（中醫(yī)臨床基礎(chǔ)專業(yè)論文）苦碟子治療大鼠肝纖維的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

作者 紅志毒 日期 如 年f 月h 日 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)說明 本文了解貴陽中醫(yī)學(xué)院有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 即 學(xué) 校有權(quán)保留學(xué)位論文 允許學(xué)位論文被查閱和借閱 學(xué)校可以公布學(xué) 位論文的全部或部分內(nèi)容 可以采用復(fù)印 縮印或其他手段保存學(xué)位 論文 學(xué)?？筛鶕?jù)國家或貴州省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文 作者簽名 承矗 剪 導(dǎo)師簽名 孑矽雪 日期 弦厶年f 月 日 4 61 第二部分分析與討論 1 苦碟子討論 2 0 2 肝纖維化討論 2 0 3c c l 4 腹腔注射誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型 2 3 4 苦碟子對大鼠肝纖維化保護(hù)機(jī)理的探討 2 3 第三部分結(jié)論 2 5 第四部分問題與展望 2 6 參考文獻(xiàn) 附錄 附錄一圖片資料 3 0 附錄二英漢縮略名詞對照表 3 3 附錄三文獻(xiàn)綜述 3 4 附錄四致謝 5 3 附錄六五個(gè)人簡歷 5 4 l 3 5 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩七研究生學(xué)位論文 中文摘要 目的 通過測定肝臟纖維化大鼠刪p 一1 t i m p 1 在肝臟組織中的表達(dá)及各組血清 p c i i i 水平 并對苦碟子 大黃蟪蟲丸抗肝纖維化進(jìn)行療效比較 闡明苦碟子對纖 維化肝臟e c m 的降解作用 對苦碟子的抗肝纖維化效果可以有更為確切的認(rèn)識 方法 選取體重1 6 0 一 2 3 0 9w i s t a r 雄性大鼠6 0 只 隨機(jī)分為5 組 除正常對照組 外 其余4 組均采用4 0 c c l 橄欖油溶液腹腔注射聯(lián)合2 0 酒精灌胃造模 共8 周 造模成功后 治療組給予腹腔注射大劑量苦碟子注射液 小劑量苦碟子注射 液 對照組灌服大黃蠊蟲丸 于1 2 周末在股動脈處取血 留取離心血清 檢測 p c i i i 水平 取血后處死大鼠 制各肝組織病理標(biāo)本 應(yīng)用免疫組化法測定肝組織 m m p l t i m p 一1 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測得各組數(shù)據(jù)應(yīng)用s p s s l 3 0 統(tǒng)計(jì)軟件處理 多個(gè) 樣本均數(shù)比較用單因素方差分析 兩兩比較用l s d 法 結(jié)果 l 苦碟子小劑量組與模型對照組血清p c i i i 水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 除次而 外 其余各組血清p c i i 水平 低于模型對照組 2t n p l 在模型對照組表達(dá)顯著高于正常對照組 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 各治 療組與模型組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 3t i m p 1 在模型對照組表達(dá)顯著高于正常對照組 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 苦碟 子大劑量組和大黃蟄蟲丸組與模型對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 4m m p 1 t i m p 1 在模型對照組表達(dá)顯著高于正常對照組 有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義 苦碟子大劑量組和大黃蟄蟲丸組與模型對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)表明 苦碟子注射液能降低血清p c i i i 含量 減輕肝組織的纖維化程 度 且苦碟子注射液抗肝纖維化效果有量效關(guān)系 苦碟子能降低纖維化肝臟 t i m p 1 的表達(dá) 使得m m p 一1 效應(yīng)相對增強(qiáng) 有效增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)分解效應(yīng) 促 進(jìn)肝臟纖維組織降解 表明苦碟子注射液逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用與其抑制t i m p 一1 表達(dá)有關(guān) 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩十研究生學(xué)位論文 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 a b s t r a c t p u r p o s e t h r o u g hd e t e r m i n a t i o nl i v e rf i b r o s i sb i gm o u s em m p 一1 t i m p li nt h e l i v e ro r g a n i z a t i o n se x p r e s s i o n a n dt ot h eh e r bo fs o w t h i s t l e l e a fi x e r i s t h ec h i n e s er h u b a r bz h e c h o n gp i l la n t i i i v e rf i b r o s i s c a r r yo nt h e c u r a t i v ee f f e c tc o m p a r i s o n e x p o u n d e dt h a tt h eh e r bo fs o w t h i s t l e l e a f h e r i st ot h ef i b r o s i s1i v e re c md e g e n e r a t i o nf u n c t i o n m a yh a v eam o r e a c c u r a t eu n d e r s t a n d i n gt oh e r bo fs o w t h