菊花的組織培養(yǎng)給力的課件

課題一菊花的組織培養(yǎng),安岳中學：蔣小麗,有絲分裂,受精卵,細胞分化,在個體發(fā)育中，由一個或一種細胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程。,1、細胞分化的概念,一、知識回顧,黑色素細胞在體外培養(yǎng)30多代后仍能合成黑色素；離體培養(yǎng)的上皮細胞，始終保持為上皮細胞，而不會變成其他類型的細胞。,2、穩(wěn)定性,3、不可逆性,細胞分化發(fā)生在整個生命進程中。,1、持久性,2、細胞分化的特點,造血干細胞原紅細胞早幼紅細胞中幼紅細胞晚幼紅細胞成熟紅細胞死亡,4、普遍性,遺傳物質(zhì)沒有改變，不同組織的細胞共同來源于受精卵，經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生。,3、細胞分化的實質(zhì),基因,在個體發(fā)育過程中，不同細胞中遺傳信息的執(zhí)行情況不同即基因的選擇性表達的過程,紅細胞,合成血紅蛋白(不合成肌動蛋白),肌細胞,肌動蛋白基因開啟,合成肌動蛋白(不合成血紅蛋白),肌動蛋白基因關(guān)閉,血紅蛋白基因關(guān)閉,血紅蛋白基因開啟,試一試:現(xiàn)在你能解釋這些現(xiàn)象了嗎?,4、細胞分化的結(jié)果,細胞產(chǎn)生了不同種類的蛋白質(zhì)即出現(xiàn)了不同的結(jié)構(gòu)和功能的細胞和組織。,愈傷組織,胚狀體,1958，美國，斯圖爾德植物組織培養(yǎng),離體,二、基礎(chǔ)知識,（一）植物組織培養(yǎng)概念,關(guān)鍵詞：外植體、脫分化、再分化、愈傷組織,在無菌和人工控制條件下，將離體的植物器官、組織、細胞，培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其脫分化產(chǎn)生愈傷組織再分化形成叢芽，最終形成完整的植株。,又稱：植物離體培養(yǎng),脫分化（或去分化）：由高度分化的植物組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程。,再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官的過程。,外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。,愈傷組織：細胞排列疏松、無規(guī)則、高度液泡化的無定形的薄壁細胞。,切取形成層,無菌接種,誘導(dǎo)愈傷組織的形成,試管苗的形成,培養(yǎng)室,移栽,脫分化,再分化,（二）植物組織培養(yǎng)的基本過程,植物組織培養(yǎng)過程,離體組織或細胞,植物體,細胞分裂素生長素,愈傷組織,芽,根,細胞分裂素生長素,細胞分裂素生長素,植物細胞培養(yǎng),不需要光,需要光,（三）植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)-細胞全能性,概念：高度分化的植物細胞，仍然具有發(fā)育成完整個體的潛能。原因：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。表達條件：離體條件無菌操作適宜物質(zhì)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)（植物激素）適宜的營養(yǎng)物質(zhì)溫度、酸堿度、光照等條件的控制,思考,這個試驗說明了已經(jīng)分化的細胞核具有什么特性？,高度分化的動物體細胞的細胞核有發(fā)育成完整個體的潛能,對比：多利羊的誕生,動物細胞有沒有這種能力？,已經(jīng)分化的細胞，仍然具有發(fā)育成完整個體的潛能。,細胞全能性,思考,為什么已經(jīng)分化的細胞具有全能性呢？,高度分化的細胞含有保持物種發(fā)育所需要的全套基因,1、培育無病毒植株,2、大規(guī)模培養(yǎng)愈傷組織（提取紫草素，治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）,4、基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法（受體細胞為植物細胞）,（四)植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：,3、人工種子（解決有些作物品種繁殖能力差，結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題）,三、影響植物組織培養(yǎng)的因素,1、材料的種類、年齡及保存時間長短等2、營養(yǎng)3、植物激素4、PH、溫度、光照等條件,1、植物材料的選擇-直接關(guān)系實驗的成敗,不同植物的組織培養(yǎng)難度不同eg：煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝同一種植物材料，材料的年齡、保存時間的長短等也會影響實驗結(jié)果。,2、營養(yǎng)-MS培養(yǎng)基,A、大量元素:N、P、K、Ca、Mg、S,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co,C、有機物：甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖,D、植物激素：生長素、細胞分裂素、赤霉素等,、主要影響蛋白質(zhì)、核酸的合成；K、Ca、Mg、S主要影響酶的活性。,無機鹽,蔗糖既是碳源也是調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)；維生素能促進細胞分裂和誘導(dǎo)器官分化；甘氨酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是有機氮源。,MS固體培養(yǎng)基成分及比例,討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,常用植物激素：生長素、細胞分裂素和赤霉素生長素、細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈加強的趨勢激素的使用順序、使用的量及比例影響植物細胞的發(fā)育方向,3、植物激素的影響,生長素類：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。,細胞分裂素類：,激動素（KT）、6芐基嘌呤（6BA）、玉米素（ZT）等。,赤霉素類：,赤霉酸（GA3）等,作用：2，4D有利于愈傷組織的生長；IAA、NAA、IBA有利于器官分化。,作用：促進細胞的分裂與分化，其中KT能明顯促進芽的分化而抑制根的形成。,作用：促進不定芽和幼株伸長。,激素的使用順序、使用量及比例影響植物細胞的發(fā)育方向：,思考：以下培養(yǎng)基出現(xiàn)的現(xiàn)象反應(yīng)了什么問題？