RT-PCR詳細圖文解析.docx

一、實時熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法 。（二）實時原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測。2、實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析3、如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進行定量分析.4、幾個概念：（1）擴增曲線 ：（2） 熒光閾值：（3）Ct值：CT值的重現(xiàn)性：5、定量原理：理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線6、絕對定量1）確定未知樣品的 C(t)值2）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的熒光標(biāo)記：二、實時熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位2、SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時，DNA雙鏈分開，無熒光4、復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:1、SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測2、Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準(zhǔn)3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化5、反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定6、其他與常規(guī)PCR相同（二）應(yīng)用范圍1、起始模板的測定；2、 基因型的分析；3、 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。（三）優(yōu)點及缺點優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性；適用于任何DNA； 使用方便；不必設(shè)計復(fù)雜探針；非常靈敏； 便宜。缺點：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件； 對引物特異性要求較高。方法二：TaqMan-水解型雜交探針*5端標(biāo)記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等*3端標(biāo)記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q)* 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光*Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針（一）工作原理注意：每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光PCR反應(yīng)的建立：1、引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段400 bp，引物Tm為59-602、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72 ，45 S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號/背景比值的最大值 引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同（二）優(yōu)缺點優(yōu)點：對目標(biāo)序列的