i s t l e l e a fh e r i s sa n t i i i v e r f i b r o sise f f e c t m e t h o d s s e l e c t i o nb o d yw e i g h t1 6 0 2 3 0 9w i s t a rm a l eg e n d e rb i gm o u s e6 0 d i v i d e i n t o5g r o u p ss t o c h a s t i c a l l y b e s i d e st h en o r m a lc o n t r o lg r o u p o t h e r4 g r o u p su s et h e4 0 c c l 4o l i v eo i ls o l u t i o na b d o m i n a lc a v i t yi n j e c t i o nt o u n i t e2 0 e t h y la l c o h o l st of i l lt h es t o m a c ht om a k et h em o l d a l t o g e t h e r 8w e e k s a f t e rm a k i n gt h em o l ds u c c e s s t h et r e a t m e n tg r o u pg i v e st h e a b d o m i n a lc a v i t yi n j e c t i o nl a r g ed o s e h e r bo fs o w t h i s t l e l e a fi x e r i s i n o c u l a ti o nf l u i d t h es m a l ld o s a g eo fh e r b o fs o w t h i s t l e l e a fi x e r is i n o c u l a t i o nf l u i d t h ec o n t r o lg r o u pf i l l st h ec l o t h i n gc h i n e s er h u b a r b z h e c h o n gp i l l i n1 2w e e k e n dd r a w sb l o o di nt h ef e m o r a la r t e r yp l a c e r e m a i n st a k e st h ec e n t r if u g a lb l o o ds e r u m e x a m i n e sp c i i i t h el e v e l a f t e r d r a w i n gb l o o d e x e c u t e st h eb i gm o u s e p r e p a r e st h el i v e ro r g a n i z a t i o n p a t h o l o g ys p e c i m e n t h ea p p li c a t i o n i m m u n it y g r o u p r e d u c t i o n d e t e r m i n a t i o n1 i v e ro r g a n i z e sm m p 1 t i m p 一1 a 1 1e m p i r i c a ld a t u mo b t a i n s e a c hg r o u po fd a t at oa p p l ys p s s l 3 0s t a t i s t i c ss o f t w a r ep r o c e s s i n g m a n y s a m p l em e a nv a l u ec o m p a r i s o nw i t ht h es i n g l ef a c t o rv a r i a n c ea n a l y s i s 2 2c o m p a r is o n su s e st h el s dl a w r e s u l t s 1h e r bo fs o w t h i s t l e l e a fi x e r i ss m a 1 1m o n i t o r i n gt e a ma n d m o d e l c o n t r o lg r o u pb l o o ds e r u mp c i i i t h eh o r iz o n t a ld if f e r e n c ed o e sn o th a v e s t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e e x c e p tt i m e b u to u t s i d e o t h e re a c hg r o u po f b l o o ds e r u mp c i i i t h el e v e l i s1 0 w e rt h a nt h em o d e l c o n t r o lg r o u p 2m m p 一1e x p r e s s e si nt h em o d e lc o n t r o lg r o u po b v i o u s l yi sh i g h e rt h a n t h en o r m a l c o n t r o lg r o u p h a st h er e m a r k a b l e s t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e b e t w e e ne a c ht r e a t m e n tg r o u pa n dt h em o d e lg r o u pd o e sn o th a v es t a t i s t i c s s i g n if i c a n c e 3t i m p 一1e x p r e s s e si nt h em o d e lc o n t r o lg r o u po b v i o u s l yi sh i g h e rt h a n t h en o r m a lc o n t r o lg r o u p h a st h er e m a r k a b l es t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e h e r bo fs o w t h i s t l e l e a fi x e r i sb i gm o n i t o r i n gt e a ma n dt h ec h i n e s er h u b a r b h i b e r n a t i o no fi n s e c t si n s e c tp i l lg r o u pa n dt h em o d e lc