丙型肝炎病毒基因疫苗研究進展.doc

丙型肝炎病毒基因疫苗研究進展丙型肝炎病毒(HCV)是輸血后肝炎的主要病原體，HCV急性感染后約50-70%以上患者發(fā)展為慢性感染，其中部分病人可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。迄今為止，對HCv慢性感染尚無高效特異性治療方法，對IFN-的治療應答率只有15251。因此，尋求一種預防和治療HCV感染的方法迫在眉睫?；蛞呙缬址Q為核酸疫苗或DNA疫苗，它是由病原體抗原的編碼基因和作為真核細胞表達載體的質粒所組成。這種DNA既是載體又能在真核細胞中表達抗原，刺激肌體產生特異而有效的免疫應答，可有效預防病毒、細菌和寄生蟲等所引起的疾病。DNA疫苗由于具有可誘發(fā)細胞免疫和體液免疫應答、能制備抗多價疫苗、兼有預防和治療作用等優(yōu)點，且與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗在細胞內表達的抗原具有天然構象，免疫原性良好，容易制備和運輸，所以自上世紀90年代初問世以來，已在多種疾病的防治研究中顯示出巨大的潛力2-6。HCV DNA疫苗是近年發(fā)展起來的新型疫苗之一，它是將HCVRNA上的某一特定片段克隆入適當的表達載體中再接種到體內，使目的基因得以表達，誘導機體產生特異的體液免疫和細胞免疫，以期達到預防和清除HCV感染的目的。本文就HCVDNA疫苗的類型、免疫效果的影響因素、作用機制及安全性等方面的研究進展作一綜述。l 不同類型HCV DNA疫苗的構建11 HCV核心區(qū)DNA疫苗的構建 對來自不同基因型的HCV分析發(fā)現，其核心區(qū)(C區(qū))基因片段高度保守，整個序列全長573核苷酸，編碼含191個氨基酸的核心蛋白。Tokushige等7將全長C區(qū)片段克隆在包含有RSV啟動子和CMV增強子的表達質粒中，構建pHCV22質粒，同時構建一個包括HCV 5NCR和C區(qū)全部序列的pHCV42質粒，用磷酸鈣沉淀法分別轉染HuH7細胞、RD細胞和G8細胞系。Western blot分析發(fā)現，3個細胞系中均表達21kd的核心蛋白。且Phv2-2質粒轉染細胞的蛋白表達量明顯高于pHCV4-2。單克隆抗體檢測HCV核心蛋白為非分泌蛋白。用構建好的質粒肌肉注射BALBC小鼠，小鼠對HCV C區(qū)蛋白體液免疫反應性較低，可能和C區(qū)蛋白非分泌有關。 為了評價小鼠體內CTL活性，Tokushige還建立了表達HCV核心蛋白的同基因SP2/0骨髓瘤細胞模型。和接種pHCV42質粒的小鼠相比，pHCV22質粒免疫的小鼠存活率明顯增加、腫瘤的重量也明顯降低，這表明pHCV22能引起較強的免疫應答。pHCV22質粒比pHCV42質粒的免疫效果為好，可能與Phcv22在細胞內表達的核心蛋白能誘導細胞免疫活性有關。Major 等構建了表達HCV C區(qū)核蛋白前58個氨基酸的質粒 DNAPC2N， 免疫Balbc小鼠(下同)，在14同內均未出現抗體反應。而用該段基因與HBV的S基因，或與前S2基因構建嵌合DNA質粒，用同樣方法免疫小鼠，結果均產生抗體反應，且可持續(xù)18周8。Lagging等用編碼整個核殼蛋白(aa1-191)基因構建成DNA疫苗肌肉注射小鼠，均能引起血清抗體、脾細胞對合成肽C7A10的增殖反應，且能誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性9。 Ceissler等認為，HCV C區(qū)核殼蛋白能誘發(fā)機體產生廣泛的體液和細胞免疫，這對清除HCV感染非常重要。在先前研究基礎上，用HCV C區(qū)和HBV的前S1、前S2、S基因構建了9種不同重組體，轉染不同細胞系，然后再免疫小鼠。