細(xì)菌內(nèi)毒素檢查驗(yàn)證方案模板

文件編號(hào) 驗(yàn)證文件驗(yàn)證文件 注射用注射用 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法驗(yàn)證細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法驗(yàn)證方案方案 公司 1 6 驗(yàn)驗(yàn) 證證 文文 件件 公司 文件編號(hào) 目目 錄錄 1 適用范圍 2 目的 3 責(zé)任人 4 樣品的來(lái)源及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 5 內(nèi)毒素限值的確定 6 具體驗(yàn)證步驟 5 1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 5 2 干擾實(shí)驗(yàn) 5 3 供試品的內(nèi)毒素檢查 7 注射用 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法 2 6 驗(yàn)驗(yàn) 證證 文文 件件 公司 文件編號(hào) 1 適用范圍適用范圍 本驗(yàn)證方案適用于注射用 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的驗(yàn)證 2 目的目的 建立該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法 并對(duì)其有效性進(jìn)行評(píng)價(jià) 確保檢測(cè)方法的專屬 性 靈敏度 保證檢測(cè)結(jié)果可符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求 3 責(zé)任人責(zé)任人 細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)員 QC 主管 4 樣品的來(lái)源及樣品的來(lái)源及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 4 1 樣品的來(lái)源 使用的主要試劑及樣品的來(lái)源 使用的主要試劑及實(shí)驗(yàn)條件和儀器實(shí)驗(yàn)條件和儀器 注射用 注射用溶劑 批號(hào) 20100201 規(guī)格 5ml 生產(chǎn)廠 公司 注射用 批號(hào) 20100201 規(guī)格 500mg 生產(chǎn)廠 公司 鱟試劑 標(biāo)示靈敏度為 0 25EU ml 批號(hào) 1110192 規(guī)格 0 1ml 生產(chǎn)廠 湛江安度斯生物有限公司 鱟試劑 標(biāo)示靈敏度為 0 5EU ml 批號(hào) 1101050 規(guī)格 0 1ml 生產(chǎn)廠 湛 江博康生物有限公司 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 批號(hào) 1201160 規(guī)格 2ml 支 生產(chǎn)廠 湛江安度 斯生物有限公司 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 批號(hào) 1004020 效價(jià) 12EU 支 生產(chǎn)單位 湛江安度 斯生物有限公司 實(shí)驗(yàn)用具 移液管 凝集管 三角瓶 試管 試管架 洗耳球 時(shí)鐘 75 酒精棉 剪刀 砂輪 其他玻璃實(shí)驗(yàn)用具 250 1 小時(shí)滅菌處理后使用 4 2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 4 2 1 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡 然后取出將洗液空干 用自來(lái)水將殘留洗液徹底洗凈 再用蒸餾水反復(fù)沖洗三遍以上 空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi) 放置入烤箱 4 2 2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后 將烤箱調(diào)至 250 待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開(kāi)始計(jì)時(shí) 干烤至少 1 小時(shí) 達(dá)到規(guī)定時(shí)間后 關(guān)斷電源 待烤箱溫度自然降至室溫 在不打開(kāi)金屬容器的情況下 可在兩天內(nèi)使用 如果玻璃器 皿用錫箔紙包裝 在不打開(kāi)包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用 否則須再次干烤除去可能存 在的外源性內(nèi)毒素 5 內(nèi)毒素限值的確定內(nèi)毒素限值的確定 根據(jù) 2010 年版中國(guó)藥典二部附錄 E 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定 細(xì)菌內(nèi)毒素限值計(jì) 算公式 L K M 式中 L 為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 本品以 EU mg 表示 K 為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量 注射劑 K 5EU kg h M 為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量 人均體重按 60kg 計(jì)算 人體表面 積按 1 62m2計(jì)算 注射時(shí)間若不足 1 小時(shí) 按 1 小時(shí)計(jì)算 本品以腺苷蛋氨酸計(jì)最大劑 量為 1000mg L 5EU kg h 60kg 1h 1000mg 0 3EU mg 因此本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為 0 3EU mg 6 具體驗(yàn)證步驟具體驗(yàn)證步驟 6 1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 6 1 1 實(shí)驗(yàn)操作 6 1 1 