o n t r o lg r o u ph a s s t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e 4m m p 一1 t i m p 一1e x p r e s s e si nt h em o d e lc o n t r o lg r o u po b v i o u s l yi s h i g h e rt h a nt h en o r m a l c o n t r o lg r o u p h a st h er e m a r k a b l e s t a t i s t i c s s i g n i f i c a n c e t h eh e r bo fs o w t h i s t l e l e a fh e r i sb i gm o n i t o r i n gt e a ma n d 3 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩 f j 研究生學(xué)位論文 t h ec h i n e s er h u b a r bh i b e r n a t i o no fi n s e c t si n s e c tp i l lg r o u pa n dt h em o d e l c o n t r o lg r o u ph a ss t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e c o n c l u s i o n t h i se x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h eb i t t e rd i s hi n o c u l a t i o nf l u i dc a n r e d u c eb l o o ds e r u mp c h i t h ec o n t e n t r e d u c e st h ef i b r o s isd e g r e ew h i c ht h e 1 i v e ro r g a n i z e s a n dt h eh e r bo fs o w t h i s t l e l e a fh e r i si n o c u l a t i o nf l u i d a n t i 一1 i v e rf i b r o s i se f f e c th a st h eq u a n t i t ye f f e c tr e l a t i o n s t h eh e r b o fs o w t h i s t l e l e a fi x e r i sc a nr e d u c ef i b r o s i s1 i v e rt i m p it h ee x p r e s s i o n c a u s e st h em m p 一1e f f e c tr e l a t i v ee n h a n c e m e n t s t r e n g t h e n st h e e x t r a c e l l u l a rm a t r i xd e c o m p o s i t i o ne f f e c te f f e c t i v e l y p r o m o t e st h e 1i v e rf i b e rs t r u c t u r et o d e g r a d e i n d i c a t e dt h a tt h e h e r bo f s o w t h i s t l e l e a rh e r i si n o c u l a t i o nf l u i dr e v e r s a l1 i v e rf i b r o s i st h e f u n c t i o n s u p p r e s s e st h et i m p 1e x p r e s s i o nw i t hi tt oc o n c e r n t h i s e x p e r i m e n tu n i f i e sp r e l i m i n a r yt e a c h e rt h eg r o u pt h ew o r k p r o m p t st h e h e r bo fs o w t h i s t l e l e a fh e r i si n o c u l a t i o nf l u i dt r e a t m e n t1 i v e rf i b r o s i s i sac o m b i n e da c t i o ne f f e c t i t sf u n c t i o nm e c h a n i s mp o s s i b l yi s 1 o p p r e s s e s a n t i h s c t h ea c t i v a t i o nm u l t i p l i c a t i o n r e d u c e se c m t h e p r o d u c t i o n 2s u p p r e s s e st i m p 一1t h ep r o d u c t i o no rm a k e si t sd e g e n e r a t i o n t oi n c r e a s e d i s p l a y st os u p p r e s st h er e d u c t i o nt om m p 一1 t h u sp r o m o t e s t h ee c md e g e n e r a tio n k e y w o r d s h e r bo fs o w t h i s t l e l e a fi x e r i s1 i v e rf i b r o s i sb i gm o u s e m m p 一1t i m p 1 4 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文 引言 目前認(rèn)為 肝纖維化見于肝炎病毒 酒精 藥物 血吸蟲等原因引起的大 多數(shù)慢性肝病 是肝臟的創(chuàng)傷愈合反應(yīng) 表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì) e x t r a c e l l u l a r m a t r i x c e c m 異常增生和降解不足 更大程度上是由于降解減少引起的 這 種以e c m 異常過度沉積為主要特征的病理變化 將改變正常肝組織的結(jié)構(gòu)和功 能 并且是一動態(tài)過程 在正常狀態(tài)下 基質(zhì)生成沉積與降解保持動態(tài)平衡 在 各種刺激因子作用下 當(dāng)基質(zhì)沉積速度大于降解時(shí) 