（環(huán)境科學專業(yè)論文）強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究.pdf

強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 a b s t r a c t i nt h i sp 印e r t h ee f r e c t so fd i 骶r e n tc o n c e n t r a t i o n s0 fd e p r e s s 鋤t so n 鋤a e r o b i c h 2p r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d鋤dm i c r o b i a lc o m m u n i t ) rs t r u c t l l r ew 弱a l s o e x 鋤i n e d b yu s i n g d g g e t h u st l l ef a v o r a b l em i c r o b i a lc o m m 吼i t i e sf o r f e 硼e n t a t i v eh 2p r o d u c t i o n b y 觚a e r o b i cs l u d g ew e 陀o b t a i n e d t t l ee 毹c t so f b e n z o a t ec o n c e n t r a t i o no nc h 4p r o d u c t i o n 鋤db e n z o a t e 鋤r o b i cd e g r a d a t i o n 、e r e 鋤a l y z e d 、v i t l lk i n e t i cm o d e t h ec o n t i n u o u se x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e dt oe x p l o 陀 h o wt 0e n h a n c et h ea c t i v i t ) ro fh 2 - p r o d u c i n g e t o g e n si nu a s br e a c t o ro nt i l eb 硒i s o ft l l er e s u l t so f b a t c he x p e r i m e n t s n l e 鋤a l y s i sr e s u l t sf o rr e l a t i v ea b u l l d 鋤c e so f h 2 p r o d u c i n g e t o g e i l su s i n gf i s h 印p r o a c ha l o n g 誦t l lt 1 1 es m ad e t e n n i n a t i o n d e m o r l s t r a t e dt h a tt h eb a c t e r i a 、 ，e r ee 商c h e d t h em a i nc o n c l u s i o r l sa i ea sf 0 u o 、) r s ： ( 1 ) t h eh 2p r o d u c t i o na b i l 時b y 鋤a e r o b i cs l u d g ec o u l db ei m p r 0 v e dt h r o u g h r e p r e s s i n gm e t l l a n o g e n i ct i v i 夠 謝t l lc h c l 3鋤d p h e n o ip r e 仃e a t m e n t c o r r e s p o n d i n g l y t h ef a v o m b l em i c r o b i a lc o m m u n i 哆s t m c t u r e sf o rh 2p r o d u c t i o nb y 觚r o b i cs l u d g cw e 代f o r m e db yc o n n o l l i n go 唱a i l i ci n h i b i t o r sc o n c e n t r a t i o ni i l a p p r o 砸a t el e v e l 1 1 1 eo p t i m a lc 0 n c e n t r a t i o no fc h c l 3a n dp h e n o lf o rh 2p r o d u c t i o n w e r eo 0 5 0 a n d8 0 0m g c o d l ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) w i t l l1 ) e n z oa t e 舔t h es o l ec a r b o ns o u r c e ，n l em a x i m 啪c h 4y i e l d 觚d s p e c i f i cc h 4p r o d u c t i o nr a t ew e r ea c k e v e da ts u b s 昀t ec o n c e n t r a t i o no f1 o g l 。