1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支 輕彈瓶壁 使粉末落入瓶底 然后用砂輪在瓶頸上 部輕輕劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開(kāi) 啟開(kāi)過(guò)程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi) 3 6 驗(yàn)驗(yàn) 證證 文文 件件 公司 文件編號(hào) 按照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū) 加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物 用封口膜將 瓶口封嚴(yán) 置旋渦混合器上混合15分鐘 然后進(jìn)行稀釋 制備成4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo) 準(zhǔn)溶液 即2 1 0 5 0 25 為所復(fù)核的鱟試對(duì)的標(biāo)示靈敏度 每稀釋一 步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30 秒鐘 6 1 1 2 待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備 取規(guī)格為0 1ml 支的鱟試劑18支 輕彈瓶壁 使粉末落入瓶底 用砂輪在瓶頸輕輕 劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用 防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi) 每支加入0 1ml 檢查用水溶 解 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁 使內(nèi)容物充分溶解 避免產(chǎn)生氣泡 6 1 1 3 加樣 將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支 管 放在試管架上 排成5列 其中4列4支 管 1列2支 管 4 支 管 4 列每列每支分別加入0 1ml 的2 0 5 和0 25 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 另2支 管 加入0 1ml檢查用水 6 1 1 4 加樣結(jié)束后 將鱟試劑用封口膜封口 輕輕振動(dòng)混勻 避免產(chǎn)生氣泡 連同試管 架放入37 1 水浴或適宜恒溫器中 試管架保持水平狀態(tài) 保溫60 2 分鐘 6 1 1 5 觀察并記錄結(jié)果 將試管架從水浴中輕輕取出 避免振動(dòng) 將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn) 180 觀察 管內(nèi)形成凝膠 并且凝膠不變形 不從管壁滑脫者為陽(yáng)性 記錄為 未 形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性 記錄為 6 1 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算 如最大濃度2 0 4管均為陽(yáng)性 最低濃度0 25 4管均為陰性 陰性對(duì)照為陰性時(shí)實(shí) 驗(yàn)為有效 按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果 c c lg 1 X 4 式中x為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值 lg 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度 6 1 3 結(jié)果判斷 6 1 3 1 判斷標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng) c在0 5 2 包括0 5 和2 時(shí)判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格 可用于干 擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 并以 標(biāo)示靈敏度 為該批鱟試劑的靈敏度 6 1 3 2 判斷結(jié)果 記錄附后 6 2 干擾實(shí)驗(yàn) 目的是檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用 使用 的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液 6 2 1 確定最大有效稀釋倍數(shù) MVD 樣品溶液的制備 取注射用 適量 約相當(dāng)于含腺苷蛋氨酸500mg 加入注射 用溶劑5ml 再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液 本品內(nèi)毒 素限值為0 3EU mg MVD cL L 0 3EU ml c 10mg ml 1 0 5 EU ml 2 0 25 EU ml 因此MVD1 6 MVD2 12 6 2 2 操作方法 6 2 2 1 制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液 取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即 4 6 驗(yàn)驗(yàn) 證證 文文 件件 公司 文件編號(hào) 2 1 0 5 0 25 方法同6 1 1 1 6 2 2 2 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液 取注射用 加入注射用溶劑并制成每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液 再根據(jù) MVD加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋 再用此稀釋液將6 2 3 1 中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 稀釋成4個(gè)濃度即2 0 5 0 25 的含內(nèi)毒素的供試品溶液 6 2 2 3 鱟試劑的準(zhǔn)備及加樣 取規(guī)格為0 1ml 