即可發(fā)生肝纖維化 1 肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理過程 流行病學(xué)資料顯示 慢 性乙型肝炎發(fā)展為肝硬化的估計(jì)年發(fā)生率為2 1 6 因此 抗肝纖維化是慢性 肝病的重要治療方法 肝纖維化是機(jī)體對慢性肝臟損傷的修復(fù)反應(yīng) 是一種主動 性的基質(zhì)增生過程 在病理機(jī)制上 闡明肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)在于肝星狀 細(xì)胞的活化 生化學(xué)基礎(chǔ)在于e c m 成分代謂j 失衡 生成大于降解 在治療學(xué)上 證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝硬化都是可逆的 理論上 通過多種途徑 如消除 致病因素及各種刺激因子 或抑制各種細(xì)胞外基質(zhì)的活化 促進(jìn)其降解等 可以 阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生口1 苦碟子為菊科 c o m p o s i t a t e 苦賣菜屬植物抱莖苦賣菜的當(dāng)年生干燥全草 臨床研究表明苦碟子具有抗病毒 抗炎 抗腫瘤h 1 調(diào)節(jié)免疫 升白細(xì)胞 活血 化瘀 改善心肌供血哺1 的作用 苦碟子提取物能提高磷脂膜的穩(wěn)定性和流動性 有很強(qiáng)的生物活性 3 可以促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù) 降低轉(zhuǎn)氨酶 減輕肝細(xì)胞 的壞死和炎癥口3 同時(shí) 可以增加膽汁流速 消退黃疸 抗肝纖維化 導(dǎo)師課 題組前期的動物實(shí)驗(yàn)阻1 及臨床觀察證實(shí)了苦碟子活血化瘀 清瘀散結(jié)的功能 苦 碟子能通過保護(hù)肝纖維化大鼠的肝細(xì)胞 明顯減輕其肝細(xì)胞損傷 從而減少肝纖 維化發(fā)生的始動因素 保護(hù)肝細(xì)胞免于進(jìn)一步受損及纖維化的發(fā)展阻1 本實(shí)驗(yàn)研 究建立w i s t a r 大鼠c c l 腹腔注射聯(lián)合酒精灌胃復(fù)合因素誘導(dǎo)肝纖維化模型 采用 病理學(xué) 血清學(xué) 免疫組化聯(lián)合檢測方法研究苦碟子對肝纖維化大鼠的影響 重 點(diǎn)觀察m m p 一1 t i m p 1 研究苦碟子促膠原纖維降解和肝纖維組織重吸收的作用 機(jī)制 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) 苦碟子具有對肝纖維化確切的治療作用 抑制肝星狀 細(xì)胞的增殖 促進(jìn)金屬基質(zhì)酶的分泌 同時(shí)可抑制其抑制劑的產(chǎn)生 阻止e c m 的 形成 為人類開發(fā)具有治療肝纖維化的臨床用藥提供科學(xué)的依據(jù) 貴陽中醫(yī)學(xué)院顧十研究生學(xué)位論文 第一部分實(shí)驗(yàn)研究 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法 1 1 實(shí)驗(yàn)材料 1 1 1 實(shí)驗(yàn)動物及飼料 實(shí)驗(yàn)動物 雄性w i s t a r 清潔級大鼠7 0 只 其中預(yù)實(shí)驗(yàn)用1 0 只 體重 2 0 6 1 5 9 正式實(shí)驗(yàn)用6 0 只 體重2 0 8 1 3 9 大鼠由山東魯抗醫(yī)藥有限公司實(shí) 驗(yàn)動物室提供 動物實(shí)驗(yàn)合格證 s c x k 魯 2 0 0 8 0 0 0 2 飼料 大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料 由濟(jì)寧市中區(qū)魯元飼養(yǎng)動物經(jīng)營部提供 批 號 2 0 0 4 0 0 1 4 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均自由飼食 飲用自來水 1 1 2 主要藥物及試劑 苦碟子注射液 沈陽雙鼎制藥有限公司生產(chǎn) 批號 0 5 0 2 0 3 1 9 大黃蠊蟲丸 廣東恒誠制藥有限公司 批號 2 0 0 7 0 3 2 1 c c l 分析純 上海三浦化工有限公司生產(chǎn) 批號 2 0 1 2 0 3 橄欖油 上?；瘜W(xué)試劑分裝廠生產(chǎn) 批號 2 0 1 0 1 3 c c l 和橄欖油以4 6 的比例充分混勻 每次造模前配好待用 乙醇 分析純 重東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠生產(chǎn) 批號 2 0 0 7 0 1 i 0 甲醛 分析純 重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠生產(chǎn) 批號 2 0 0 7 0 3 2 0 t i m p i 刪p 一1 小鼠抗大鼠抗體 s a b c 試劑盒及d a b 顯色試劑盒 購自北京 博奧森試劑有限公司 批號 2 0 0 7 0 7 1 1 1 1 3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 l d r 4 4 8 型離心機(jī) 一2 0 超低溫保存箱 z s 2 板式酶標(biāo)儀 d e m i l l 型自動酶標(biāo)計(jì)數(shù)機(jī) 電熱恒溫水浴箱h h w 21 c u 6 0 0 9 6 孔e i a 聚苯乙烯塑料扳 3 5 9 0 j j 2 0 0 型精密電子天平 d w 8 6 l 3 8 6 8 6 7 0 超低溫保存箱 微量移液器 l e i c a r m 2 1 3 5 型切片機(jī) o l y m p u sa h 一2 型顯微鏡 6 北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn) 丹麥制造 北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司 北京拓普所儀器有限公司 上海醫(yī)療器械廠生產(chǎn) c o r n i n gc o m p a n y u s a 日本s a n y o 公司 青島海爾特種電器有限公司 上海求精生化試劑儀器有限公司生產(chǎn) 上海徠卡儀器有限公司 日本o l y m p u s 公司生產(chǎn) 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文 其它輔助設(shè)備 如電子體重計(jì) 