Western Blot技巧.doc

聚丙烯酰胺凝膠溶液：分離膠12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml超純水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 mlpH8.8、1.5mol/LTris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml10%過硫酸銨 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml濃縮膠：5% ，pH6.8 2 ml4 ml6 ml超純水1.4 ml2.8 ml4.1 ml30%丙烯酰胺溶液0.3 ml0.6 ml1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris溶液0.25 ml0.5 ml0.75 ml10%SDS0.02 ml0.04 ml0.06 mlTEMED0.002 ml0.004 ml0.006 ml10%過硫酸銨0.02ml0.04ml0.06ml一配膠1注意一定要將玻璃板洗凈，最后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。2分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可3封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度10%時可用0.1%的SDS封，濃度10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。4灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內(nèi)部分子的排列尚未完成。二樣品處理1培養(yǎng)的細胞（定性）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 對于6孔板來說每孔加200300l，6080的1loading buffer。 100，1min。 用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 23次。 用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0后在1400016000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。 待樣品恢復到室溫后上樣。2培養(yǎng)的細胞（定量）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上1020min。 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲（100200w）3s，2次。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲存，-70一個月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。3組織： 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲存，-70一個月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。三電泳1上樣前將膠板下的氣泡趕走。2所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1loading buffer上樣，Marker也用1loading buffer調整至與樣品等體積。2以初始電壓為45V時的電流強度進行穩(wěn)流電泳，當電壓達65V時改為穩(wěn)壓電泳。3在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。四轉膜1電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備：濕轉使用常規(guī)電轉液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉則取此轉移液，每50ml加入10%SDS180ul。浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。2取膠：將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張（干轉每側三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉，以防止短路）3轉膜：濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊后放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。五封閉及雜交1封閉：將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。2結合一抗：一抗的準備：使用反貼法時每張39cm2膜約需2ml一抗稀釋液。反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。3洗滌：一抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。4結合二抗：根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:10001:10000），室溫輕搖一小時。5洗滌：二抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。六發(fā)光鑒定一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。1HRP-ECL發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。2AP-NBT/BICP顯色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個 EP管中，每張39cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。七增強敏感性若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強發(fā)光強度：1用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進行曝光，可延長曝光時間。2將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。3封閉4060min4一抗雜交，室溫1h。37 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。5PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。6二抗雜交，37 1h。7PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。8發(fā)光鑒定。9若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。10三抗雜交，室溫1h。37 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。11PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。12發(fā)光鑒定。八NC膜的多次使用一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與“七增強敏感性”相近。1如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液（10min3次）后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。2如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）于室溫搖動洗滌30min60min，然后用PBST洗滌10min3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。3對于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）于50洗滌30min，然后用PBST洗滌10min3次，再從封閉開始，后續(xù)步驟同前。Western的原理幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結合并因此而帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關。在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結合1.4克去污劑，借助已知分子量的標準參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液，當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽復合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。電泳 丙烯酰胺凝膠電泳通常用來查看蛋白混合物樣品的復雜程度和監(jiān)測純化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因為隨著膠厚度的增加，電泳時的熱效應會嚴重干擾蛋白的泳動。Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質通過疏水作用產(chǎn)生不可逆的結合。但是這種方法轉移效率低，通常只能轉移凝膠中的一小部分蛋白質（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進行轉移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|在電場力的作用下離開凝膠結合到NC膜上。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。濕轉是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，而其它的蛋白質不能與一抗結合，這樣清洗除去未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