機(jī)能試驗(yàn)答案實(shí)驗(yàn) 《 轉(zhuǎn)載 僅供參考》.docx

實(shí)驗(yàn)一 小腸平滑肌生理特性的觀察與分析一,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)哺乳動(dòng)物離體腸標(biāo)本制備及灌流方法。 2. 觀察消化道平滑肌的一般生理特性及某些因素對(duì)舒縮活動(dòng)的影響。 二、實(shí)驗(yàn)原理 消化道平滑肌和骨骼肌、心肌一樣，也具有興奮性、傳導(dǎo)性和收縮性，有些也具有自律性。相比之下消化道平滑肌的興奮性低，收縮慢，伸展性大，具有緊張性收縮，對(duì)化學(xué)物質(zhì)、溫度變化及牽張刺激較敏感等特性。小腸離體后，置于適宜的溶液中，觀察其收縮活動(dòng)及環(huán)境變化的影響，觀察分析上述生理特性。三、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔 2、器械、藥品：電熱恒溫水浴鍋、浴槽、張力換能器(量程為25g以下)、BL-410生物記錄系統(tǒng)、L型通氣管、道氏袋、注射器、培養(yǎng)皿、溫度計(jì)、燒杯、螺絲夾、三維調(diào)節(jié)器、臺(tái)氏液、0.01%去甲腎上腺素、0.01%乙酰膽堿、1mol/L NaOH溶液、lmol/L HCl溶液、2%CaCl2溶液。四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟 1、標(biāo)本制備流程 2、儀器安裝及調(diào)試3、觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋1、標(biāo)本制備流程： 擊昏家兔剖開腹腔快速取出腸管制作離體腸標(biāo)本 擊昏家兔： 用木槌猛擊兔頭枕部，使其昏迷。 剖開腹腔快速取出腸管： 立即剖開腹腔，找出胃幽門與十二指腸交界處，快速取長2030cm的腸管，先將與該腸管相連的腸系膜沿腸緣剪去，置于供氧臺(tái)氏液中輕輕漂洗，把腸內(nèi)容物基本洗凈。 制作離體腸標(biāo)本： 將腸管分成數(shù)段，每段長2-3cm，兩端各系一條線，保存于供氧的38左右的臺(tái)氏液中2、儀器安裝與調(diào)試 實(shí)驗(yàn)安裝（如圖）：恒溫水浴鍋控制加熱，恒溫工作點(diǎn)定在38。將充滿氧氣的道氏袋與通氣鉤相連接，將腸段一端系在通氣管鉤上，另一端與張力換能器相連?？刂仆饬?，使氧氣從通氣管前端呈單個(gè)而不是成串逸出。 儀器調(diào)試：BL-410系統(tǒng)的使用，選擇“實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目”中的“消化實(shí)驗(yàn)”選中“消化道平滑肌生理特性”。相關(guān)參數(shù)設(shè)置的參考值：時(shí)間常數(shù)tDC，高頻濾波F30Hz，顯速4.00s/div，增益100g。用鼠標(biāo)左鍵單擊工具條上的“開始”按鈕，調(diào)節(jié)參數(shù)至波形幅度、密度適當(dāng)，待收縮曲線穩(wěn)定后，單擊記錄按鈕。觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋 1待標(biāo)本穩(wěn)定后，記錄小腸平滑肌收縮的對(duì)照曲線。 2乙酰膽堿的作用 用滴管吸入0.01%乙酰膽堿向灌流浴槽內(nèi)滴12滴。觀察到明顯效應(yīng)后，立即從排水管放出浴槽內(nèi)含乙酰膽堿的臺(tái)氏液，加入新鮮溫臺(tái)氏液，由此反復(fù)3次，以洗滌或稀釋殘留的乙酰膽堿，使之達(dá)到無效濃度，待小腸運(yùn)動(dòng)恢復(fù)后進(jìn)行下一項(xiàng)。 3腎上腺素的作用 按上述方法將0.01%腎上腺素加入浴槽內(nèi)12滴，觀察小腸運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)。當(dāng)效果明顯后，立即更換臺(tái)氏液。 4氯化鈣的作用 加2%CaC12溶液23滴入灌流浴槽內(nèi)，觀察其反應(yīng)，效果明顯后迅速?zèng)_洗。5鹽酸的作用 加12滴1mol/L HCl溶液入浴槽內(nèi)，觀察其反應(yīng)。 6氫氧化鈉的作用 在(5)基礎(chǔ)上加等容量的1mol/L NaOH溶液入浴槽內(nèi)，觀察其反應(yīng)。按上述方法更換臺(tái)氏液，反復(fù)沖洗。 7溫度的影響 將浴槽內(nèi)臺(tái)氏液放出，注入25臺(tái)氏液，觀察平滑肌收縮有何改變，當(dāng)效應(yīng)明顯后再換入38臺(tái)氏液，持續(xù)一段時(shí)間后，再換入42臺(tái)氏液，觀察收縮活動(dòng)的變化（亦可根據(jù)室溫的具體情況選做其中的一項(xiàng)）。五、注意事項(xiàng) 1. 實(shí)驗(yàn)過程中必須保證標(biāo)本的供氧(通氣)及浴槽內(nèi)臺(tái)氏液的恒溫(38)，以維持標(biāo)本活性。 2. 灌流浴槽內(nèi)的液面高度應(yīng)保持恒定。 3. 放大器零點(diǎn)調(diào)好后不要再移動(dòng)旋鈕，以免影響基線。 4. 上述各藥液加入的量系參考數(shù)據(jù)，效果不明顯者可以添加。 5. 每次實(shí)驗(yàn)效果明顯后立即放掉含藥液的臺(tái)氏液，并沖洗多次，以免平滑肌出現(xiàn)不可逆反應(yīng)。 6各項(xiàng)處理必須有處理標(biāo)記。六、相關(guān)知識(shí) 家兔小腸平滑肌以胃幽門與十二指腸交界處的腸管活動(dòng)最好，對(duì)生物化學(xué)因素也較敏感，所以選取用此處腸管作標(biāo)本。七、作業(yè) 1從記錄曲線中觀察比較小腸平滑肌與心肌、骨骼肌的收縮特性有何不同?說明其原理。 2通過觀察分析記錄曲線變化，闡明各項(xiàng)處理引起的收縮頻率、收縮強(qiáng)度和張力變化的機(jī)理。 3結(jié)合本章的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，談?wù)動(dòng)^察與思維在實(shí)驗(yàn)研究中作用與體會(huì)。八、實(shí)驗(yàn)討論： 1、正常情況下，我們觀察到離體小腸平滑肌在臺(tái)氏液中可以自動(dòng)地、緩慢地收縮，但其節(jié)律性很不規(guī)則。小腸平滑肌自律性產(chǎn)生的離子基礎(chǔ)尚未完全清楚，目前認(rèn)為，它的產(chǎn)生可能與細(xì)胞膜上生電性鈉泵的活動(dòng)具有波動(dòng)性有關(guān)，當(dāng)鈉泵的活動(dòng)暫時(shí)受抑制時(shí)，膜便發(fā)生去極化；當(dāng)鈉泵活動(dòng)恢復(fù)時(shí)，膜的極化加強(qiáng)，膜電位便又回到原來的水平。 2、在浴槽中加入0.01%乙酰膽堿（Ach ）2滴（約0.2ml）后，可見離體腸管活動(dòng)增強(qiáng)，描記曲線出現(xiàn)收縮頻率變快，幅度增加。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的機(jī)理，目前認(rèn)為與消化道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的離子基礎(chǔ)是Ca2+的內(nèi)流有關(guān)。乙酰膽堿可與肌膜上的M受體結(jié)合，使得兩類通道開放：一類為電位敏感性Ca2+專用通道，另一類為特異性受體活化Ca2+專用通道。前一類通道對(duì)Ach敏感，小劑量Ach即引起開放；后一類通道對(duì)Ach相對(duì)不敏感，只有大劑量Ach才會(huì)引起開放。這兩類通道開放都使得肌漿中Ca2+增高，進(jìn)而激活肌纖蛋白肌凝蛋白ATP系統(tǒng)，使平滑肌收縮，肌張力增加。3、在浴槽中加入0.01%腎上腺素2滴（約0.2ml）后，可見離體腸管活動(dòng)減弱，描記曲線出現(xiàn)收縮頻率變慢，幅度減小以及基線下移。