電子天平 研缽 冰箱 臺式干燥箱 量筒 試 管 5 毫升和l 毫升注射器等 1 2 實(shí)驗(yàn)方法 1 2 1 復(fù)合因素誘導(dǎo)w i s t a r 大鼠肝纖維化模型建立 1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 1 0 只清潔級w i s t a r 雄性大鼠 平均體重2 0 6 1 5 9 按照文獻(xiàn)采 用4 0 c c l 橄欖油溶液腹腔注射造模 劑量0 1 5 m l l o o g 每周2 次 首次劑量 加倍 同時(shí)給予2 0 乙醇l m l l o o g 灌胃 隔日1 次 2 正式實(shí)驗(yàn)造模方法 腹腔注4 0 c c l 橄欖油溶液 劑量0 1 5 m l l o o g 體重 2 次 周 首次劑量未加倍 并從實(shí)驗(yàn)第2 周開始給大鼠用2 0 酒精灌胃 劑量 l m l l o o g 體重 隔天1 次造模 實(shí)驗(yàn)至第6 周 每周末從造模動物中隨機(jī)抽取2 只模型組大鼠及1 只正常組大鼠處死 作肝纖維化病理學(xué)檢查判斷肝纖維化程 度 造模共8 周 1 2 1 1 動物分組 6 0 只w i s t a r 大鼠 隨機(jī)分為正常對照組 n 1 1 和模型 組 n 4 9 8 周末 取肝臟標(biāo)本 經(jīng)病理切片證實(shí)已形成肝纖維化 在整個(gè)造 模過程中大鼠自然死亡6 只 處死模型組大鼠6 只和正常組大鼠3 只 造模結(jié)束 時(shí) 正常對照組剩大鼠8 只 模型組剩大鼠3 7 只 1 2 1 3 用藥分組 將模型組3 7 只大鼠隨機(jī)分成模型對照組 苦碟子大劑量組 苦碟子小劑量組 大黃蠊蟲丸組 進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn) 正常對照組 8 只 腹腔注射蒸餾水2 m l 次 2 次 周 連續(xù)8 周 8 周后開始 灌服生理鹽水 劑量為l o m l k g 每日一次 共4 周 模型對照組 m 9 只 造模結(jié)束同時(shí)開始灌服生理鹽水 劑量為l o m l k g 每 日一次 共4 周 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死 苦碟子注射液治療給藥組 造模結(jié)束同時(shí)開始腹腔注射 苦碟子大劑量組 z z 1 0 只 給藥劑量為0 4 m l l o o g 腹腔注射 以上治療組均為每日一次 共4 周 苦碟子小劑量組 z d 9 只 給藥劑量為苦碟子注射液0 2 m l l o o g 將原液用生理 鹽水稀釋一倍 腹腔注射 大黃蟪蟲丸治療組 z q 9 只 造模結(jié)束同時(shí)開始灌服大黃蠊蟲丸 劑量為 0 3 9 l o o g 每日一次 共4 周 7 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 各組于末次給藥2 4 小時(shí)后處死動物 處死前給予1 0 水和氯醛0 3 5 m l l o o g 腹腔注射麻醉 用注射器抽取股動脈血液3 m l 4 靜置2 h 2 0 0 0 r m i n 離心1 5 m i n 血清保存于 7 0 保存箱 以檢測肝纖維化指標(biāo)p c i i i 取血后處死取肝同一部位 組織 用以制備病理光鏡觀察標(biāo)本 免疫組化法測定肝臟m m p 一1 t i m p l 表達(dá)水 平 1 2 2 觀察指標(biāo) 一般情況 精神 飲食 活動 體重 毛色 每周末稱重一次 1 3 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 1 3 1 肝臟肉眼觀察 1 3 2 h e 染色 1 3 2 1 肝組織石蠟切片及病理分期標(biāo)準(zhǔn) 處死動物 取出肝臟 用冷生理鹽水沈去浮血 拭干 取肝右葉組織 于 1 0 中性甲醛固定 肝組織纖維化病理學(xué)分級參照 肝纖維化診斷及診療評估共 識 m 1 肝纖維化程度分5 期 s 期 匯管區(qū)無明顯纖維組織 s 期 匯管區(qū)和 匯管區(qū)周圍纖維化及纖維隔形成或小葉內(nèi)小纖維瘢痕 s 期 匯管區(qū)纖維組織增 生 纖維間隔形成 呈窄帶狀 并向肝小葉內(nèi)伸展 小葉結(jié)構(gòu)保留 s 期 匯管 區(qū)有大量纖維組織增生 纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂 無肝硬化 s 期 結(jié)締組織 廣泛增生 假小葉形成早期肝硬化 見表1 1 3 2 2h e 染色方法 組織固定于1 0 中性甲醛溶液 常規(guī)脫水包埋 組織切片脫蠟至水 用e h r li c h 氏蘇木素液染1 5 m i n 用流水沖洗 1 鹽酸酒精分色 至肉眼觀察組織呈粉紅色 氨酒精蘭化 至顯微鏡下見細(xì)胞核成藍(lán)色即可 蒸餾水稍沈 0 5 伊紅y 水溶液中3 r a i n 蒸餾水稍洗 各級酒精脫水 二甲苯透明 中性樹膠封固 1 3 2 3 染色結(jié)果 細(xì)胞核呈藍(lán)黑色 細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色 1 3 3 免疫組織化學(xué)染色觀察 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 染色方法 常規(guī)脫蠟至水 滴加3 檸檬酸新鮮稀釋 蒸餾水洗3 次 滴加 5 牛血清白蛋白 b o v i n es e r u ma l b u m i n b s a 封閉液 室溫2 0 分鐘 甩去多 余液體 5 1 0 正常山羊血清封閉液 p b s 稀釋液 5 0 u l 同上洗滌 滴加生物 素化山羊抗小鼠i g g 于3 7 c 溫箱中孵育2 0 分鐘 同上洗滌 滴加鏈酶抗生物素 一生物素 s t r e p ta v i d i n b i o t i nc o m p l e x s a b c 試劑室溫孵育2 0 分鐘 磷酸 鹽緩沖液 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p b s 洗4 次 每次5 分鐘 新鮮配置 的d a b d i a m i n o b e n z i d i n e 顯色 顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)問 終止反應(yīng) 蒸餾水 洗 1 3 3 1 免疫組化染色步驟 1 3 3 1 1 肝組織m m p 一1 表達(dá) 將各組石蠟切片貼于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上 烤箱中烤片l 小 時(shí) 石蠟切片脫蠟至水 3 