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菌種鑒定范文 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 CICC是我國(guó)唯一的國(guó)家級(jí)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，有近三十年菌種分類鑒定的歷史，擁有先進(jìn)的生物科學(xué)儀器和從事分類鑒定的專業(yè)化人員隊(duì)伍。CICC承擔(dān)全國(guó)工業(yè)微生物菌種的委托鑒定工作，所提供的菌種鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)服務(wù)獲得“國(guó)家工商總局（SCIC）經(jīng)營(yíng)許可”，為國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)、大專院校和生產(chǎn)企業(yè)等提供微生物菌種鑒定服務(wù)，涉及細(xì)菌、酵母、放線菌和絲狀真菌等多類微生物。菌種鑒定手段包括形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定、 BIOLOG碳源自動(dòng)分析鑒定、分子生物學(xué)鑒定、API細(xì)菌數(shù)值鑒定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄層層析、全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定、（GC）mol測(cè)定、DNA/DNA同源性測(cè)定等。 鑒定項(xiàng)目 序號(hào) 服務(wù)項(xiàng)目 菌種類別 1 純菌種鑒定（包含形態(tài)、理化、分子） 細(xì)菌、酵母、放線菌、絲狀真菌 2 功能基因鑒定（pheS、gryA、atpD等） 乳桿菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌 3 產(chǎn)品微生物解析 4 產(chǎn)品污染菌種鑒定 5 菌群分析及純種分離 6 細(xì)胞壁化學(xué)組分分析（氨基酸） 細(xì)菌、放線菌 7 細(xì)胞壁化學(xué)組分分析（糖） 細(xì)菌、放線菌 8 DNA（G+C ）mol含量 細(xì)菌、放線菌 9 DNA/DNA雜交 細(xì)菌、酵母、放線菌、絲狀真菌 10 脂肪酸分析 細(xì)菌、放線菌 11 其它 鑒定手段 （1）常規(guī)鑒定 常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和理化特性。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營(yíng)養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)等。 （2）BIOLOG碳源自動(dòng)分析鑒定 BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對(duì)不同碳源的利用情況為基礎(chǔ)，檢測(cè)微生物的特征指紋圖譜，建立與微生物種類相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)軟件將待測(cè)微生物與數(shù)據(jù)庫(kù)參比，得出鑒定結(jié)果。 該系統(tǒng)已獲美國(guó)FDA認(rèn)可，已逐步應(yīng)用于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物/水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物、生物治理、化妝品、臨床等領(lǐng)域的微生物鑒定試驗(yàn)中。 CICC擁有國(guó)內(nèi)最全的BIOLOG數(shù)據(jù)庫(kù)，涉及革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、厭氧菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)近2000種微生物。 （3）分子生物學(xué)鑒定 應(yīng)用分子生物學(xué)方法從遺傳進(jìn)化角度闡明微生物種群之間的分類學(xué)關(guān)系，是目前微生物分類學(xué)研究普遍采用的鑒定方法。CICC擁有微生物菌種分類鑒定的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，配有PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進(jìn)儀器設(shè)備，以及DNAMAN、BIOEDIT、 CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析軟件。目前CICC可采用核酸序列分析法 分析細(xì)菌16S rDNA/16S-23S rDNA區(qū)間序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及絲狀真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科學(xué)的鑒定結(jié)果。 （4）API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個(gè)鑒定系列，約有1000種生化反應(yīng)，目前已可鑒定超過(guò)600種的細(xì)菌。鑒定過(guò)程中，可根據(jù)細(xì)菌所屬類群選擇適當(dāng)?shù)纳砩b定系列，通過(guò)軟件將待測(cè)細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)參比，得出鑒定結(jié)果。 CICC目前可應(yīng)用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列對(duì)乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和相關(guān)細(xì)菌、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌屬 （Staphylocous sp.）、微球菌屬（Microcous sp.）和庫(kù)克菌屬（Locuria sp.）進(jìn)行鑒定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不斷致力于工業(yè)微生物資源的功能及其功能基因研究，目前通過(guò)木聚糖酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、-甘露聚糖酶等功能基因的克隆進(jìn)行菌種產(chǎn)酶的功能性分析。