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的機(jī)理，目前認(rèn)為與腸肌細(xì)胞膜上存在和兩中受體，受體又分為抑制型受體和興奮型受體有關(guān)。腎上腺素作用于抑制型受體，引起腸肌膜上一種特異性受體活化，使K+外流增多，細(xì)胞膜發(fā)生超極化，腸肌興奮性降低，肌張力下降。同時(shí)，腎上腺素還作用于受體，它的激活引起腸肌細(xì)胞膜中的cAMP合成增多，cAMP激活腸肌膜及肌漿網(wǎng)上Ca2+泵活動(dòng)，使肌漿中Ca2+濃度降低，亦使肌張力降低； 受體激活后還促使K+及Ca2+外流增加，加速膜的超極化，促進(jìn)了腸肌肌張力的減低。 4、在浴槽中加入2%氯化鈣溶液2滴后，離體腸管活動(dòng)增強(qiáng)，描記曲線出現(xiàn)收縮幅度增加。這是因?yàn)榧尤肼然}后，細(xì)胞外液Ca2+濃度升高，則Ca2+內(nèi)流增加，使得細(xì)胞內(nèi)液中Ca2+濃度升高，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合增加，促進(jìn)了橫橋的激活。因而收縮力增加。5、在浴槽中加入1mol/L鹽酸溶液2滴后，離體腸管活動(dòng)減弱，描記曲線出現(xiàn)收縮幅度降低，頻率變慢。出現(xiàn)這一現(xiàn)象，目前認(rèn)為其原因在于：細(xì)胞外H+升高時(shí)，Ca2+通道的活性受到抑制，使得Ca2+內(nèi)流減少。 H+升高能干擾肌肉的代謝和肌絲滑行的生化過程： H+能與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)鈣調(diào)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)而使肌球蛋白ATP酶活性降低（近期有理論認(rèn)為是直接抑制作用而非競(jìng)爭(zhēng)作用）；使肌原纖維對(duì)Ca2+的敏感性和Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)的釋放量減少。 6、在加鹽酸使平滑肌收縮減弱的基礎(chǔ)上，再加2滴NaOH于浴槽中，則腸管活動(dòng)出現(xiàn)相反的情況，即腸管活動(dòng)增強(qiáng)。原因在于NaOH可以中和H+，改變了細(xì)胞外液的PH值，PH過高、過低，收縮幅度及張力都會(huì)降低，最適PH時(shí)收縮效果最好。7、浸浴小腸腸管的臺(tái)氏液溫度以3840為宜，低于或高于這個(gè)溫度，都會(huì)影響結(jié)果。因?yàn)槟c管平滑肌對(duì)溫度改變極為敏感，當(dāng)溫度降到30以下時(shí)，由于代謝水平的降低，興奮性減弱，可出現(xiàn)收縮曲線基線下移，頻率變慢，收縮幅度變小。有時(shí)可能會(huì)見到基線先上移后下降的現(xiàn)象。這是因?yàn)榻禍乇旧韺?duì)腸管是一種刺激，也可短暫地加強(qiáng)代謝活動(dòng)，所以肌張力升高。當(dāng)溫度高于40時(shí)，由于酶活性提高，各離子通道活性增加，使得基線上移，收縮頻率增高，幅度增加。當(dāng)然，如果臺(tái)氏液溫度過高（50以上），可因蛋白變性，使腸管收縮功能消失。結(jié)論： 1、消化道平滑肌具有自律性，但其收縮緩慢，節(jié)律性不規(guī)則。 2、消化道平滑肌具有一定的緊張性。 3、消化道平滑肌的活動(dòng)易受溫度、PH值及其它化學(xué)因素、藥物因素的影響。實(shí)驗(yàn)二 低溫、局麻藥對(duì)蟾蜍坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位、傳導(dǎo)速度及不應(yīng)期的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1學(xué)會(huì)用細(xì)胞外電刺激誘發(fā)神經(jīng)干動(dòng)作電位的方法。 2觀察分析低溫、局麻藥對(duì)蟾蜍坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位、傳導(dǎo)速度及不應(yīng)期的影響。 3掌握生物電記錄的一般原則和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 神經(jīng)纖維靜息時(shí)，處于細(xì)胞內(nèi)負(fù)外正的電位差，即靜息電位。將兩個(gè)刺激電極與神經(jīng)干接觸，當(dāng)刺激器發(fā)出脈沖刺激時(shí)，負(fù)電極處發(fā)生去極化，去極化達(dá)閾電位時(shí)爆發(fā)動(dòng)作電位，使負(fù)電極處發(fā)生內(nèi)正外負(fù)的倒極化，使已興奮的電極處電位低于鄰近未興奮處而出現(xiàn)電位差而產(chǎn)生局部電流。此局部電流依次擴(kuò)布引起整個(gè)神經(jīng)纖維的興奮。依據(jù)這樣的原理推論，發(fā)出刺激脈沖時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生去極化興奮的部位在負(fù)電極處，而正電極處則發(fā)生膜的超極化。這樣就造成兩電極間存在電位差。而且隨著興奮在神經(jīng)干的擴(kuò)布，放置在膜外的兩電極可記錄出電位差的動(dòng)態(tài)變化。如圖所示。本實(shí)驗(yàn)方法為細(xì)胞外記錄法。若把微電極插入細(xì)胞內(nèi)記錄單細(xì)胞動(dòng)作電位，為細(xì)胞內(nèi)記錄法。兩種方法記錄的動(dòng)作電位波形有所不同。 蟾蜍坐骨神經(jīng)干由眾多的神經(jīng)纖維組成。不同的纖維其興奮性不盡相同，當(dāng)給予神經(jīng)干一個(gè)電刺激時(shí)，刺激強(qiáng)度不同會(huì)引起一個(gè)至多個(gè)纖維興奮，記錄電極會(huì)把多個(gè)動(dòng)作電位同時(shí)記錄下來，形成的動(dòng)作電位圖形，稱為復(fù)合動(dòng)作電位。學(xué)習(xí)和掌握低溫、局麻藥對(duì)動(dòng)作電位幅度、時(shí)程、傳導(dǎo)速度及不應(yīng)期的影響，對(duì)從事臨床工作有一定的指導(dǎo)意義。三、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：蟾蜍（身長約15cm） 2、器械、藥品：BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、蛙板、刺蛙針、玻璃分針、鋅銅弓、眼科剪、眼科鑷（直、彎）、手術(shù)剪、中式剪刀、組織鑷、神經(jīng)標(biāo)本盒、滴管、培養(yǎng)皿、絲線、室溫及低溫任氏液、2%普魯卡因。 四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟 a)、標(biāo)本制備流程 b)、儀器安裝及調(diào)試 c)、觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋a)標(biāo)本制備流程： 坐骨神經(jīng)干標(biāo)本制備備好神經(jīng)標(biāo)本屏蔽盒將神經(jīng)放于盒內(nèi)電極上 坐骨神經(jīng)干標(biāo)本制備： 1破壞腦脊髓左手握蛙，用拇指按壓背部，食指按壓頭部前端，使頭前俯；用右手食指的指甲由頭端沿正中線向下滑動(dòng)，至耳鼓膜后緣連線前約3 mm處可觸及一橫溝，其中點(diǎn)相當(dāng)于枕骨大孔位置。用探針由此處垂直刺入枕骨大孔，折入顱腔，左右捻轉(zhuǎn)探針，以破壞腦組織；其后，將探針退至枕骨大孔，將針頭轉(zhuǎn)向后，刺入椎管，以破壞脊髓。此時(shí)，如蛙四肢松軟，呼吸消失，表明腦和脊髓已完全破壞。