雙氧水室溫孵育1 0 分鐘 以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 蒸餾水沖洗 0 0 1 m 枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù) 冷卻后p b s 浸泡 5 分鐘 p b s 稀釋液封閉 室溫孵育1 0 分鐘 傾去血清 勿洗 滴加適當(dāng)比例稀 釋的一抗 稀釋倍數(shù)1 i 0 0 以p b s 稀釋液代替一抗作為陰性對照 4 冰箱過 夜 p b s 稀釋液沖洗 5 分鐘 3 次 滴加生物素標(biāo)記二抗工作液 3 7 c 孵育 3 0 分鐘 p b s 稀釋液沖洗 5 分鐘 3 次 滴加m m p l 工作液 3 7 c 孵育3 0 分鐘 o p b s 稀釋液沖洗 5 分鐘 3 次 d a b 顯色劑顯色 自來水充分沖洗 蘇木素復(fù)染 脫水 透明 封片 顯微鏡下觀察 1 3 3 1 2 肝組織t i m p 1 表達(dá) 將各組石蠟切片貼于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上 烤箱中烤片1 小 時(shí) 石蠟切片脫蠟至水 3 雙氧水室溫孵育1 0 分鐘 以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 蒸餾水沖洗 0 o i m 枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù) 冷卻后p b s 浸泡 5 分鐘 9 表達(dá)出現(xiàn)于匯管區(qū)血管壁和膽管壁的上皮細(xì)胞 肝細(xì)胞胞漿也有部分表達(dá) t i m p i 的陽性表達(dá)主要集中在匯管區(qū)血管壁和膽管壁上皮細(xì)胞以及周圍的間質(zhì) 細(xì)胞 此外 部分肝細(xì)胞的胞漿也有著色 其表達(dá)隨肝組織炎癥及纖維化程度增 加而增強(qiáng) 1 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用s p s s l 3 0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 大鼠體重定量指標(biāo)用單因素方差 分析 并用l s d 法進(jìn)行兩兩比較 相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果以x s 表示 大鼠刪p 一1 與t i m p i 免疫組織化學(xué)染色計(jì)數(shù)觀察用的s p s s l 3 0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng) 計(jì)的單因素方差分析s n k 檢驗(yàn) 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2 1w i s t a r 大鼠肝纖維化模型 2 1 1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 造模1 周后 大鼠開始體重下降 眼分泌物增多 毛色暗淡 精神萎靡 肢 體抽動 稀便 造模第二天后大鼠就陸續(xù)有死亡 2 周后 僅存活3 只大鼠 死 亡率達(dá)7 0 2 1 2 改進(jìn)造模方法結(jié)果 在總結(jié)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上 對造模方法進(jìn)行改進(jìn) 清潔級w is t a r 雄性大 鼠6 0 只 平均體重2 0 8 1 3 9 喂養(yǎng)2 周后 平均體重達(dá)2 5 4 1 9 9 開始造模 其中1 1 只為正常組 4 9 只為肝纖維化模型組 造模劑量為0 1 5 m l l o o g 每周 1 0 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文 2 次 首次劑量未加倍 并從實(shí)驗(yàn)第2 周開始給大鼠用2 0 酒精灌胃i m l l o o g 體重 隔天1 次造模 造模共8 周 大鼠注射c c l 后 煩躁不安 相互攻擊 造模第1 周 模型組動物出現(xiàn)精神不振 進(jìn)食量減少 造模2 周后 大鼠開始出 現(xiàn)精神萎靡 活動減少 被毛蓬松 污穢 大便稀溏 呃逆 造模6 周 大鼠被 毛蓬松 污穢 毛色暗淡 眼睛無神 鼻 唇 耳 尾無光澤 蜷臥少動 個(gè)別 大鼠行走時(shí)左右搖擺 甚至不能站立 肢體抖動 呼吸頻速 消瘦 厭食 體重 增長慢 大便稀 8 周末取肝臟標(biāo)本 證實(shí)已形成肝纖維化 2 2 肝纖維化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2 2 1 一般狀態(tài) 正常組一般狀態(tài)良好 活動如常 毛發(fā)白色有光澤 飲食量正常 體重增加 良好 除正常組以外的各組大鼠在造模期間均出現(xiàn)被毛松弛紊亂 毛色暗淡 消 瘦 厭食 懶動等表現(xiàn) 模型組大鼠隨著給藥時(shí)間延長活動逐漸減少 毛發(fā)蓬亂 光澤變暗 毛色變黃 精神萎靡 攝食減少 消瘦明顯 喜臥 尿色黃 時(shí)有腹 瀉 嚴(yán)重者有腹部膨隆 上消化道出血 苦碟子大劑量組和大黃蠊蟲丸組大鼠隨 著治療期的延長 體重 精神 飲食等情況恢復(fù)良好 毛色較好 體重較重 活 動正常 苦碟子小劑量組攝食 精神 體重恢復(fù)相對較慢 2 2 2 體重情況 正常對照組大鼠1 2 周末體重為 3 8 6 1 7 g 模型對照組1 2 周末體重為 2 8 7 1 7 g 與正常對照組比較差異有顯著性 p o 0 1 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束 苦碟子大劑量 組 苦碟子小劑量組 大黃蟪蟲丸組一般狀態(tài)明顯好于模型對照組 這3 組大鼠 體重分別為 3 5 1 1 3 g 3 2 0 1 3 g 3 1 8 1 2 g 與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異 p o 0 1 苦碟子大劑量組與苦碟子小劑量組 大黃蟪蟲丸組1 2 周體重比 較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 1 苦碟子小劑量組和大黃蟪蟲丸組相比較 1 2 周的大鼠體重增加不明顯 但3 個(gè)治療組1 2 周大鼠體重均低于正常對照組大鼠 體重 p 0 0 1 見表2 見圖1 試驗(yàn)結(jié)束后 正常對照組大鼠體重較造模前增加 1 2 7 2 g 模型對照組體 重增加 3 4 8 g 苦碟子大劑量組 苦碟子小劑量組 大黃蠊蟲丸組大鼠體重分 