支的鱟試劑36支 輕彈壁使粉末落入瓶底 用砂輪在瓶頸輕輕劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用 防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi) 每支加入0 1ml檢查用水溶解 輕 輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁 使內(nèi)容物充分溶解 避免產(chǎn)生氣泡 6 2 2 4 加樣 將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中18支 管 放在試管架上 排成5列 4列4支 管 1列2 支 管 其中的4支4列每列每支分別加入0 1ml的2 0 1 0 0 5 0 25 的內(nèi)毒素 標(biāo)準(zhǔn)溶液 另一列2支 管 加入0 1ml檢查用水作為陰性對(duì)照 將另外18支 管 鱟試劑放在試管架上 排成5列 4列4支 管 1列2支 管 其中的4支4列每列每支分別加入0 1ml的含2 0 1 0 0 5 0 25 的內(nèi)毒素的供試品 溶液 另一列2支 管 加入0 1ml供試品溶液作為樣品陰性對(duì)照 加樣結(jié)束后 用封口膜 封口 輕輕振動(dòng)混勻 避免產(chǎn)生氣泡 連同試管架放入37 1 水浴或適宜恒溫器中 保 溫60 2分鐘后 觀察并記錄結(jié)果 6 2 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算 如兩組最大濃度2 0 均為陽(yáng)性 最低濃度0 25 均為陰性 陰性對(duì)照 管均為陰性時(shí) 按下式計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值 Es 和用供試 品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值 Et Es lg 1 Xs 4 Et lg 1 Xt 4 Xs Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的 對(duì)數(shù)值 lg 6 2 4 結(jié)果判斷 6 2 4 1 判斷標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)Es在0 5 2 0 包括0 5 和2 0 時(shí) 且Et在0 5 Es 2 0Es 包括0 5 Es和 2 0Es 時(shí) 則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn) 可在該濃度下對(duì)此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi) 毒素檢查 當(dāng)Et不在0 5 Es 2 0Es 包括0 5 Es和2 0Es 時(shí) 則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實(shí)驗(yàn) 6 2 4 2 判斷結(jié)果 記錄附后 6 3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中 每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照 同時(shí) 每次實(shí)驗(yàn)必須做2支陽(yáng)性對(duì)照和2支陰性對(duì)照 6 3 1 操作方法 6 3 1 1 供試品溶液的制備 稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD 6 3 1 2 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2 濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 方法同6 1 1 1 6 3 1 3 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 用待檢測(cè)的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2 濃度的內(nèi)毒素溶液 方 5 6 驗(yàn)驗(yàn) 證證 文文 件件 公司 文件編號(hào) 法同6 2 2 2 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 6 3 1 4 陰性對(duì)照液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 6 3 1 5 鱟試劑的準(zhǔn)備 取規(guī)格為0 1ml 支的鱟試劑8支 輕彈瓶壁使粉末落入瓶底 用砂輪在瓶頸輕輕劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用 防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi) 每支加入0 1ml檢查用水溶解 輕 輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁 使內(nèi)容物充分溶解 避免產(chǎn)生氣泡 6 3 1 6 加樣取8支 管 溶解好的鱟試劑 其中2支加入0 1ml供試品溶液或其稀釋液作為 供試品管 2支加入0 1ml陽(yáng)性對(duì)照溶液作為陽(yáng)性對(duì)照管 PC 2支加入0 1ml檢查用水作 為陰性對(duì)照管 NC 2支加入0 1ml供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管 PPC 6 3 1 7 將試管中溶液輕輕混勻后 用封口膜封閉管口 垂直放入37 1 水浴或適宜 恒溫器中 保溫60 2分鐘 保溫和取放試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果 6 3 2 結(jié)果判斷 6 3 2 1 判斷標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性 供試品陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性且陰性對(duì)照都為陰性時(shí) 實(shí)驗(yàn)有效 若供試品2管均為陰性 認(rèn)為該供試品