應(yīng)用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌種鑒定，在某些種、亞種、株間有較好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技術(shù) 隨著微生物菌種應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展，在食品安全管理、生物產(chǎn)品出口認(rèn)證、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等行業(yè)需求日益增加，微生物菌種株水平的鑒別技術(shù)成為一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題。 CICC采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技術(shù)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技術(shù)對(duì)微生物菌株進(jìn)行鑒別。如采用RAPD技術(shù)能夠?qū)ν痪N原始菌株與誘變菌株進(jìn)行鑒別，對(duì)誘變菌株知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義；采用SSCP技術(shù)進(jìn)行工業(yè)酒精酵母菌株的鑒別，此技術(shù)結(jié)合菌株發(fā)酵特性，在酒類生產(chǎn)的質(zhì)量控制方面起到積極作用。 （7）TLC薄層層析 CICC將TLC薄層層析技術(shù)應(yīng)用于微生物菌種鑒定，進(jìn)行細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁化學(xué)組分分析（氨基酸、糖），作為劃分屬特征的重要鑒定技術(shù)手段，起到了良好的輔助作用。 （8）全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng) 采用Sherlock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)不同菌株的脂肪酸圖譜進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，來(lái)鑒定細(xì)菌及酵母。該技術(shù)是細(xì)菌或酵母種水平鑒定的有效手段之一。 （9）（GC）mol及DNA/DNA雜交 CICC通過(guò)采用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定Tm值，從而得到微生物菌株的（GC）mol，并與模式菌株進(jìn)行DNA/DNA同源性分析，該鑒定技術(shù)手段是多相鑒定的重要組成部分。 （10）其他手段 CICC可根據(jù)客戶的特殊要求，為您量身定做，提供相應(yīng)的技術(shù)服務(wù)，具體事宜請(qǐng)來(lái)電咨詢。 菌種鑒定一般就只要提取基因組DNA，然后PCR擴(kuò)增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon對(duì)比即可。一般序列相似度在97%以上就可以認(rèn)為是同種細(xì)菌（當(dāng)然也有例外，DNA序列僅僅是一個(gè)參考指標(biāo)）。 菌種鑒定的分子生物學(xué)方法 16S rDNA測(cè)序鑒定菌種 一 原理 二 技術(shù)路線 該方法包括細(xì)菌基因組DNA提取、16S rDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。具體技術(shù)路線如下： 三 方法步驟 （一）細(xì)菌基因組DNA提取（酶解法） 1. 挑取單菌落接種到10 mL LB培養(yǎng)基中37振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。 2. 取2 mL培養(yǎng)液到2 mLEP管中，8000 rpm離心2分鐘后倒掉上清液。 3. 加140 LTE打散細(xì)菌，再加入60 L 10 mg/ml的溶菌酶。37放置10分鐘。 4. 加入400 L Digestion Buffer，混勻。再加入3 L 蛋白酶K，混勻，55溫育5分鐘。 5. 加入260 L乙醇，混勻，全部轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10柱中。10000 rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。 6. 加入500 L 70乙醇（Wash Solution），10000 rpm離心0.5分鐘。 7. 重復(fù)第六步。 8. 再10000 rpm離心2分鐘徹底甩干乙醇。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL的離心管。 9. 加入50L預(yù)熱(60)的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000 rpm離心2分鐘，流下的液體即為基因組DNA。 10. 電泳。取3L溶液電泳檢測(cè)質(zhì)量。 注：如果待測(cè)菌為乳酸菌等不產(chǎn)生芽孢的菌類，且菌種非常純凈單一，則可以用直接煮沸法。 （二）PCR擴(kuò)增 1. 根據(jù)16S rDNA序列設(shè)計(jì)保守的擴(kuò)增引物。 27 F： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492 R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 2. PCR擴(kuò)增體系： 按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR擴(kuò)增體系（50L） 3. PCR將EP管放入PCR儀，蓋好蓋子，調(diào)好擴(kuò)增條件。擴(kuò)增程序如下為： 4. PCR拿出EP管，從中取出5 L反應(yīng)產(chǎn)物，加入1 L上樣緩沖液。點(diǎn)入預(yù)先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中。電泳30 min。在紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。 （三）擴(kuò)增片段的回收 根據(jù)上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果擴(kuò)增產(chǎn)物為唯一條帶，可直接回收產(chǎn)物。否則從瓊脂糖凝膠中切 割核酸條帶，并回收目的片段。 1. 稱量一2mL的EP管質(zhì)量，記錄。 2. 