別增加 9 7 2 7 g 4 7 2 3 g 6 7 2 3 g 治療組體重增加水平與正常對照組 相比較 體重增加水平均低于正常對照組 p o 0 1 苦碟子大劑量組 大黃蟪蟲 貴阿1 中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 丸組均優(yōu)于模型對照組大鼠體重增長水平 p o 0 5 苦碟子大劑量組與苦碟子小劑量組 大黃蟪 蟲丸組體重增加水平比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 1 苦碟子小劑量組大鼠體 重增長水平低于大黃蠊蟲丸組 p o 0 5 見表3 見圖2 2 2 3 大鼠血清p c i i i 水平 血清p c i i i 水平在正常對照組中的表達(dá)顯著低于模型對照組 p o 0 1 苦 碟子大劑量組的大鼠血清p c i i i 水平低于模型對照組 t 2 0 0 5 大黃蠊蟲丸組的 大鼠血清p c i i i 水平低于模型對照組 p o 0 5 見表4 見圖3 2 3 苦碟子對c c l 肝纖維化大鼠肝組織病理學(xué)的影響 2 3 1 肝臟肉眼觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后 處死大鼠解剖觀察肝臟 正常組大鼠肝臟顏色鮮紅 表面光滑 質(zhì)地柔軟 與周圍組織無粘連 易于分離 模型組大鼠肝臟色澤暗紅 肝組織表 面光澤度下降 淤血 體積多正常 部分大鼠肝臟體積增大 邊緣不規(guī)則 變鈍 質(zhì)韌 硬 粗糙 表面有顆粒樣增生 局部與周圍組織粘連明顯 不易分離 左 右葉分葉不清晰 苦碟子大劑量組與大黃蟪蟲丸組肝組織顏色較紅 表面光澤度 姣好 質(zhì)稍韌或較柔軟 表面偶有細(xì)沙粒狀增生 與周圍組織粘連不明顯 肝臟 左右葉分葉清晰 苦碟子大劑量組 大黃蛾蟲丸組大鼠肝臟在色澤 質(zhì)地 大小 及表面光滑度較模型對照組有明顯改善 苦碟子小劑量組肝臟色澤晦暗 表面粗 糙 部分大鼠肝臟表面有小結(jié)節(jié) 肝臟邊緣變鈍 厚 質(zhì)地較韌 與周圍組織粘 連不明顯 比模型對照組略有好轉(zhuǎn) 2 3 2 肝組織病理組織學(xué)染色結(jié)果觀察 病理切片正常組大鼠h e 染色肝細(xì)胞多呈單核 大小正常 肝小葉結(jié)構(gòu)j 下常 分界明顯 無變性 壞死 無炎性細(xì)胞浸潤 肝細(xì)胞索以肝小葉中央靜脈為中心 呈放射樣排列 匯管區(qū)見少許極為纖細(xì)的網(wǎng)狀纖維 門脈間少有纖維分布 根據(jù) 評分標(biāo)準(zhǔn)均為o 級 見附圖1 模型組大鼠h e 染色表現(xiàn)出嚴(yán)重的損傷性病理改變 肝小葉失去正常結(jié)構(gòu) 肝細(xì)胞索排列紊亂 肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛氣球樣變及脂肪變 匯管區(qū)及中央靜脈周圍 可見大量炎性細(xì)胞浸潤 肝細(xì)胞壞死明顯 匯管區(qū)纖維組織大量增生 并可見厚 薄不一的纖維分隔包繞肝小葉 部分有肝細(xì)胞再生及假小葉形成 根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn) 1 2 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩十研究生學(xué)位論文 均為3 4 級 見附圖2 大黃蟪蟲丸組和苦碟子大劑量組大鼠多數(shù)可見肝細(xì)胞呈脂肪樣變 僅見輕度 匯管癥 少量碎屑樣壞死 少數(shù)見匯管區(qū)及周圍中度碎屑樣壞死 小葉內(nèi)見架橋 壞死 纖維結(jié)締組織增生程度減輕 未見完整假小葉形成見附圖4 圖5 總體 狀況較模型組有明顯好轉(zhuǎn) 并且苦碟子大劑量比大黃摭蟲丸組好轉(zhuǎn)更顯著 苦碟 子小劑量組與模型組相比有輕微改善 見附圖3 2 3 3 各組大鼠肝組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 采用h p i a s 一1 0 0 0 型全自動彩色病理圖像分析系統(tǒng) 在2 0 0 倍光鏡下測量每個(gè) 顯示屏的陽性染色面積和染色強(qiáng)度 積分光密度 陽性染色面積和染色強(qiáng)度值的 高低能反映i m p 一1 和t i m p 一1 表達(dá)水平 陰性對照片背景潔凈 無非特異性著色 2 3 3 1 各組大鼠砌p 一1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果觀察 m i p 一1 在正常肝組織中表達(dá)微弱 模型對照組表達(dá)強(qiáng)于正常對照組 主要出 現(xiàn)于匯管區(qū)血管和膽管周圍的間質(zhì)細(xì)胞 肝竇周圍細(xì)胞亦有散在的陽性著色 纖 維化肝組織中著色除上述區(qū)域外 主要集中于纖維板及匯管區(qū) 分別見附圖6 1 0 唧p 一1 在模型對照組表達(dá)顯著高于正常對照組 尸 0 0 1 m m p 一1 在苦碟子大 劑量組表達(dá)高于模型對照組 但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 5 m m p 一1 在大黃蠊蟲 丸組表達(dá)高于模型對照組 但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 5 苦碟子大劑量組 大 黃蟄蟲丸組m m p 1 差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 5 見圖4 見圖5 2 3 3 1 各組大鼠t i m p 1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果觀察 t i m p 1 在正常肝組織中有弱陽性表達(dá) 僅見于個(gè)別間質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞的胞 漿內(nèi) 模型對照組t i m p 1 表達(dá)明顯增強(qiáng) 集中于纖維隔 匯管區(qū)和肝細(xì)胞變性 壞死區(qū)域 在小葉內(nèi)也大量散在分布 實(shí)驗(yàn)大 小劑量組及藥物對照組t i m p 一1 表達(dá)亦有增強(qiáng) 多呈散在分布 與模型對照組相比有顯著性差異 分別見附圖 1 1 1 5 t i m p 1 水平在模型對照組中的表達(dá)與正常對照組有顯著性差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義 p o 0 1 t i m p 1 水平在苦碟子大劑量組的表達(dá)與模型對照組有顯著性差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 