,供參考的配方,1、誘導(dǎo)菊花愈傷組織：在MS培養(yǎng)基中加入BA和NAA，質(zhì)量濃度均為0.5mg、誘導(dǎo)菊花從芽：在MS培養(yǎng)基中加入BA和NAA，質(zhì)量濃度分別為2-3mg和0.020.03mg3、誘導(dǎo)菊花生根：在MS培養(yǎng)基各成分用量減半，并添加入NAA或IAA，質(zhì)量濃度均為0.1mg,4溫度、光照、pH的影響,光照：菊花每日用日光燈照射12h。,溫度：大多數(shù)植物組織培養(yǎng)控制在2327,低于15時植物組織會表現(xiàn)生長停止,高于35時對植物生長不利。菊花的組織培養(yǎng)控制在1822。,pH：不同植物對培養(yǎng)基最適pH的要求不同，大多數(shù)控制在56.5。菊花的組織培養(yǎng)控制在5.8左右。,制備MS固體培養(yǎng)基,外植體消毒,接種,培養(yǎng),栽培,四、實驗操作,移栽,沖洗酒精無菌水沖洗氯化汞無菌水沖洗至少三次之上,配制各種母液配制培養(yǎng)基滅菌,（一）制備MS固體培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備,1、配制各種母液,無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存,激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨配制成母液,用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量,2、配制培養(yǎng)基,分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml,配制培養(yǎng)液,調(diào)PH,培養(yǎng)基的分裝,由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素,3、滅菌,分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進行高壓蒸汽滅菌,1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝,（二）外植體消毒,2、消毒,流水沖洗,菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右,酒精處理,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數(shù)為70的酒精中搖動23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗,消毒液處理,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分數(shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液,（三）接種,污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘。,1、接種室消毒,2、無菌操作要求,操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。,3、材料的切取和接種,將消過毒的菊花莖段在無菌培養(yǎng)皿中切成0.51cm的小段，用鑷子夾取菊花莖段接種。,4、接種注意事項,每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分數(shù)為70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種,外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜34塊，菊的莖或葉68塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件,插入時應(yīng)注意方向，形態(tài)學上端朝上，形態(tài)學下端朝下，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分,正常苗,污染苗,1、外植體帶菌,2、培養(yǎng)基及接種器具滅菌不徹底,3、接種操作時帶入,4、環(huán)境不清潔,污染途徑,思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實驗嗎？,答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。,（四）培養(yǎng),接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應(yīng)定期消毒培養(yǎng)溫度控制在18-22每日用日光燈光照12h,（五）移栽,移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日。一般放置在2025的遮蔭環(huán)境中，適應(yīng)57d。試管苗不萎蔫，有新生長的趨勢，便可移栽。,1、打開封口膜,2、清洗轉(zhuǎn)移,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間,3、移栽,幼苗長壯后，移栽到土壤中,固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培,珍珠巖,珍珠巖是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結(jié)構(gòu)，所以被命名為珍珠巖。,蛭石是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。,（六）栽培,幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花,1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈灼燒）4、無菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。,在整個操作過程中，是如何來實現(xiàn)無菌環(huán)境的？,結(jié)果分析與評價,（一）對接種操作中污染情況的分析（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化（三）是否進行了統(tǒng)計、對照與記錄（四）生根苗的移栽是否合格,五、課題延伸,1、一般來說，容易進行無性繁殖的植物，也容易進行組織培養(yǎng),2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季,扦插,嫁接,壓條,練習1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培