1 鋤d 1 2 9 l ，r e s p e c t i v e l y t h em a x i m 啪b e n z o a t ec o n c e n t r a t i o nf o rc h 4p r o d u c t i o n 、v 勰 2 7 9 9 l l c o r d i n gt 0h 鋤- l e v e n s p i e lm o d e l 鋤a l y s i s t h eb e n z o a t ed e 伊a d a t i o nr a t e w 觴f o u n dt ob et i l ef i r s to r d e r 誦m i nr 鋤g eo fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n 舶mo 2 o g l ( 3 ) t h eu a s b 陀a c t o r sw e r eo p e r a t e da ti n t e m a lt e m p e 陽t 1 】r eo f3 7 士l ，p ho f 6 8 - 7 2 ，鋤dh r to f3 0 h t h e 孔t i v 時o fh y d r o g e n - p r o d u c i n ga c e t o g e n sc o u l db e e 仃e c t i v e l ye i l h 鋤c e db ya d d i n gs o d i 姍e t a t ei ni n n u e n t ( c o d ：n ：p = 3 0 0 ：5 ：1 ) o f u a s b b o t hs m ao f 鋤a e r o b i cs l u d g e 鋤dr e l a t i v ea b u n d 鋤c e so fh 2 p r o d u c i n g e t o g e n st h r o u 曲a u g m e n t a t i o nw e r ei m p r 0 v e ds i 印i f i c 觚t l yc o m p a r e dt 0c o n 們l s y s t e m n a b s t m c t k e y w o r d s ：b i o h y d r o g e np r o d u c t i o n ； p r e t r e a t m e n t ； u a s b r e a c t o r ； h y d r o g e n p r o d u c i n ga c e t o g e n s ；p c r d g g e ；f i s h u i 第一章引言 第一章引言 1 1 選題背景 經濟和社會的快速發(fā)展使環(huán)境污染問題日趨突出。不可再生的資源和能源被 大量消耗又加劇了環(huán)境污染與能源危機，資源和能源的供應壓力逐漸增大【l 】。因 此，將廢棄物進行高效處理并能資源化是實現可持續(xù)發(fā)展的要求。厭氧生物處理 技術不但能凈化污染，還可有效回收能源物質，是一種環(huán)境友好的廢物處理技術， 應用范圍亦日趨廣泛，由過去主要用于高濃度有機廢水處理和城市污水廠剩余污 泥的穩(wěn)定處置，向處理低濃度有機廢水、含難降解有機物的工業(yè)廢水以及生物質 制取新能源物質等方面拓展【2 一。但是，該技術在實際應用中也存在一些迫切需 要解決的問題如厭氧微生物種群結構的優(yōu)化、難生物降解有機物的資源化、厭氧 反應器運行效率和穩(wěn)定性的提高。 1 2 厭氧生物處理技術研究現狀 厭氧生物處理技術通過多種微生物的協(xié)調作用將有機物轉化為c h 4 和c 0 2 ， 具有能耗低、效率高、污泥產生量少、無二次污染等優(yōu)點而備受關注【”。自2 0 世紀6 0 年代開始，隨高效厭氧反應器如上流式厭氧污泥床反應器( u p f l o w 觚a e r o b i cs l u d g eb l 孤k e t ，u a s b ) 、厭氧顆粒污泥膨脹床反應器( e x p a n d e dg r a n u l a r s l u d g eb e d ，e g s b ) 、厭氧內循環(huán)反應器( i n t e m a lc i r c u l a t i o n ，i c ) 等的相繼出現 使得厭氧生物處理技術發(fā)展迅速，實際應用范圍逐漸擴大，效能不斷提高，在有 機廢水的生物處理過程中發(fā)揮著重要作用6 7 1 。 1 2 1 厭氧生物處理技術原理 厭氧過程的微生物主要有不產甲烷菌和產甲烷菌，其中不產甲烷菌包括產酸 發(fā)酵菌群、產氫產乙酸菌群和同型產乙酸菌群1 8 9 1 。有機廢水厭氧生物處理過程 如圖1 1 所示，分為四個階段。