2除去軀干上部及內(nèi)臟用中式剪刀在骶髂關(guān)節(jié)水平以上坐骨神經(jīng)起始處上緣1cm處剪斷脊柱，左手捏住脊柱下方斷端，注意不要損傷腹側(cè)面兩側(cè)的坐骨神經(jīng)干，使蛙頭和內(nèi)臟自然下垂，右手持中式剪刀沿脊柱兩側(cè)剪除一切內(nèi)臟及頭胸部，留下后肢、骶骨、部分脊柱及緊貼于脊柱兩側(cè)的坐骨神經(jīng)。3剝皮、分離兩腿先剪去肛周一圈皮膚，然后一手捏住脊柱斷端，另一只手捏住斷端邊緣皮膚，向下剝掉全部后肢皮膚。再用粗剪刀將脊柱沿正中線剪開分為兩半，標(biāo)本放在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。洗凈手及用過的器械。 4游離坐骨神經(jīng)取一個(gè)下肢標(biāo)本，腹面朝上置于蛙板上，滴加任氏液于標(biāo)本上。用大頭針固定脊柱和后肢末端，此時(shí)清楚可見白色粗大的神經(jīng)自脊柱側(cè)面發(fā)出。用玻璃分針劃開神經(jīng)表面筋膜及坐骨大孔處組織，并于神經(jīng)近脊柱端穿線結(jié)扎，于結(jié)扎處近心端剪斷神經(jīng)。手持結(jié)扎線輕輕提起神經(jīng)，用眼科剪靠神經(jīng)干剪斷神經(jīng)分支，直到腹股溝坐骨神經(jīng)大孔處。翻轉(zhuǎn)標(biāo)本背面朝上固定，用玻璃分針在股二頭肌與半膜肌之間分離出坐骨神經(jīng) (右圖) 從坐骨神經(jīng)大孔處提起神經(jīng)，向下分離，剪斷分支，游離至腘窩處。在此處坐骨神經(jīng)分成小腿內(nèi)側(cè)的脛神經(jīng)和外側(cè)的腓神經(jīng)，保留其中較粗的一根，剪斷另一根。分離保留的一根至踝關(guān)節(jié)處，直到足部用線結(jié)扎，在結(jié)扎處外周端剪斷，即可游離坐骨神經(jīng)干標(biāo)本，將其放入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中備用。標(biāo)本制成后，浸于任氏液中1020分鐘，使其興奮性相對(duì)穩(wěn)定后即可用于實(shí)驗(yàn)。注意 制備坐骨神經(jīng)干標(biāo)本時(shí)應(yīng)作鈍性分離，避免過度牽拉或用金屬器械、手捏碰神經(jīng)干；制備標(biāo)本時(shí)應(yīng)隨時(shí)對(duì)神經(jīng)干滴加任氏液，以保持神經(jīng)濕潤。 備好神經(jīng)標(biāo)本屏蔽盒： 向盒內(nèi)注入少量任氏液，調(diào)整電極間距離。 將神經(jīng)放于盒內(nèi)電極上 將神經(jīng)搭載于盒內(nèi)電極上，神經(jīng)中樞端置于刺激電極一側(cè)，外周端置于引導(dǎo)電極一側(cè)，神經(jīng)干應(yīng)與每個(gè)電極密切接觸，神經(jīng)和電極上不能有液滴。然后蓋好盒蓋，使神經(jīng)封閉，防止神經(jīng)干燥。b)儀器安裝與調(diào)試 如圖所示：c)觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋 1引導(dǎo)、記錄及觀察坐骨神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位。 (1)將1通道的輸入線連接神經(jīng)標(biāo)本盒的r1、r2及接地接線柱，進(jìn)入BL-410界面，按以下提示操作： 用實(shí)驗(yàn)?zāi)K時(shí)：實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)?神經(jīng)干動(dòng)作電位引導(dǎo)。 不用實(shí)驗(yàn)?zāi)K時(shí)：輸入信號(hào)?1通道?動(dòng)作電位； 手工設(shè)置刺激參數(shù)見下表（參考值）(2)記錄復(fù)合動(dòng)作電位波形。 (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存盤后反演，測(cè)量動(dòng)作電位潛伏期、時(shí)程及正、負(fù)雙相波幅和峰-峰值（每一參數(shù)值取10個(gè)以上計(jì)算平均值）。2測(cè)量神經(jīng)干動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度。 (1)用身長約15cm的蟾蜍制備坐骨神經(jīng)干標(biāo)本。 (2)在步驟1基礎(chǔ)上，添加一對(duì)引導(dǎo)電極（r3、r4），r3、r4與S1、S2刺激電極間距離盡量遠(yuǎn)一些。輸入信號(hào)?1通道?動(dòng)作電位；輸入信號(hào)?2通道?動(dòng)作電位。 (3)在BL-410界面上，按以下提示操作： 用實(shí)驗(yàn)?zāi)K時(shí)：實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)?神經(jīng)興奮傳導(dǎo)速度測(cè)定 不用實(shí)驗(yàn)?zāi)K時(shí)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，分別測(cè)定電極r1-r3之間的距離(S)和興奮從r1傳導(dǎo)到r3需要的時(shí)間(T)，求得傳導(dǎo)速度v=S/T。 (4)增快顯速，仔細(xì)觀察是否能出現(xiàn)相繼多個(gè)動(dòng)作電位。3觀察低溫、局部麻醉藥（普魯卡因）對(duì)動(dòng)作電位潛伏期、時(shí)程、幅度、傳導(dǎo)速度的影響。 (1)將標(biāo)本置于低溫任氏液中2分鐘后，重復(fù)步驟1、2，觀察低溫對(duì)上述指標(biāo)的影響。 (2)將該標(biāo)本置于室溫任氏液浸泡5分鐘后，放置于標(biāo)本盒內(nèi)，將浸透普魯卡因的濾紙敷在r2-r3之間，重復(fù)步驟1、2，觀察低溫對(duì)上述指標(biāo)的影響。 4低溫、局麻藥對(duì)不應(yīng)期的影響 另取一神經(jīng)干標(biāo)本，在記錄電極r1、r2之間用組織鑷夾傷神經(jīng)干，記錄單相動(dòng)作電位。 用實(shí)驗(yàn)?zāi)K時(shí)，選擇：實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目神經(jīng)肌肉實(shí)驗(yàn)神經(jīng)干興奮不應(yīng)期測(cè)定；不用模塊時(shí)，刺激參數(shù)設(shè)置見下表（參考值）分別測(cè)量不同波間隔時(shí)，AP1與AP2幅值，測(cè)出不應(yīng)期。用步驟3的方法，觀察低溫、普魯卡因?qū)Σ粦?yīng)期的影響。五、注意事項(xiàng) 1制作標(biāo)本過程中，應(yīng)盡量減少對(duì)神經(jīng)的牽拉，以免損傷神經(jīng)。 2實(shí)驗(yàn)過程中，要保持標(biāo)本濕潤，不時(shí)向神經(jīng)干上滴任氏液，但要用任氏液棉球吸掉過多的水珠，以防電極短路。 3始終保持神經(jīng)干與電極密切接觸。神經(jīng)干不可打折。 4實(shí)驗(yàn)有干擾時(shí)，應(yīng)注意使用BL-410系統(tǒng)提供的50HZ抑制功能。 5實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)清洗、擦干標(biāo)本盒及電極，防止電極腐蝕。作業(yè) 1如何鑒別生物電信號(hào)與干擾信號(hào)？ 2闡明神經(jīng)干雙相動(dòng)作電位產(chǎn)生的原理。 3分析比較神經(jīng)干的復(fù)合動(dòng)作電位與微電極細(xì)胞內(nèi)記錄的單根神經(jīng)纖維動(dòng)作電位的區(qū)別與相互關(guān)系。 4總結(jié)利用刺激器誘發(fā)組織興奮的一般方法。 