結果顯示，HCV C區(qū)蛋白及不同嵌合蛋白均可在轉染細胞中表達，并可激發(fā)和增強小鼠CD4+T和CD8+T對HBV和HCV融合蛋白反應，免疫強度與CD4+T淋巴細胞產生的Th1樣細胞因子水乎有關10。12HCV包膜區(qū)DNA疫苗的構建HCV包膜區(qū)(E區(qū))全長5742427nt；分E1區(qū)(574一1149nt)和E2(1150一2427nt)，分別編碼El、E2糖蛋白，其在病毒結合靶細胞方面起重要作用。Rosa11通過NOB(neutralization of binding)定量試驗證實，HCV E2上至少存在可編碼兩種中和抗原從的基因片段，其一是位于E2區(qū)N端的高變區(qū)(high varible region，HRV)，另一片段獨立于HRV以外，編碼抗原能引起不同型HCV的交叉免疫反應。Lee等12用編碼192364、384719氨基酸殘基的E1區(qū)和E2片段分別和HSVI編碼糖蛋白D的基因片段連接后克隆到pTV2質粒中，構建PTv2SElt和pTV2-SE2t疫苗。脛前肌注射Buffalo小鼠，在小鼠體內分別產生抗體和淋巴細胞增殖反應，且pTV2-SE2t疫苗的免疫原性高于pTV2SElt。為研究HCVE2片段不同功能區(qū)的免疫原性，Nakano等13將HCV E2片段分成五個功能區(qū)，即E2A(1150-1332nt)、E2B(13331512nt)、E2C(15131668nt)、E2D(1669一1827nt)、E2E(18282022nt)、將其分別和編碼HBV表面抗原的基因片段融合，以CMV為啟動子構建PS2E2A一2E五個DNA疫苗?；驑屍は伦⑸銪ALBC小鼠，結果發(fā)現HCV E2區(qū)有三個限制性免疫原性功能區(qū)，它們分別是E2A(aa 384443)、E2C(aa504554)和E2E(aa 609674)。用構建的重組體以不同方式免疫小鼠，結果顯示，用基因槍從皮內注射（i.e）比從肌肉注射（i.m）產生抗體滴度高100倍，這可能與皮內有更多的朗罕細胞，能更有效的將表達的抗原遞呈給免疫系統(tǒng)有關。此外，E2區(qū)抗體能與不同HCV亞型E1、E2結合，顯示E2區(qū)的抗體可能有交叉中和作用。而Howard14在研究中指出在HCV E2區(qū)編碼的aa 581591和aa590603是兩個能和HCV人抗體反應的重要抗原表位。同年，Tedeschi15將E2(14322451nt)克隆入Pdr2質粒，構建pDR2疫苗，接種BALBC小鼠也證實了小鼠能產生對HCV有重要中和作用的特異性抗體。 Foomillier等15以HCV基因型E2區(qū)不同基因片段構建了3種不同重組體，用i.m或i.m加i.e等不同途徑免疫小鼠，抗體陽性率在60%-100%之間，其中以i.m加i.e方法效果最好，i.e方法其次，主要是IgG2a，IgG2b，沒有測出IgG1，顯示出Th1樣反應，鼠脾細胞還可分泌IFN-，但未檢出IL-4。隨著對HCV E區(qū)DNA疫苗研究的深入16，提示其可能是未來HCV DNA疫苗研究的熱點之一。1.3 HCV 結構區(qū)DNA疫苗的構建1997年Saito等17將編碼結構區(qū)（C+E1+E2）基因片段（3412449nt）克隆入含CMV啟動子的pRc載體中，構建HCV結構區(qū)DNA疫苗，通過真核細胞體外表達和免疫小鼠研究證實，不僅能在人類293、BALB/3T3、COS-1中表達C、E1、E2蛋白，而且還能誘導BALB/C小鼠產生抗體和特異性CTL的活性。Inchauspe等18-19用HCV C+E2序列構建的質粒DNA疫苗免疫小鼠能誘導特異性的CTL活性、抗-C和抗-E2抗體的免疫應答和Th1為主的增殖反應。 