第一階段( 水解發(fā)酵) ，細菌胞外酶將糖類、脂 類等難溶于水的大分子物質水解為易被細菌利用的小分子物質，在發(fā)酵細菌的作 用下，單糖、氨基酸等小分子有機物通過乙醇發(fā)酵、丙酸和丁酸發(fā)酵、混合酸發(fā) 酵轉化為乙醇、揮發(fā)性脂肪酸。第二階段( 產氫產乙酸) ，產氫產乙酸菌將水解 發(fā)酵階段產生的醇類和揮發(fā)性脂肪酸轉化為乙酸、h 2 和c 0 2 ，為產甲烷菌提供 l 強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 底物的同時解除了因揮發(fā)性脂肪酸積累對產酸發(fā)酵菌群產生的抑制作用【i0 1 。有 研究表明，產氫產乙酸菌嚴格厭氧或兼性厭氧，與產甲烷菌和硫酸鹽還原菌等互 生，目前可被分離純化的菌株很少i l 。第三階段( 同型產乙酸) ，同型產乙酸菌 群將h 2 和c 0 2 轉化為乙酸。因h 2 的消耗使得厭氧體系氫分壓降低，有利于厭氧 消化過程的進行，產物被產甲烷菌利用合成甲烷。第四階段( 產甲烷) ，產甲烷 菌利用前三階段產生的乙酸、甲醇、甲酸、h 2 、c 0 2 等合成c h 4 。 圖1 1 復雜有機物厭氧生物降解不恿圖 f g 1 1a n r o b i cb i o d e 筍a d a t i o no fc o m p l e xo 瑪鋤i cc o m p o u n d s 1 2 2 有機廢水厭氧生物處理進展 有機廢水厭氧生物處理技術發(fā)展分為三個階段【1 2 】，每一階段均以一種新型反 應器為代表。第一階段( 2 0 世紀6 0 年代以前) 以第一代厭氧反應器厭氧消化池 為代表，主要用于污泥處理。但反應器內微生物濃度較低，處理效果較差。第二 階段( 2 0 世紀6 0 一8 0 年代) 以上流式厭氧污泥床反應器( u a s b ) 為代表。其 具有污泥濃度高、容積負荷高、無需攪拌等優(yōu)點，廣泛應用于難生物降解有機廢 2 第一章引言 水的處理以及廢水的資源化【1 3 15 1 。第三階段( 2 0 世紀8 0 年代以后) 以第三代厭 氧反應器如i c 和e g s b 反應器為代表，解決了u a s b 反應器在運行過程中出現 的不足，如短流、堵塞等問題，進一步提高容積負荷和處理效率，擴大了適用范 圍【引。 1 2 3 厭氧生物過程限速步驟分析 厭氧生物處理過程需要水解發(fā)酵菌群、產氫產乙酸菌群、同型產乙酸菌群和 產甲烷菌相互協(xié)調才能順利完成。研究顯示一旦厭氧過程中v f i a s 大量積累，超 過了產氫產乙酸菌的轉化能力，導致系統(tǒng)p h 下降，會抑制產甲烷菌的活性【1 9 l 。 從熱力學角度分析，甲烷化過程可自發(fā)進行，而產氫產乙酸過程需消耗能量。因 此，甲烷化過程較產氫產乙酸過程更易進行【2 0 川。產氫產乙酸菌生長緩慢、生長 條件苛刻，在營養(yǎng)生態(tài)位上位于產酸發(fā)酵菌群和產甲烷菌群之間，其轉化乙醇和 揮發(fā)性脂肪酸為乙酸的能力較弱。故產乙酸菌群的產乙酸作用是厭氧生物處理過 程的第一限速步驟1 2 2 1 。 產氫產乙酸菌群在功能生態(tài)位上起到承上啟下的重要作用，強化其產氫產乙 酸作用，增強其代謝活性，將有助于提高厭氧反應器的處理效能和運行穩(wěn)定性。 產氫產乙酸菌群的代謝活性易受到環(huán)境因素的影響【2 3 1 ，如進水成分、p h 和溫度 等。通過控制厭氧反應器的運行條件富集產氫產乙酸菌群，能加快其對乙醇和揮 發(fā)性脂肪酸的轉化利用，為產甲烷茵提供可利用的底物，進而提高厭氧反應器的 處理效率。同時，可以產生清潔能源h 2 和c h 4 ，實現有機廢水生物處理的資源 化1 2 4 1 。 1 3 研究的目的、意義和內容 1 3 1 研究目的及意義 利用有機溶劑對厭氧污泥進行預處理，優(yōu)化微生物種群結構，構建最佳產氫 微生物群落，強化有機廢水的厭氧生物轉化作用；利用微生物厭氧降解難降解有 機物，實現資源化利用；加富產氫產乙酸菌群，解決厭氧生物處理過程的限速步 驟問題，提高厭氧反應器的處理效能。本課題對有機廢水的資源化利用和厭氧生 物處理效能的提高具有重大意義。 3 強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 1 3 2 研究內容 ( 1 ) 厭氧污泥前處理與種群結構優(yōu)化 采用不同濃度氯仿和苯酚處理厭氧污泥，進行發(fā)酵產氫實驗；分析氣相產物、 液相產物及微生物多樣性，構建最佳產氫微生物群落結構。研究厭氧污泥的產氫 能力及微生物群落結構的穩(wěn)定性。 ( 2 ) 有機物的厭氧生物轉化 研究以苯甲酸為唯一碳源進行發(fā)酵產甲烷實驗，利用動力學模型分析底物濃 度對厭氧污泥發(fā)酵產甲烷能力的影響及苯甲酸的厭氧降解動力學過程。 ( 3 ) 高效厭氧反應器系統(tǒng)的構建 通過運行條件的控制( 進水成分、p h 和溫度等) ，強化厭氧生物處理過程中 產氫產乙酸作用。利用熒光原位雜交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ， f i s h ) 技術對反應器內產氫產乙酸菌群進行定量分析。