5比較利用刺激器誘發(fā)神經(jīng)干復(fù)合動(dòng)作電位與單纖維動(dòng)作電位的刺激方法有何不同。實(shí)驗(yàn)討論： 1、實(shí)驗(yàn)觀察的是復(fù)合神經(jīng)纖維動(dòng)作電位及其特性，其與單一神經(jīng)纖維的動(dòng)作電位有很多不同： a)引導(dǎo)方法不同：神經(jīng)干動(dòng)作電位記錄的是多個(gè)細(xì)胞外兩點(diǎn)之間的電勢(shì)差，記錄時(shí)負(fù)波向上，正波向下；而單一神經(jīng)纖維的動(dòng)作電位是用微電極記錄的同一細(xì)胞膜內(nèi)外的電勢(shì)差。 b)波形不同：神經(jīng)干動(dòng)作電位隨兩個(gè)記錄電極之間電勢(shì)差的變化而成雙相動(dòng)作電位，如果兩個(gè)記錄兩極之間的距離無限大，可以記錄到方向相反的兩個(gè)單相波；而單一神經(jīng)纖維只能記錄到單相動(dòng)作電位。c)產(chǎn)生原理不同：在單細(xì)胞膜外，如圖1已興奮部位（細(xì)胞膜內(nèi)為正，膜外為負(fù)）較未興奮部位或興奮已恢復(fù)部位成負(fù)電位，因此兩點(diǎn)間存在電勢(shì)差。神經(jīng)干動(dòng)作電位是多根神經(jīng)纖維的復(fù)合電位，如圖2當(dāng)B區(qū)興奮時(shí)，B與A和C間存在電位差，由I電極引導(dǎo)出一個(gè)動(dòng)作電位。B區(qū)興奮后，又逐漸復(fù)極，動(dòng)作電位逐漸向C、D區(qū)傳導(dǎo)。當(dāng)動(dòng)作電位傳導(dǎo)到D區(qū)時(shí)，B區(qū)已完全復(fù)極，D區(qū)興奮故II電極又記錄到一個(gè)動(dòng)作電位，同時(shí)D區(qū)又逐漸復(fù)極，由此引導(dǎo)出雙相動(dòng)作電位。2、神經(jīng)干動(dòng)作電位的閾刺激和最大刺激： 當(dāng)刺激強(qiáng)度達(dá)到一定程度時(shí)，一部分神經(jīng)細(xì)胞興奮產(chǎn)生動(dòng)作電位，這時(shí)能夠記錄到神經(jīng)干的動(dòng)作電位。當(dāng)剛剛出現(xiàn)動(dòng)作電位時(shí)的刺激強(qiáng)度稱閾值。隨著刺激強(qiáng)度的不斷增加，越來越多的神經(jīng)纖維興奮產(chǎn)生動(dòng)作電位，記錄到的神經(jīng)干的動(dòng)作電位波幅也越來越大。當(dāng)刺激強(qiáng)度增加到一定大小時(shí)，所有神經(jīng)纖維都被興奮，神經(jīng)干的動(dòng)作電位不再增大，這時(shí)的刺激強(qiáng)度稱為最大刺激強(qiáng)度。3、神經(jīng)干動(dòng)作電位的不應(yīng)期： 我們所記錄到的神經(jīng)干的動(dòng)作電位的不應(yīng)期是不應(yīng)期最短的那類神經(jīng)纖維的不應(yīng)期。動(dòng)作電位是Na+內(nèi)流的電化學(xué)平衡電位，Na+通道的激活、失活和備用有時(shí)間依賴性和電壓依賴性。本實(shí)驗(yàn)用閾上刺激，雖然可以激活Na+通道，但其離子通道仍要經(jīng)歷激活、失活和備用三個(gè)時(shí)期。在失活期內(nèi)無論給多大刺激，均不能產(chǎn)生動(dòng)作電位，稱之為絕對(duì)不應(yīng)期；在備用期，給予閾上刺激，可以產(chǎn)生局部電位，當(dāng)刺激強(qiáng)度足夠大時(shí)可以產(chǎn)生一個(gè)新的動(dòng)作電位，稱之為相對(duì)不應(yīng)期。4、局麻藥的作用： 現(xiàn)象：將普魯卡因溶液滴加至神經(jīng)干的不同部位，會(huì)產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。普魯卡因溶液滴加至神經(jīng)干上刺激電極與第一對(duì)引導(dǎo)電極之間，則兩引導(dǎo)電極上引導(dǎo)出較小的AP或不能引導(dǎo)出AP；普魯卡因溶液滴加至神經(jīng)干上第一對(duì)引導(dǎo)電極R1、R2之間，則第一對(duì)引導(dǎo)電極上引導(dǎo)出單相AP或雙相AP但下降相波谷減小，第二對(duì)引導(dǎo)出較小的AP或不能引導(dǎo)出AP。 機(jī)制：局麻藥溶液只有同時(shí)存在不帶電荷的堿基和陽離子時(shí)才能發(fā)揮較好的麻醉效果。陽離子不能通過神經(jīng)膜，當(dāng)不帶電荷的脂溶性堿基通過神經(jīng)膜后，處于水相狀態(tài)又可解離，使陽離子能迅速與軸膜結(jié)合而阻滯神經(jīng)傳導(dǎo)。隨局麻藥濃度的增加，將降低神經(jīng)去極化速率與程度同時(shí)降低復(fù)極化的速率與傳導(dǎo)速率，使不應(yīng)期延長，直至去極化無法達(dá)到閾電位而呈完全阻滯狀態(tài)。 局麻藥對(duì)細(xì)胞膜鈉通道的阻滯，使鈉通道失活，可能通過以下機(jī)理實(shí)現(xiàn)：局麻藥的受體位于鈉通道的含水帶，與鈉離子通過兩個(gè)不同作用部位而相互間發(fā)生變構(gòu)拮抗。局麻藥與鈉通道的外側(cè)受體結(jié)合從表面堵塞通道；鈉通道內(nèi)表面被帶電荷形式的局麻藥所阻滯（受體部位學(xué)說）。相對(duì)疏水性局麻藥分子與質(zhì)膜相互作用，引起膜脂質(zhì)形態(tài)改變，膜膨脹使鈉通道變窄，阻滯鈉的流動(dòng)抑制去極化（膜膨脹學(xué)說）。從而：減少活化的通道分?jǐn)?shù)，增加“失活”通道分?jǐn)?shù)；部分或完全抑制鈉通道構(gòu)型的進(jìn)程，直接干擾通道活化，抑制通道由靜息轉(zhuǎn)化為開放；可能減少通過各開放通道的離子流。另外，鈉通道的開放和閘門是受鈣離子所制約的，局麻藥與鈣離子競(jìng)爭(zhēng)閘門，以控制或阻滯鈉離子的通過。 局麻藥對(duì)周圍神經(jīng)的阻滯效果依局麻藥的種類及濃度的不同而有所差別。欲得到滿意的阻滯效果應(yīng)滿足：局麻藥達(dá)到足夠濃度；充分作用時(shí)間；足夠長神經(jīng)與局麻藥直接接觸。 普魯卡因通過上述物理化學(xué)機(jī)制，既作用于神經(jīng)膜又作用于鈉通道的軸漿側(cè)阻斷AP的傳導(dǎo)。低溫的作用： 現(xiàn)象：神經(jīng)干放在冰水中浸泡后，動(dòng)作電位的幅度及傳導(dǎo)速度均下降。 機(jī)制：低溫可阻斷神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)活動(dòng)，在溫度很低時(shí)神經(jīng)纖維的興奮性及電傳導(dǎo)均直線下降，較大的帶髓鞘的神經(jīng)易受抑制。低溫時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的耗氧率及能量代謝率都降低，細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)與代謝有關(guān)的蛋白酶活性降低，離子擴(kuò)散速率減慢，細(xì)胞膜的流動(dòng)性下降。結(jié)論： 1、神經(jīng)干動(dòng)作電位的產(chǎn)生原理及其特性不同于單一神經(jīng)纖維。 2、局麻藥和低溫可以使神經(jīng)干動(dòng)作電位的興奮性及興奮傳導(dǎo)速度下降，但兩者作用的原理不同。實(shí)驗(yàn)三 電刺激及化學(xué)因素對(duì)心臟活動(dòng)的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)蛙心灌流的方法。 2.結(jié)合內(nèi)環(huán)境概念，了解生理活性物質(zhì)及化學(xué)因素對(duì)心臟活動(dòng)的影響。 3.觀察心臟在興奮過程中興奮性的變化。二、實(shí)驗(yàn)原理 心臟具有自律性，離體心臟在模擬其內(nèi)環(huán)境條件下，在一定時(shí)間內(nèi)仍具有節(jié)律性舒縮活動(dòng)，而人為地改變其環(huán)境因素，會(huì)影響心臟的活動(dòng)。 