Duenas-Carrers等20-21 用HCV C+E2序列構建的質粒plDKE2 DNA疫苗免疫小鼠和猴也能誘導較強的特異性的CTL活性、抗-C和抗-E2抗體的免疫應答反應。1.4 HCV非結構區(qū)（NS區(qū)）DNA疫苗的構建1996年，Kurokohchi等22證實在HCV NS3存在一個CTL表位，其最小單位由10肽組成，推測其可作為HCV DNA疫苗構建的有效組分。但近來對HCV NS區(qū)疫苗構建的報道研究較少，可能與NS區(qū)編碼的非結構蛋白抗原性及誘導宿主產生特異性免疫應答反應較弱有關。2 HCV DNA免疫效應的影響因素21 細胞因子 細胞因子可通過不同的作用環(huán)節(jié)調節(jié)和增強HCVDNA疫苗的免疫效應而發(fā)揮佐劑作用。Ceissler等10發(fā)現單獨用編碼HCV C區(qū)基因構建的pHCV22疫苗免疫動物時，雖然機體產生有效的CTL反應，但體液應答和Th細胞的增殖作用較弱。當用編碼GMCSF、IL-2的質粒和pHCV22聯(lián)合免疫時，抗HCV核心蛋白的血清轉化率從單獨pHCV22免疫時的40提高至80。進一步研究指出，聯(lián)合接種IL-2和GMCSF質粒能增進小鼠既CD+4炎性細胞的增殖和CD+8抗HCV核心蛋白CTL的活性；而僅聯(lián)合接種IL-4質粒，能促使Th細胞向Th0亞型的分化，且能抑制HCV核心蛋白特異性CTL活性。Lee等3用編碼HCV El或E2蛋白的基因和編碼GMCSF基因融合或非融合表達質粒免疫小鼠后發(fā)現，融合表達DNA疫苗的免疫效果比兩個獨立表達的DNA疫苗免疫效果好，這可能與融合表達后GMCSF的生物學活性改變有關。22核苷酸的序列 HCV DNA疫苗的構建大都臺有氨基糖甙類抗生素(如氨芐青霉素)抗性基因，這主要是因為氨芐青霉素抗性基因中存在著免疫刺激元件(ISS)。研究發(fā)現，ISS實際上是段含有CpG兩側分別為兩個嘌呤和兩個嘧啶的特定核昔酸序列，如5-GACG -TC-3、5-AGCGCT3、5AACGTT3。已證明ISS能誘導NK細胞分泌IFNY、Thl分化增殖、APC上協(xié)同刺激因子的表達和在不同細胞因子環(huán)境下B細胞獨特性的轉換23。Sato等24發(fā)現，用卡那霉素抗性基因構建的DNA疫苗免疫原性較弱。上述結果表明，質粒DNA上的不同抗性基因在DNA免疫中也發(fā)揮了佐劑作用。23免疫途徑和免疫方式 免疫接種時，由于免疫途徑和免疫方式不同，可導致機體產生不同類型、不同強度的免疫應答。Nakano等13用編碼HCV E2蛋白基因構建PCI E2t疫苗，用基因槍分別皮內和服內注射BALBC小鼠，結果皮內注射抗體效價是肌內注射的100倍，且有較高的血清轉換率，這可能與表皮內含有大量的Langerhans細胞，其在抗原遞呈和免疫應答中起重要的作用有關。Feltquate 25的研究表明，不同的免疫方式會影響免疫應答的類型。用編碼同一抗原的基因疫苗以DNA鹽水注射和基因槍兩種方式免疫接種，結果鹽水注射DNA疫苗顯示以誘生Thl為主的增殖反應，產生抗體為IgG2a型；而基因槍接種以誘生Th2為主的增殖反應，抗體主要為IgGl型。24其它因素 有學者報道，構建不同編碼基因融合DNA疫苗能增強疫苗的免疫效果。Inchauspe在編碼HCV核心蛋白158位氨基酸的DNA序列3端串聯(lián)HBsAg基因構建的表達質粒，其表達產物為分泌型融合蛋白，誘生抗體應答效力明顯提高26。此外，在構建疫苗時，不同的啟動子類型、免疫不同遺傳背景的小鼠，都可影響免疫效果。3 HCV DNA疫苗的作用機制31不同免疫方式免疫機制的探討 目前，DNA疫苗接種方式主要有兩種，一是鹽水注射，另一是基因槍接種，其產生的免疫應答類型亦不同。