在紫外燈下切割含目的條帶的凝膠，放入2 mL的P管內(nèi)，稱量。計(jì)算凝膠質(zhì)量。 3每100 mg凝膠加入100 L Binding Buffer，混勻。60溫育至凝膠融化。 4全部轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10柱中。10000 rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。 5加入500 LBinding Buffer，10000 rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。 6加入70乙醇（Wash Solution），10000 rpm離心0.5分鐘。 7再10000 rpm離心2分鐘徹底甩干乙醇。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml的離心管。 8加入30L預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000 rpm離心2分鐘，流下的液體即為回收的DNA片段。 （四）DNA片段測(cè)序 將回收的片段送至生物公司測(cè)序，測(cè)序引物為16S PCR引物。 （五）序列比對(duì) 將測(cè)序的結(jié)果在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果得出鑒定菌種。 *主要儀器： 1. PCR儀（用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，一般國(guó)產(chǎn)價(jià)格在2-3萬(wàn)元，最低也要1.8萬(wàn)左右） 2.電泳儀（用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，一般國(guó)產(chǎn)幾個(gè)在3000左右） 附錄：實(shí)驗(yàn)試劑表。 一、儀器與試劑 1 1. 二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程 1、基因組DNA提取 按SK8255（細(xì)菌）、 SK8259（真菌）、 SK8257（酵母）試劑盒操作。 2、PCR擴(kuò)增 2.2 PCR反應(yīng)體系： 2.3 PCR循環(huán)條件： 3、凝膠電泳 1瓊脂糖電泳，150V、100mA 20min電泳觀察（見(jiàn)電泳圖DNA Ladder Mix make）。16SrDNA18SrDNAITS 26S 4、純化回收 PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，純化方式見(jiàn)附見(jiàn)說(shuō)明書(shū)（SK8131 ），PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測(cè)序。 如需要做克隆測(cè)序需要進(jìn)行下面的步驟： 5、連接 ? 按Takara pMD18-T Vector 連接試劑盒操作。 6、感受態(tài)細(xì)胞的制備：（氯化鈣法） 6.1 從于37培養(yǎng)16小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100 ml LB培養(yǎng)基的1 L燒瓶中。于37劇烈振搖培養(yǎng)3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)分)。 冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至 0。 6.3 于 4 , 以4000轉(zhuǎn)分離心10分鐘，回收細(xì)胞。 6.4 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。 6.5 以10 ml用冰預(yù)冷的 0.1 molL CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。 6.6 于 4,，以4000 轉(zhuǎn)分離心10分鐘，回收細(xì)胞。 6.7 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。 6.8 每50ml 初始培養(yǎng)物用 2 ml 用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重懸每份細(xì)胞沉淀。 6.9 將細(xì)胞分裝成小份(100l/支)，放于-70凍存。 7、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 7.1 取100?l感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。 7.2 加入10?l連接液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。 7.3 42水浴熱激90秒。冰上放置1520分鐘。 7.4 加400?l LB培養(yǎng)基，37 200250 rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。 7.5 用槍頭吸取200 ?l培養(yǎng)菌液，涂布在預(yù)先用20?l 100 mM IPTG和100?l 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青霉素平板上。 7.6 平板在37下正向放置1小時(shí)以吸收過(guò)多的液體，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。 8、藍(lán)白斑篩選 當(dāng)外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物?半乳糖苷酶?片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色，選擇在IPTG/X-gal平板上生長(zhǎng)的白色菌落， 9、質(zhì)粒提取與測(cè)序 用M13+_引物擴(kuò)增（體系如上）。.M13+/-引物測(cè)序 三、測(cè)序結(jié)果分析 16SrDNA 序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(kù) 上比對(duì)； 比對(duì)結(jié)果范例： domain Bacteria (0/20/1186838) （界） phylum Actinobacteria (0/20/176308)（門(mén)） class Actinobacteria (0/20/176308) （綱） subclass Actinobacteridae (0/20/167455) （亞綱） order Actinomycetales (0/20/1662