心肌在一次興奮過程中，其興奮性會(huì)發(fā)生一系列周期性變化心肌興奮性的特點(diǎn)是興奮的有效不應(yīng)期特別長，約相當(dāng)于整個(gè)收縮期和舒張?jiān)缙?，在此期中，任何?qiáng)大的刺激均不能引起心肌興奮和收縮。而相對(duì)不應(yīng)期及超常期均發(fā)生在舒張期內(nèi)，所以在心室舒張中、晚期內(nèi)給心室一次適宜刺激，可在正常節(jié)律性興奮到達(dá)心室之前，引起一個(gè)提前出現(xiàn)的興奮和收縮，稱為期前收縮。期前收縮也有自己的有效不應(yīng)期，因此當(dāng)竇房結(jié) ( 兩棲類為靜脈竇) 下傳的正常節(jié)律性興奮傳至心室肌時(shí)正好落在這個(gè)有效不應(yīng)期之中而失效，這時(shí)心室就不能興奮及收縮，心室仍處于舒張狀態(tài)，必須等到再下一次正常節(jié)律的興奮到達(dá)時(shí)才產(chǎn)生興奮及收縮。所以，在一次期前收縮之后，往往有一較長的心室舒張期，稱為代償間歇。三、 實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：蟾蜍或蛙。 2、器械、藥品：蛙類手術(shù)器械一套、眼科手術(shù)剪、蛙心夾、蛙心插管、鐵支架；三維調(diào)節(jié)器、試管夾、雙凹夾、滴管、棉線、小燒杯、傳感器、BL-410系統(tǒng)、任氏液、低鈣任氏液(所含CaCl2為一般任氏液的1/4，其它成份不變)、0.65%NaCl溶液、1%CaCl2溶液、2%CaCl2溶液、3%乳酸溶液、2.5%NaHCO3溶液、0.01%腎上腺素、1%KCl溶液、0.001%乙酰膽堿。 四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟 1、標(biāo)本制備流程 2、儀器安裝及調(diào)試 3、觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋 1、標(biāo)本制備流程： a.破壞蟾蜍腦和脊髓b.蛙心插管 a. 破壞蟾蜍腦和脊髓：左手握蛙，用拇指按壓背部，食指按壓頭部前端，使頭前俯；用右手食指的指甲由頭端沿正中線向下滑動(dòng)，至耳鼓膜后緣連線前約3 mm處可觸及一橫溝，其中點(diǎn)相當(dāng)于枕骨大孔位置。用探針由此處垂直刺入枕骨大孔，折入顱腔，左右捻轉(zhuǎn)探針，以破壞腦組織；其后，將探針退至枕骨大孔，將針頭轉(zhuǎn)向后，刺入椎管，以破壞脊髓。此時(shí)，如蛙四肢松軟，呼吸消失，表明腦和脊髓已完全破壞。b.固定并暴露心臟：剪開胸前區(qū)皮膚，剪去胸骨，暴露心臟。用眼科鑷提起心包膜，再用眼科剪在心臟收縮時(shí)小心將其剪破，使心臟完全暴露出來。結(jié)扎右主動(dòng)脈，在左主動(dòng)脈下穿一細(xì)線，打一虛結(jié)備用。 用眼科鑷輕提左主動(dòng)脈，向心方向剪一“V”形切口，右手將裝有任氏液的蛙心插管從切口插入主動(dòng)脈(見下圖)，然后向右主動(dòng)脈方向移動(dòng)插管，使插管長軸與心臟一致，當(dāng)插到主動(dòng)脈圓錐時(shí)，再將插管稍向后退，即轉(zhuǎn)向左后方，左手用眼科鑷輕提房室溝周圍的組織，使插管插入心室，切忌用力過大和插管過深。此時(shí)可見插管內(nèi)任氏液面隨蛙心舒縮而上下波動(dòng)，立即將預(yù)先準(zhǔn)備好的虛結(jié)扎緊，并固定于插管的側(cè)鉤上。用吸管吸去蛙心插管內(nèi)任氏液及血液，以任氏液沖洗12次，然后剪斷兩主動(dòng)脈弓，輕提蛙心插管，以抬高心臟，在心臟背面靜脈竇與腔靜脈交界處用線結(jié)扎，注意勿結(jié)扎靜脈竇，在結(jié)扎線外側(cè)剪斷血管，使心臟與蛙體分離。再用滴管吸取任氏液將蛙心插管內(nèi)血液中洗數(shù)次，直到插管中灌流液無色為止，然后將蛙心插管固定在鐵支架上，以備實(shí)驗(yàn)用。注意： 在左主動(dòng)脈剪口前，應(yīng)先用蛙心插管的細(xì)端置動(dòng)脈球處與動(dòng)脈平行來選擇適宜的剪口，以免剪口過高或過低； 插好插管的蛙心存放在冰箱內(nèi)，可供數(shù)日使用； 保持離體心臟外部濕潤。2、儀器安裝調(diào)試 用試管夾將蛙心插管固定在鐵支架上，將系有絲線的蛙心夾于心室舒張末期夾住蟾蜍心尖部，絲線另一端經(jīng)過轉(zhuǎn)向滑輪垂直連接于張力換能器懸梁臂上，用三維調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)絲線的松緊(上圖)。 BL-410系統(tǒng)：啟動(dòng)微機(jī)進(jìn)入BL-410軟件主界面，用鼠標(biāo)左鍵單擊菜單條的“實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目”“循環(huán)實(shí)驗(yàn)”“蛙心灌流”，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)入該實(shí)驗(yàn)記錄存盤狀態(tài)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)K中，1通道記錄蛙心收縮曲線。根據(jù)曲線具體情況，調(diào)節(jié)基線及下列參數(shù)：顯速1.002.00s/div、G100、TDC、F30Hz，使曲線達(dá)到理想狀態(tài)。觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋 1描記正常心搏曲線 曲線的規(guī)律性代表心搏的節(jié)律性；曲線的幅度代表心室的收縮強(qiáng)弱；曲線的頂點(diǎn)水平代表心室收縮的程度；曲線的基線代表心室舒張的程度。 2把蛙心插管內(nèi)任氏液全部吸出，換入0.65%NaCl溶液，觀察曲線的變化。待效應(yīng)明顯后，換入新鮮任氏液使心跳恢復(fù)正常。 3加入2%CaCl2溶液1-2滴，觀察曲線的變化，換液同上。 4加入1%KCl溶液1-2滴，觀察曲線的變化，換液同上。 5加入0.01%腎上腺素1-2滴，觀察曲線的變化。待效應(yīng)明顯后，將灌流液全部吸出，換入新鮮任氏液，使心跳恢復(fù)正常。 6加入0.001%乙酰膽堿1-2滴，觀察曲線的變化。待效應(yīng)明顯后，將灌流液全部吸出，換入新鮮任氏液(如果加入乙酰膽堿后心臟已停立于舒張狀態(tài)，換液后，可用滴管插至插管底部，將灌流液擠入心室，反復(fù)數(shù)次，將心室內(nèi)乙酰膽堿完全清洗出)。 7加入3%乳酸溶液1滴于灌流液中，觀察曲線的變化。待作用明顯后，再加入2.5%NaHCO3溶液1-2滴，觀察心跳恢復(fù)過程。 8標(biāo)本功能狀態(tài)恢復(fù)穩(wěn)定后，分別在收縮和舒張的早、中、晚期給心室單次閾上刺激，觀察記錄心搏曲線的變化。 五、注意事項(xiàng) 1蛙心插管的尖端實(shí)驗(yàn)前要檢查，不可過于尖銳鋒利，否則易損傷血管及心臟組織。 2制備蛙心標(biāo)本時(shí)，勿傷及靜脈竇。 3各種液體的滴管要專用，不可混用。 4蛙心插管內(nèi)液面應(yīng)保持相對(duì)穩(wěn)定的高度。 5每加一種溶液要用滴管混勻，以免所加溶液浮在上面，不易進(jìn)入心臟。 6滴加試劑后,一旦出現(xiàn)作用應(yīng)立即用新鮮任氏液換洗,以免心肌受損，而且必須待心臟活動(dòng)恢復(fù)正常穩(wěn)定后方能進(jìn)行下一步試驗(yàn)，以形成前后對(duì)照。 7滴加藥品和換取新鮮任氏液時(shí)，須及時(shí)在曲線下標(biāo)記，以便觀察分析。 8化學(xué)藥物作用不明顯時(shí)，可再適當(dāng)?shù)渭?，密切觀察藥物劑量添加后的試驗(yàn)結(jié)果。 9隨時(shí)用任氏液潤濕蛙心表面。六、作業(yè) 1怎么判斷蛙心插管插入心臟。 