鹽水注射DNA疫苗時：皮膚或肌肉的細胞外組織間隙中存在大量的DNA質粒，由于質粒中多含有未甲基化的CpG回文結構，可誘導NK細胞、T細胞增殖產生Thl型細胞因子，如IL-12、IFNY等25；組織細胞中的APC細胞(如巨噬細胞)攝人少量DNA質粒，可以激活核因子NFB誘導IL-2、IL-l2等細胞因子的表達27；組織細胞(如角質細胞、肌細胞)中攝人的DNA質粒在其細胞漿中表達，并經其內蛋白酶體降解后和內質網中合成的MHC-I類分子結合，遞呈至CD+8T細胞，同時間接激活Thl亞群，誘生Thl型細胞因子和抗體IgG2a產生28-29。而基因槍接種時，由于能將外源基因直接注人靶細胞內，質粒在靶細胞的內質網（EB）內膜上大量表達形成自噬體，后者和細胞漿中的胞內體(endosome)或溶酶體(1ysosome)融合，通過MHC類途徑激活CD+4T細胞，誘導IL-4、IL10等細胞因子和IgGl、IgE的產生。Chen等30通過構建pCMV980質粒(含編碼HCVl一980 aa的基因片段)體外轉染EB病毒轉化的BLCLs(B Lymphoblastiod Cell Lines)證實，BLCLs表達的內源性抗原是以MHCII類途徑誘導CD+4T細胞的活化，且活化過程需要B7/BB1的參與。3.2 免疫位點處參與免疫應答各細胞功能的探討 研究發(fā)現，在DNA疫苗的接種位點，不同的細胞行使不同的功能。K1inman等31把接種位點細胞分為二類：一類是可快速遷移的細胞(如一些髓源性的APC細胞)，另一類是不可遷移的組織細胞。它們在免疫應答時：可快速移動的細胞(如DC細胞)在初次應答中起重要作用，Condon32也證實免疫接種位點處被轉染的DC細胞在24h內可從皮膚移至引流區(qū)淋巴結；機體免疫應答的強弱和非遷移的表達抗原的組織細胞關系密切；可遷移細胞負責機體的免疫記憶。4. HCV DNA疫苗的安全性及前景 目前從國內外學者在HCV DNA疫苗的構建、免疫效應及安全性方面做的大量研究來看，雖未發(fā)現因使用DNA疫苗而引發(fā)腫瘤和自身免疫功能紊亂的報道，但也有若干問題值得關注：HCV DNA疫苗引起的機體免疫應答能否起到預防和清除HCV感染作用；鑒于細胞免疫應答可介導組織病理性損傷，HCV DNA疫苗誘發(fā)的CTL反應能否引起肝臟的病理學變化33；由于免疫對抗作用的限制尚不能構建來自多個不同HCV基因型的融合DNA疫苗34；HCV DNA疫苗能否引起機體產生免疫耐受；由于目前的研究大多僅局限于小鼠，其作用機制和靈長類動物之間還有很大的差異等等5. 問題與對策 綜上所述，HCV El、E2蛋白疫苗免疫黑猩猩后，在抗體達到高峰時，可預防同源性HCV感染，但能否預防異源性HCV感染以及當抗體滴度下降時是否還能預防同源性感染這些問題尚待研究?？笶2抗體，特別是抗HVRl抗體(NOB)具有中和HCV對靶細胞的結合作用，預示著有中和同源性HCV感染作用，但這一中和抗體具有高度特異性，對突變的HCV及HCV準種株沒有中和作用，而且蛋白類疫苗誘導產生的抗體能維持多久，也不甚清楚35。 以E2區(qū)為靶抗原的DNA疫苗構建物可有效地誘導抗體反應，誘導CTL反應的能力較弱；以C區(qū)為靶抗原的DNA疫苗誘導CTL反應的能力較強，激發(fā)抗體反應能力卻不如還E2靶抗原。C區(qū)基因與HBV包膜區(qū)基因結合疫苗，以及與表達Thl樣細胞因子(IL-2、IFN-等)基因結合構建的嵌合DNA疫苗免疫小鼠，既可產生高滴度的抗體反應，又可誘導明顯的脾細胞對HCV抗原增殖反應和CTL殺傷活性36，但這些研究結果有些還不能得出滿意的解釋。HCV疫苗研究在現有基礎上要有新的突破，至少應解決或著重研究以下幾個問題： (1)確定合理的HCV靶抗原。C區(qū)基