多酚氧化酶活性測(cè)定

多酚氧化酶活性測(cè)定一、引言食品的褐變主要分為酶促褐變和非酶褐變，多酚氧化酶是引起果蔬褐變的主要酶之一，學(xué)習(xí)它的活性測(cè)定對(duì)于果蔬加工采取合理的護(hù)色措施具有指導(dǎo)意義。多酚氧化酶的活性測(cè)定有多種方法，出于一般實(shí)驗(yàn)室的條件相對(duì)不是很先進(jìn)，本試驗(yàn)選用了一種較簡(jiǎn)單的方法,但這種方法仍然可以訓(xùn)練學(xué)生掌握測(cè)定酶活性的基本要點(diǎn)和技能。二、原理鄰苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成鄰苯二醌，鄰苯二醌能夠被抗壞血酸還原，如抗壞血酸充足，少量鄰苯二酚可反復(fù)不斷地發(fā)生氧化還原。由于該酶最適pH為6，因此這一過(guò)程在pH6時(shí)最快。 把分析對(duì)象配成pH6左右的樣液，在抗壞血酸和鄰苯二酚存在時(shí)，于20下振蕩2min，這時(shí)抗壞血酸被氧化。精確的經(jīng)過(guò)2min后加入偏磷酸以終止反應(yīng)。用碘量法（以碘酸鉀為基準(zhǔn)試劑）進(jìn)行滴定，測(cè)得剩余的抗壞血酸。由得到的數(shù)據(jù)求出被氧化的抗壞血酸量，并計(jì)算出酶活性，并以1g分析物質(zhì)1min內(nèi)氧化抗壞血酸的微克分子數(shù)表示之。所有上述過(guò)程的主要反應(yīng)式如下： 酶鄰苯二酚 鄰苯二醌鄰苯二醌+抗壞血酸 鄰苯二酚+脫氫抗壞血酸KIO3+5KI+6HCl6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc3-脫氫Vc+6HI三、材料和設(shè)備蘋(píng)果；馬鈴薯。研缽；燒杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；溫度計(jì)。四、試劑10.2鄰苯二酚溶液：用粗天平稱0.2克鄰苯二酚，溶解于蒸餾水，稀釋到100毫升，（準(zhǔn)備用的前1-2天配制）。貯于棕色玻璃瓶中，放在冷涼處。20.01N碘酸鉀溶液：用分析天平精確稱取0.3566克KIO2（預(yù)先在102烘2小時(shí)，在干燥皿中冷卻備用），用蒸餾水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N的NaOH溶液（此時(shí)加堿是為了使KIO3和KI在該試劑中暫不反應(yīng)）和2克KI，溶解，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻，保存于棕色瓶中。3pH6.4的磷酸緩沖液，稱取KH2PO4鹽5.44克溶解到無(wú)碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用無(wú)碳酸的水稀釋至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。40.04N抗壞血酸溶液：用粗天平稱取0.35克抗壞血酸溶解到蒸餾水中，用水稀釋至100毫升，混勻。溶液只能用一天。55%的偏磷酸溶液：50克偏磷酸（經(jīng)驗(yàn)式HPO3）溶解到蒸餾水中，稀釋至1升后混勻，保存于磨口玻璃瓶中。60.5%可溶性淀粉。五、操作程序稱1克新鮮的植物材料，加蒸餾水于瓷研缽中研細(xì)，轉(zhuǎn)移到50毫升容量瓶，混勻。充分振蕩勿使沉淀下沉，吸10毫升這種懸浮液，倒入250毫升三角瓶中。加入1毫升pH6.4的磷酸緩沖液，再加入5毫升0.4N的抗壞血酸溶液，混勻。加入5毫升0.2%的鄰苯二酚溶液，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)并充分振蕩。為使空氣中的氧氣不斷進(jìn)入溶液一直要均勻地振蕩2分鐘。經(jīng)精確作用2分鐘后，加入5毫升5%的偏磷酸溶液以停止反應(yīng)。（整個(gè)實(shí)驗(yàn)都應(yīng)在20進(jìn)行。即反各種試劑樣液都予先放到20環(huán)境中，做時(shí)也在20環(huán)境下做，加入偏磷酸量還可根據(jù)自己的模索而定）。加入1毫升0.5%的淀粉溶液，用0.01N碘酸鉀溶液滴定坑壞血酸的剩余物，直至蘭色不消失為止。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照滴定。為此吸取10毫升懸浮液注入另一只三角瓶中，加5毫升偏磷酸，再加入1毫升pH6.4磷酸緩沖液，5毫升0.4N抗壞血酸，再加淀粉液，也用0.01NKIO3溶液滴定。六、計(jì)算多酚氧化酶活性 式中：A多酚氧化酶活性（1克分析物質(zhì)，20下，1min氧化抗壞血酸的微克分子數(shù)）；50分析材料懸浮液的總體積；（ml）；n分析材料的重量（g）；10測(cè)定酶活性所取的懸浮液體積（ml）；2反應(yīng)時(shí)間（min）；a用于滴定對(duì)照