2在任氏液中加入不同試劑灌注蛙心時(shí)，心搏曲線分別發(fā)生什么變化。 3觀察2%CaCl2、0.01%腎上腺素對(duì)蛙心收縮曲線的影響有何不同?為什么? 4滴加Ach后，離體蛙心活動(dòng)有何變化，機(jī)理如何？ 5以本實(shí)驗(yàn)為例，說明內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的意義。 6心肌能否象骨骼肌那樣受連續(xù)刺激而發(fā)生強(qiáng)直收縮？ 7心肌興奮過程中，興奮性變化對(duì)心泵功能有何意義？ 8心率過快或過緩時(shí)期前收縮后是否會(huì)出現(xiàn)代償間歇？為什么？ 七、作業(yè) 1怎么判斷蛙心插管插入心臟。 2在任氏液中加入不同試劑灌注蛙心時(shí)，心搏曲線分別發(fā)生什么變化。 3觀察2%CaCl2、0.01%腎上腺素對(duì)蛙心收縮曲線的影響有何不同?為什么? 4滴加Ach后，離體蛙心活動(dòng)有何變化，機(jī)理如何？ 5以本實(shí)驗(yàn)為例，說明內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的意義。 6心肌能否象骨骼肌那樣受連續(xù)刺激而發(fā)生強(qiáng)直收縮？ 7心肌興奮過程中，興奮性變化對(duì)心泵功能有何意義？ 8心率過快或過緩時(shí)期前收縮后是否會(huì)出現(xiàn)代償間歇？為什么？ 實(shí)驗(yàn)討論： 由實(shí)驗(yàn)所記錄的曲線結(jié)果可以看出，改變蟾蜍離體心臟的灌流液成份，可影響其心臟的舒縮節(jié)律和幅度。 1.用任氏液灌流心臟， 可以保持較長時(shí)間的節(jié)律性舒縮活動(dòng)。這是因?yàn)槿问弦旱闹饕x子成份、滲透壓、PH值和蟾蜍Cell外液相近， 為蛙心提供了一個(gè)適宜的理化環(huán)境。 2、用065%NaCL溶液灌流心臟， 其心跳減弱。 心肌的收縮活動(dòng)是由Ca+觸發(fā)的， 由于心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)不發(fā)達(dá)， 故心肌收縮的強(qiáng)弱與細(xì)胞外Ca+濃度呈正比。 用065%NaCL 溶液灌蛙心，灌注液中缺乏Ca+，以致心肌動(dòng)作電位2期內(nèi)流Ca+減少， 心肌收縮活動(dòng)也隨之減弱。3.用高鉀任氏液灌注心臟時(shí)， 心跳明顯減弱， 甚至出現(xiàn)心臟停到舒張狀態(tài)。因?yàn)榧?xì)胞外K+濃度增高時(shí)，導(dǎo)致（1）、K+與Ca+有競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，K+可抑制細(xì)胞膜對(duì)Ca+，的轉(zhuǎn)運(yùn)， 使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ca+，減少， 心肌的興奮-收縮耦聯(lián)過程減弱， 心肌收縮力降低；（2）動(dòng)作電位3期K+外流增加，平臺(tái)期縮短，使平臺(tái)期Ca+內(nèi)流減少，收縮力減弱。當(dāng)細(xì)胞外K+濃度顯著增高時(shí)， 膜內(nèi)外的鉀離子濃度梯度減小， 靜息電位的絕對(duì)值過度減小(膜內(nèi)達(dá)55mv左右時(shí)，Na+通道失活)， 心肌的興奮性完全喪失， 心肌不能興奮和收縮， 停止于舒張狀態(tài)。長時(shí)間用， 心臟最終會(huì)停止收縮。 4.用高Ca+任氏液灌流蛙心時(shí)， 心收縮力增強(qiáng)， 舒張不完全， 以致收縮基線上移。 在Ca+，濃度高的情況下， 會(huì)停止在收縮狀態(tài)， 這種現(xiàn)象稱之為” 鈣僵”。 心肌的舒縮與心肌肌漿網(wǎng)中Ca+濃度高低有關(guān)。 當(dāng)鈣離子濃度升高到一定水平(10-5M) 時(shí)， 作為鈣受體的肌鈣蛋白結(jié)合了足夠的Ca+，就引起了肌鈣蛋白分子構(gòu)型的改變， 從而觸發(fā)了肌絲滑行， 肌纖維收縮。 當(dāng)鈣離子濃度降低至10-5M時(shí)， 鈣離子與肌鈣蛋白解離， 心肌隨之舒張， 如果鈣離子濃度持續(xù)升高， 鈣離子與肌鈣蛋白結(jié)數(shù)量不斷增加， 甚至達(dá)到只結(jié)合不解離的程度， 致使心肌持續(xù)收縮(鈣僵)。 5. 向蛙心插管中加去甲腎上腺素后， 可見蛙心收縮增強(qiáng)， 心臟舒張完全， 描記的心搏曲線幅度明顯增大、心跳加快、曲線密度明顯變大。 其原因是去甲腎上腺素與心肌細(xì)胞膜上的 受體相結(jié)合， 從而激活肌漿網(wǎng)釋放的Ca+也增多。 同時(shí)靜脈竇4期去極化速度加快， 故心肌舒縮增強(qiáng)， 心跳加快。 6. 在任氏液內(nèi)滴加乳酸， 心跳減弱， 其原因是H+進(jìn)入心肌內(nèi)膜后， 可降低Ca+與肌鈣蛋白的親和力， 促使Ca+的解離。 7. 在上述灌流液中加入與乳酸同當(dāng)量的NaOH， 心肌的舒縮逐漸恢復(fù)。 其原因是NaOH中和了乳酸， 解除了Ca+與肌鈣蛋白親和力的抑制。 8. 任氏液內(nèi)滴加Ach， 蛙心收縮減弱， 收縮曲線基線下移， 心率減慢， 最后心跳停止于舒張狀態(tài)。 原因是Ach與心肌細(xì)胞膜M受體相結(jié)合， 一方面提高心肌細(xì)胞膜K+的通透性， 促使K+外流， 導(dǎo)致(1) 靜脈竇復(fù)極時(shí)K+外流增多， 最大復(fù)極電位絕對(duì)值增大;Ik衰減過程減弱， 自動(dòng)除極速度減慢。 導(dǎo)致靜脈竇自得律性降低， 心律減慢。(2) 復(fù)極過程中K+外流增加， 動(dòng)作電位2，3期縮短， Ca+進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)減少， 使心肌收縮減弱; 另一方面Ach可直接抑制Ca+通道， 減少Ca+內(nèi)流， 進(jìn)而使心肌收縮減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 由此可以看出：蟾蜍離體心臟對(duì)細(xì)胞外液離子濃度的改變，酸堿，NE，Ach敏感。實(shí)驗(yàn)四 紅細(xì)胞滲透脆性測(cè)定、影響血液凝固的因素及血型鑒定一、紅細(xì)胞滲透脆性的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)測(cè)定紅細(xì)胞滲透脆性的方法。 2、加深對(duì)細(xì)胞外液滲透張力在維持紅細(xì)胞正常形態(tài)與功能重要性方面的理解。二、實(shí)驗(yàn)原理 將紅細(xì)胞懸浮于等滲NaCl液中，其形態(tài)不變。若置于低滲NaCl溶液中則發(fā)生膨脹破裂，此現(xiàn)象稱為紅細(xì)胞滲透脆性。但紅細(xì)胞對(duì)低滲鹽溶液具有一定抵抗力，其大小可用NaCl溶液濃度的高低來表示。將血液滴入不同濃度的低滲NaCl溶液中，開始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的NaCl溶液濃度為該血液紅細(xì)胞的最小抵抗力(正常為0.42-0.46%NaCl溶液)。出現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象時(shí)的NaCl溶液濃度為該紅細(xì)胞的最大抵抗力(正常為0.28-0.32%NaCl溶液)。前者代表紅細(xì)胞的最大脆性(最小抵抗力)，后者代表紅細(xì)胞最小脆性(最大抵抗力)。生理學(xué)上將能使懸浮于其中的紅細(xì)胞保持正常形態(tài)的溶液稱為等張溶液，是不能跨過細(xì)胞膜的微粒所形成的力。但等滲溶液并不一定是等張溶液，如1.9%的尿素溶液是等滲溶液，因尿素分子可自由跨細(xì)胞膜擴(kuò)散，故不是等張溶液。