1 t i m p 一1 水平在大黃蟄蟲丸組的表達(dá)與模型對照組有差 異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 尸 0 0 5 見圖6 見圖7 本實(shí)驗(yàn)還對m m p 一1 t i m p 一1 比值進(jìn)行了分析 發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的不斷增強(qiáng) 1 3 貴l 兀中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 刪p 一1 t i m p 1 比值和肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān) 提示在肝纖維化的發(fā)生過程中 姍p 一1 變化相對不明顯 隨著肝纖維化的不斷進(jìn)展 t i m p 一1 表達(dá)明顯增強(qiáng) 使m m p 一1 相對不足 刪p 一1 t i m p l 的比值減少 m m p 1 受到抑制 導(dǎo)致e c m 的大量沉積 見表5 和圖8 刪p 一1 t i m p 一1 比值在模型對照組中的表達(dá)與正常對照組比較有顯著性差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 1 刪p 一1 t i m p 一1 比值在苦碟子大劑量組中的表達(dá)與模型 對照組有顯著性差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 1 m m p l t i m p 一1 比值在大黃蟄蟲 丸組中的表達(dá)與模型對照組有顯著性差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p o 0 1 表1 不同治療組的肝纖維化程度分級 表21 2 周末大鼠體重情況的比較 組別大鼠數(shù)量孑 s 正常對照組 83 8 6 1 7 模型對照組 92 8 7 1 7 苦碟子大劑量組 1 03 5 1 1 3 苦碟子小劑量組 93 2 0 1 3 大黃蠊蟲丸組 93 1 8 1 2 1 4 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文 圖1 1 2 周末大鼠體重情況 1 2 周木體重 5 0 0 4 0 0 一一木木 蘭 苧世 s3 0 0 惻2 0 0 一1 2 周末體重 i 0 0 一 料模型與正常組比較有顯著性差異 p 0 0 1 并各給藥組與模型組比較比較有顯著性差異 p o 0 1 表3 大鼠體重增加水平的比較 i s大鼠數(shù)量組別 正常對照組 8 1 2 7 2 9 3 4 8 模型對照組 1 0 9 7 2 7 苦碟子大劑量組 9 4 7 2 3 苦碟子小劑量組 9 6 7 2 3 大黃蟪蟲丸組 i 貴阿1 中醫(yī)學(xué)院碩十研究生學(xué)位論文 組別 np c i i i 正常對照組 模型對照組 8 9 4 9 0 5 7 2 1 9 5 3 2 1 2 3 5 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文 表5 各組大鼠m m p l t i m p 1 免疫組化及刪p 一1 t i m p 一1 注 與止常對照組比木p o 0 5 料p 0 0 1 與模型對照組比 p o 0 5 p o 0 1 圖4 各組大鼠刪p 一1 的免疫組化的陽性面積 u m 2 的比較 貴i 幾中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 圖5 各組大鼠m m p l 的免疫組化的積分光密度值的比較 1 9 貴陽中醫(yī)學(xué)院碩 研究生學(xué)位論文 第二部分分析與討論 1 苦碟子討論 苦碟子為菊科 c o m p o s i t a t e 苦賣菜屬植物抱莖苦賣菜的當(dāng)年生干燥全草 又名滿天星 主要分布于我國東北南部及東部的山區(qū) 半山區(qū)及興安嶺地 味苦 辛 性寒 具有涼血活血 清熱解毒 排膿止痛之功效 苦碟子化學(xué)成分比較復(fù) 雜 主要含倍半菇 三菇 黃酮 幽醇 香豆素等多種類型 提取和制劑方便 療效確切 已日益顯示出寶貴的藥用價(jià)值 苦碟子能顯著降低c c i 所致急性肝損傷大鼠血清中a l t a s t 含量 病理切片 示肝組織變性 壞死明顯減輕 1 苦碟子能促進(jìn)急性酒精性肝損傷大鼠的功能恢 復(fù) 降低血清a l t 及a s t 的活性 減輕肝細(xì)胞的炎癥 抗脂質(zhì)過氧化 提高肝內(nèi)抗 氧化酶s o d 及g s h 的活性 降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物m d a 的含量 提示苦碟子藥效的產(chǎn) 生可能是抑制肝內(nèi)氧自由基的生成 而且提高抗氧化機(jī)青r g s h 的防御作用 從而 產(chǎn)生較好的抗脂質(zhì)過氧化作用 改善了酒精導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化引發(fā)的一系列病理 反應(yīng) 達(dá)到防治酒精性肝損傷的目的 2 肝纖維化討論 肝纖維化的形成是一個(gè)多因素 多細(xì)胞參與的復(fù)雜過程 許多因素參與了該 過程的調(diào)節(jié) 2 1 膠原 肝臟纖維化進(jìn)程開始時(shí)時(shí) 膠原總量增加到正常時(shí)的3 到1 0 倍 膠原蛋白成 分和分布亦發(fā)生變化 膠原纖維遍及所有小葉 肝纖維化早期以i i i 型膠原增加為 主 肝硬化后期以i 型膠原增生為主 此階段i l l l 型比例可增至3 左右 p c i i i 反映肝內(nèi)i 型膠原的合成 是i i i 型前膠原前體 肝細(xì)胞炎癥和壞死導(dǎo)致 肝p c i i i 裂解增加 從而導(dǎo)致血清p c i i i 含量增高 其血清含量與肝纖維程度一致 并直接反映肝纖維化的形成及活躍程度 持續(xù)的p c i i i 升高的慢性活動性肝炎 提 示病情有進(jìn)展及向肝硬化發(fā)展的可能n 引 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c c l 腹腔注射聯(lián)合酒精灌胃復(fù)合因素誘發(fā)大鼠肝纖維化后 血清p c i i i 水平升高 與j 下常組形成顯著差異 說明膠原增生活躍 經(jīng)苦碟子治 療后其含量降低 以大劑量組最明顯 與模型組有差異 苦碟子大劑量效果優(yōu)于 苦碟子小劑量 苦碟子大劑量與抗肝纖維化的經(jīng)方大黃蠊蟲丸相比療效無明顯差 2 0 貴陽中