn)各種所需的次級代謝物。,(5)固定化植物細胞可反復使用或連續(xù)使用較長一段時間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率。,(4)固定化植物細胞易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。,(3)細胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動，不容易聚集成團。,2、固定化植物細胞特點,固定化植物細胞主要用途是制造人工種子。還可以用于生產(chǎn)各種色素、香精、藥物、酶等次級代謝物，一般僅適用于可以分泌到細胞外的產(chǎn)物的生產(chǎn)。對于細胞內(nèi)產(chǎn)物，則要想辦法增加細胞透過性，使胞內(nèi)產(chǎn)物分泌到胞外。,五、固定化動物細胞,1、動物細胞固定化方法：主要為吸附法與包埋法,(1)吸附法：大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，它們在培養(yǎng)過程中，必須趨向于附著在固體表面故吸附法特別適合于動物細胞的固定化。,操作簡便、條件溫和，是動物細胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附載體有轉(zhuǎn)瓶、微載體和中空纖維等。,a.轉(zhuǎn)瓶吸附：轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，表面經(jīng)過一定方法處理而帶上電荷。如用高錳酸鉀等氧化劑、強酸、強堿或紫外光照射等進行表面處理，就可使動物細胞容易附著在其表面生長。,培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)瓶以一定速度轉(zhuǎn)動。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡單，操作容易，但比表面積(SV，表面積與體積之比值)較小，細胞生長繁殖受到限制。若在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)加進列管或多層平板組成列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶即可使其比表面積增加，提高生產(chǎn)能力。,b.微載體吸附：微載體是指顆粒細小的固定化載體直徑一般為100200um，相對密度接近l.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠，纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。,微載體已用于多種動物細胞的固定化；用于生產(chǎn)-干擾素，人組織纖溶酶原活化劑、白細胞介素以及各種疫苗等。,c.中空纖維吸附：中空纖維由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纖維管壁是半透膜。,使用時，將動物細胞置于纖維管外壁和外殼容器的內(nèi)壁之間，細胞附著在中空纖維外壁培養(yǎng)液在中空纖維管內(nèi)流動，各種營養(yǎng)成分、溶解氧和代謝產(chǎn)物透過中空纖維膜進行傳遞。,現(xiàn)在已有多種中空纖維培養(yǎng)器用于動物細胞固定化。中空纖維固定化適用于動物附著細胞，也適用于懸浮細胞培養(yǎng)。中空纖維培養(yǎng)器的缺點是：中空纖維成本較高，有時會發(fā)生纖維管堵塞現(xiàn)象，大規(guī)模生產(chǎn)的難度較大。,(2)包埋法：一般適用于懸浮細胞。根據(jù)載體和方法的不同，有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。,a.凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動物細胞固定化，細胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖和新陳代謝，由于有載體的保護，動物細胞有較好的穩(wěn)定性可顯著提高其存活率。用于動物細胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等。,瓊脂凝膠包埋法,12.5%瓊脂糖,溶化,冷卻至3738,加動物細胞,降溫至1O左右，得到直徑為0.10.3mm的微球狀固定化細胞。,海藻酸鈣凝膠包埋法,海藻酸鈉水溶液,滅菌,動物細胞,滴入氯化鈣溶液中，形成球狀固定化細胞。,血纖維蛋白包埋法,血纖維蛋白原,動物細胞,凝血酶,血纖維蛋白,b.半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊型固定化動物細胞。,制備過程：采用海藻酸鈣聚賴氨酸(ALG-PLL)包埋技術(shù)動物細胞先用海藻酸鈣凝膠包埋制成直徑l2mm的膠粒，再用聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜，然后將它泡在檸檬酸鈉溶液中，使海藻酸鈣凝膠溶解。便獲得由聚賴氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化動物細胞。,2、固定化動物細胞特點(1)提高細胞存活率：動物細胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護作用，可以減輕或免受剪切力的影響，同時動物細胞可附著在載體表面生長，從而可顯著提高動物細胞的存活率。,(2)提高產(chǎn)率：動物細胞固定化后，可先在生長培養(yǎng)基中繁殖，使細胞在載體上形成最佳分布并達到一定的細胞密度。然后可簡便地改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件，使細胞從生長期轉(zhuǎn)變到生產(chǎn)期。以利于提高產(chǎn)率。,(3)可反復使用：固定化動物細胞可反復使用或連續(xù)