三、實(shí)驗(yàn)材料 （一）實(shí)驗(yàn)對(duì)象：家兔 （二）器材、藥品：試管架、小試管45支、載玻片、蓋玻片注射器、8號(hào)注射針頭、棉簽，1%NaCl溶液、0.85%氯化鈉溶液、蒸餾水，1.9%尿素溶液、地塞米松、皂甙。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1、配制不同濃度的低滲NaCl溶液：取口徑相同的干潔小試管12支，分別編號(hào)排列在三個(gè)試管架上，按下表分別向各試管內(nèi)加入1%NaCl溶液和蒸餾水混勻，配制從0.68-0.24%12種不同濃度的NaCl低滲溶液，每管總量均為2.5ml。 表 不同濃度低滲氯化鈉溶液的配制試管編號(hào)另取3支小試管，在三個(gè)試管架中分別編號(hào)13-15，分別加入0.85%NaCl溶液、1.9%尿素和蒸溜水2.5ml。 2采集標(biāo)本 家兔麻醉 取家兔只，用一手抓住頸部皮毛，另一手托住其臀部或腹部即可(圖65B)。若單手倒提兔臀部、單手提兔背或提兔耳均系錯(cuò)誤抓法(圖65A)。稱重，用20%氨基甲酸乙酯 (Urethane) 溶液600-1000 mg/kg (3-5ml/kg) 耳緣靜脈緩慢注射麻醉。給藥速度的掌握技巧靜脈注射麻醉藥物時(shí)，開始給藥的速度可略為快些，即先給予總量的1/3，以求動(dòng)物能順利、快速地渡過興奮期。后2/3劑量的給入速度宜慢，且邊注射、邊觀察動(dòng)物的生命體征的變化(心跳、呼吸等)。當(dāng)確定已達(dá)到麻醉效果時(shí)，即可停止給藥，不必急于將剩余的麻醉藥物全部推入。動(dòng)物麻醉效果的判斷動(dòng)物達(dá)到麻醉的基本狀態(tài)是：肢體肌肉松馳，呼吸節(jié)律呈現(xiàn)深而慢的改變，角膜反射存在、較為遲鈍，軀體呈現(xiàn)自然倒下，此時(shí)為最佳麻醉效果。 若麻醉劑量已給足，動(dòng)物仍有掙扎、興奮等表現(xiàn)時(shí)，應(yīng)觀察一段時(shí)間，確認(rèn)動(dòng)物是否已渡過興奮期，切不可盲目追加麻醉藥物。避免因麻醉過深，抑制心跳呼吸中樞而導(dǎo)致動(dòng)物死亡。2、麻醉后將兔仰臥固定于兔臺(tái)上。仰位固定，四肢用粗布帶固定，布帶一端縛扎于前后肢的踝關(guān)節(jié)以上部位(圖66A，B)，兩前肢布帶在兔背后交叉穿過，壓住對(duì)側(cè)前肢后固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)兩側(cè)（背位交叉固定）。兩后肢左右分開，分別固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)尾端。用一粗棉繩鉤住兔門齒，固定在兔臺(tái)頭端鐵柱上。麻醉后，仰臥固定于兔手術(shù)臺(tái)上，分離一側(cè)頸總動(dòng)脈插管備放血用(具體方法參見動(dòng)脈插管)。 依次向15支試管內(nèi)各加1滴，輕輕顛倒混均，切忌用力振蕩。先觀察13、14、15管的變化，其他12管在室溫下放置1小時(shí)。五、注意事項(xiàng) 1每支試管內(nèi)血液滴入量應(yīng)準(zhǔn)確無誤(只加一滴)。 2確保每支試管NaCl溶液的濃度準(zhǔn)確、容量相等。 3試管必須清潔、干燥。 4觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)以白色為背景。六、作業(yè) 1為什么紅細(xì)胞在等滲的尿素溶液中迅速發(fā)生溶血？ 2測(cè)定紅細(xì)胞滲透脆性有何臨床意義？ 3同一個(gè)體的紅細(xì)胞的滲透脆性不一樣，為什么？八、觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋 1觀察不同濃度低滲NaCl 混合液的顏色和透明度。 2比較112號(hào)管及第13、14、15管的溶血情況并分析其原因 實(shí)驗(yàn)討論：（提示） 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示升高溫度血液凝固過程加快，而當(dāng)試管浸入冰水中時(shí)，血液凝固過程減慢，這表明血液凝固的過程受溫度的影響。血液凝固過程是一種發(fā)生在血漿中由許多因素參與的復(fù)雜的生物化學(xué)連鎖反應(yīng)過程，而溫度可以影響生化反應(yīng)過程，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，生化反應(yīng)的速度加快，血液凝固需要的時(shí)間就縮短。反之，亦然。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，試管中加入棉花后血液凝固所需的時(shí)間縮短，而用石蠟油潤滑試管內(nèi)表面后血液凝固所需的時(shí)間延長。接觸面的粗糙程度影響血小板的粘附、聚集。激活的血小板為凝血因子提供磷脂表面，參與內(nèi)外源性凝血途徑因子X和凝血酶原的激活；血小板表面結(jié)合有許多凝血因子，可加速凝血過程，血小板激活釋放的內(nèi)容物，可增加纖維蛋白的形成。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，試管中加入肝素后血液不凝固。肝素（1）增強(qiáng)抗凝血酶III的活性，（2）可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞大量釋放TFPI和其它抗凝血物質(zhì)；（3）肝素還可增強(qiáng)纖溶。 實(shí)驗(yàn)五 紅細(xì)胞滲透脆性測(cè)定、影響血液凝固的因素及血型鑒定 二、影響血液凝固的因素一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)以發(fā)生血液凝固的時(shí)間為指標(biāo)，向血液中加入或去掉某些因素或改變某些條件(如溫度等)，以觀察對(duì)血液凝固的影響。二、實(shí)驗(yàn)原理 血液流出血管后很快就會(huì)凝固。血液凝固分為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)與外源性凝血系統(tǒng)。后者是指在組織因子的參與下血液凝固的過程。本實(shí)驗(yàn)直接從動(dòng)物動(dòng)脈放血，由于血液幾乎沒有和組織因子接觸，其凝血過程主要由內(nèi)源性凝血系統(tǒng)所發(fā)動(dòng)。血液凝固受許多因素的影響，凝血因子可直接影響血液凝固過程。溫度、接觸面的光滑程度等也可影響血液凝固過程。 三、實(shí)驗(yàn)材料 （一）實(shí)驗(yàn)對(duì)象：家兔 （二）器材、藥品：小燒杯、帶橡皮刷的玻棒或竹簽(或小號(hào)試管刷)、清潔試管10支、秒表、水浴裝置一套、冰塊、棉花、石蠟油、肝素或草酸鉀、生理鹽水。 四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟 1動(dòng)物準(zhǔn)備：家兔麻醉后，仰臥固定于兔手術(shù)臺(tái)上，行一側(cè)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈插管，備取血用。（同上一實(shí)驗(yàn)同） 2試管的準(zhǔn)備：取8支干凈的小試管，按表8-2準(zhǔn)備各種不同的實(shí)驗(yàn)條件。表8-2 影響血液凝固的因素 五、注意事項(xiàng) 1加強(qiáng)分工合作，記時(shí)須準(zhǔn)確。最好由一位同學(xué)負(fù)責(zé)將血液加入試管，其它同學(xué)各掌握1-2支試管，每隔半分鐘觀察一次。 2試管、注射器及小燒杯必須清潔、干燥。 3每支試管加入的血液量要力求一致。六、作業(yè)題 1肝素和草酸鉀皆能抗凝，其機(jī)理一樣嗎？為什么？ 2如何加速或延緩血液凝固？試闡明機(jī)理。 3分析上述各因素影響凝固時(shí)間的機(jī)制。 4正常人體內(nèi)血液為什么不發(fā)生凝固？ 5如何認(rèn)識(shí)纖維蛋白原在凝血過程中的作用？八、觀察項(xiàng)目現(xiàn)象及解釋 1取兔動(dòng)脈血10ml，注入兩個(gè)小燒杯內(nèi)，一杯靜置，另一杯用帶有橡皮刷的玻棒或竹簽(也可用小號(hào)試管刷)輕輕攪拌，數(shù)分鐘后，玻棒或竹簽上結(jié)成紅色血團(tuán)。用水沖洗，觀察纖維蛋白形狀。然后比較兩杯的凝血情況。 2準(zhǔn)備好的每支試管中滴入兔血1ml，觀察血液是否發(fā)生凝固及發(fā)生凝固的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Nacl溶液濃度（%） 0.85%0.44%的Nacl溶液呈現(xiàn)上層無色透明，底部紅色沉淀； 注：試管內(nèi)液體上層無色、下層混濁紅色表示無溶血；上層呈紅色表示有部分紅細(xì)胞破裂溶血；溶液上下層為透明紅色表示紅細(xì)胞完全破裂。由結(jié)果可見，紅細(xì)胞懸浮在0.85%0.44%的Nacl溶液中無溶血現(xiàn)象；在0.42%的溶液中剛發(fā)生溶血；在0.35%的溶液中完全溶血；而且在0.420.35%的溶液濃度范圍內(nèi)隨Nacl濃度的降低，溶血現(xiàn)象漸趨明顯。（上述濃度為理論參考值）。紅細(xì)胞在1.9%的尿素溶液中及蒸餾水中完全溶血。 實(shí)驗(yàn)討論 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紅細(xì)胞懸浮在0.85%0.44%的Nacl溶液中無溶血現(xiàn)象；在0.42%的溶液中剛發(fā)生溶血；在0.35%的溶液中完全溶血。這表明：（1）、紅細(xì)胞在等滲氯化鈉即生理鹽水中不溶血；（2）、處于一定范圍的低滲氯化鈉溶液中也不溶血；（3）、處于過度低滲的氯化鈉溶液中才開始溶血，而且溶液濃度越低，破裂溶血的紅細(xì)胞逐漸增多，直至懸浮其中的紅細(xì)胞全部破裂溶血。理論上，懸浮于等滲氯化鈉溶液中紅細(xì)胞必將保持其正常形態(tài)，懸浮于低滲氯化鈉溶液中紅細(xì)胞必將發(fā)生膨脹，當(dāng)滲透濃度低于一定臨界值時(shí)紅細(xì)胞將發(fā)生破裂溶血。引起紅細(xì)胞破裂溶血的氯化鈉溶液濃度不盡相同，這取決于不同紅細(xì)胞對(duì)低滲溶液的抵抗力，生理學(xué)上將紅細(xì)胞的這種抵抗力稱為滲透脆性。此種抵抗力的大小與紅細(xì)胞的厚度有關(guān)。厚度越大，紅細(xì)胞膜面積與體積的比值越小，引起溶血的氯化鈉溶液的濃度越高，即抵抗力越小，則滲透脆性越大；反之，引起溶血的氯化鈉溶液的濃度越低，即抵抗力越大，則滲透脆性越小。引起紅細(xì)胞破裂的最大濃度為其最小抵抗力或最大滲透脆性；剛能引起紅細(xì)胞完全破裂溶血的氯化鈉溶液濃度為其最大抵抗力或最小滲透脆性。另外，1.9%的尿素溶液和0.85%的Nacl溶液雖均為等滲溶液，但尿素溶液中的紅細(xì)胞卻完全溶血。原因在于尿素能自由通過細(xì)胞膜，而氯化鈉則不能。生理學(xué)上將能懸浮于其中的紅細(xì)胞保持正常形態(tài)的等滲溶液稱為等張溶液。如0.85%的Nacl溶液，溶質(zhì)顆粒不能自由通過細(xì)胞膜，且滲透壓也與紅細(xì)胞相等，為等滲等張溶液，故紅細(xì)胞可保持其正常形態(tài)而不發(fā)生溶血。1.9%的尿素是等滲而不是等張溶液，尿素進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)引起紅細(xì)胞膨脹破裂而溶血。實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1、可用引起紅細(xì)胞破裂溶血的低滲NaCl溶液的濃度代表紅細(xì)胞滲透脆性的大?。?2、紅細(xì)胞懸浮于等滲和等張溶液中才能保持其正常形態(tài)。實(shí)驗(yàn)六 生理因素及藥物對(duì)呼吸運(yùn)動(dòng)及膈神經(jīng)放電的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1學(xué)習(xí)用計(jì)算機(jī)生物信號(hào)系統(tǒng)記錄呼吸及膈神經(jīng)放電的方法。 2觀察血液化學(xué)成分改變對(duì)呼吸運(yùn)動(dòng)及膈神經(jīng)放電的影響。 3觀察肺牽張反射以及迷走神經(jīng)在此反射中的作用。二、實(shí)驗(yàn)原理 呼吸運(yùn)動(dòng)能夠有節(jié)律地進(jìn)行，并能適應(yīng)機(jī)體代謝的需要，有賴于呼吸中樞的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)外各種刺激可以直接作用于呼吸中樞或通過不同的感受器反射性地作用呼吸運(yùn)動(dòng)，由此調(diào)節(jié)呼吸運(yùn)動(dòng)的頻率和深度，使肺通氣能適應(yīng)機(jī)體代謝需要。 三、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：家兔。 器材、藥品：哺乳動(dòng)物手術(shù)器械一套、兔手術(shù)臺(tái)、氣管套管、注射器（20ml、5ml各一副）、30cm長的像皮管一根、紗布、線、引導(dǎo)電極固定架、三維調(diào)節(jié)器、玻璃分針、輸液架、壓力換能器或張力換能器、BL-410計(jì)算機(jī)生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)、20%氨基甲酸乙酯溶液、3%乳酸溶液、生理鹽水和液體石蠟（加溫3840C）、10%尼可剎米注射劑、氮?dú)狻O2。 四、方法與步驟 (一) 動(dòng)物準(zhǔn)備 1麻醉與固定 20%氨基甲酸乙酯耳緣靜脈緩慢注射（0.751.0g /kg體重），麻醉完成后背位交叉固定于兔手術(shù)臺(tái)上。 3分離膈神經(jīng) 在頸外靜脈與胸鎖乳突肌之間向縱深分離直至脊柱肌，透過脊柱肌表面淺筋膜可見到頸椎發(fā)出的第3、4、5頸神經(jīng)叢。由頸3、4、5發(fā)出的腹支匯合成如細(xì)絲大小的神經(jīng)分支，緊貼前斜方肌的腹緣并于肌纖維平行走向胸腔。此即為膈神經(jīng)。用玻璃分分針將其分離1.52cm引線備用。最后用熱生理鹽水紗布覆蓋手術(shù)野。4膈神經(jīng)放電的記錄 用止血鉗夾住切口皮膚及組織，向上方牽引固定，使之形成皮兜。在皮兜內(nèi)分離神經(jīng)處滴加40液體石臘保溫防干燥。然后用玻璃分針將膈神經(jīng)輕輕挑入引導(dǎo)電極上，通過三維調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)緊張度，神經(jīng)不可牽拉過緊，記錄電極應(yīng)懸空，避免接觸周圍組織。在頸部皮膚切口處用導(dǎo)線使動(dòng)物接地。 5膈肌放電 將二根記錄電極從劍突下插入使其接觸膈肌以記錄膈肌放電。 6描記呼吸運(yùn)動(dòng) 氣管插管描記法 在頸部插入氣管套管后，Y形管的一側(cè)管與大氣相通，另一側(cè)管用硅膠管與壓力換能器相連。 (二) 儀器的連接及調(diào)試 在桌面上雙擊BL-410機(jī)能系統(tǒng)進(jìn)入界面，用鼠標(biāo)左鍵單擊菜單條的“實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目”菜單項(xiàng)，彈出下拉式菜單，移動(dòng)鼠標(biāo)至“呼吸實(shí)驗(yàn)”，選擇“膈神經(jīng)放電”，用鼠標(biāo)左鍵單擊該項(xiàng)，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)入該實(shí)驗(yàn)記錄存盤狀態(tài)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)K中，1通道記錄膈神經(jīng)放電，2通道記錄呼吸運(yùn)動(dòng)，3通道記錄膈