通過測定厭氧污泥比產 甲烷活性( s p e c i f i cm e t l l 鋤o g e m ca c t i v 時，s m a ) 的變化及液相末端產物的組成 分布，獲得富集產氫產乙酸菌群的技術，提高厭氧反應器的處理效能。 1 3 3 課題研究技術路線 利用c h c l 3 和苯酚預處理厭氧污泥，優(yōu)化微生物種群結構，強化有機廢水的 厭氧生物轉化作用；利用微生物厭氧降解苯甲酸，實現資源化利用；在以上間歇 實驗的基礎上進行連續(xù)流實驗，通過控制u a s b 反應器的運行條件，強化產氫 產乙酸作用，并獲得u a s b 反應器高效穩(wěn)定運行的控制條件。課題研究技術路 線見圖1 2 。 4 第一章引言 圖1 2 課題研究技術路線圖 f i g 1 2t e c t l n o i o 科r o u t eo ft h e 陀s e a r c h 5 強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 第二章厭氧污泥種群結構的優(yōu)化 h 2 作為一種可再生的清潔能源，具有能量密度高、轉化率高、應用范圍廣等 優(yōu)點1 2 5 1 。目前9 0 的氫以不可再生的能源為原料通過化學法制取，能量消耗高 且易引起環(huán)境污染2 6 1 。與化學方法相比，厭氧生物制氫技術具有低能耗、低成 本、可利用多種有機廢棄物等優(yōu)點。但厭氧發(fā)酵制氫中，h 2 易被產甲烷茵、同 型產乙酸菌、硫酸鹽還原菌等耗氫菌消耗，從而造成氫氣產率降低1 2 7 l 。有研究 表明，對厭氧污泥進行預處理，可有效抑制耗氫菌活性，從而富集產氫菌，以達 到提高厭氧污泥的發(fā)酵產氫能力的目的【2 8 】。 厭氧污泥前處理方法主要有酸堿處理、熱處理、曝氣處理、超聲處理、有機 抑制劑處理等1 2 7 2 9 1 。在有些研究中熱處理被認為是提高污泥產氫效能的最有效的 措施1 3 們。而另一些研究中顯示化學預處理方法，如酸、堿、有機物的添加( 三 氯甲烷、苯酚) 可有效提高產氫效率【3 。與酸、堿、熱處理方法相比，三氯甲 烷、苯酚等有機抑制劑能抑制污泥中耗氫菌如產甲烷菌的活性【3 2 l 。本章研究了 不同濃度c h c l 3 和苯酚處理厭氧污泥的發(fā)酵產氫效能：采用p c r d g g e 技術分 析了微生物種群多樣性的變化和微生物群落結構。 2 1 材料與方法 2 1 1 接種污泥與產氫 接種污泥取自處理工業(yè)廢水的厭氧反應器。在使用之前，水洗三次并過孔徑 2 0m m 篩，以去除粒徑較大的物質。原始污泥樣品記為y 。 c h c l 3 處理厭氧污泥發(fā)酵產氫：實驗在6 0 0 m l 玻璃反應器中進行，分別向 其中加入1 0 0 m l 厭氧污泥和o 3 m l 營養(yǎng)液，營養(yǎng)液【3 3 】組成為( m g l 。1 ) ：c 6 h 1 2 0 6 l o ，o o o ；n h 4 h c 0 32 0 2 4 ；n a c ll o ；k 2 h p 0 4 3 h 2 08 0 0 ；c a c l 25 0 ：m g c l 2 6 h 2 0l o o ： f e c l 22 5 ；c u c l 2 5 h 2 05 ；c o c l 2 6 h 2 05 ；m n c l 2 4 h 2 05 ；a l c l 32 5 ；z n c l 25 ； n i c l 2 6 h 2 05 ；( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 41 5 ；h 3 8 0 45 。用蒸餾水定容至3 0 0 m l ，調p h 至 7 0 ，向玻璃反應器中充高純氬氣3 m i n 以保證厭氧環(huán)境，并迅速密封。分別向玻 璃反應器中注入0 0 0 0 、0 0 2 5 、o 0 5 0 、0 0 7 5 、0 1 0 0 、0 1 2 5 、o 1 5 0 、 0 1 7 5 、o 2 0 0 ( 質量百分百比) c h c l 3 溶液，置于( 3 6 士1 ) 、1 2 0 印m 恒溫 6 第二章厭氧污泥種群結構的優(yōu)化 搖床中進行發(fā)酵產氫實驗。污泥樣品分別記為f 1 、f 2 、f 3 、f 4 、f 5 、f 6 、f 7 、 f 8 和f 9 。 產氫停止后對污泥進行離心、蒸餾水沖洗5 次以去除剩余葡萄糖和反應過程 中生成的液相產物。將污泥樣品接種到新鮮的培養(yǎng)基，再次進行發(fā)酵產氫實驗， 條件同上。反應結束后樣品分別記為s l 、s 2 、s 3 、s 4 、s 5 、s 6 、s 7 、s 8 和s 9 。 所有污泥樣品設置3 個平行樣。 苯酚處理厭氧污泥發(fā)酵產氫：取1l 份l0 0 m l 厭氧污泥接入6 0 0m l 的玻璃 反應器中，然后依次加入3 0 9 葡萄糖、o 3 m l 營養(yǎng)液，體積控制為3 0 0 m l ，用l m o l l dh c l 或lm o l - l 。1n a o h 將p h 調至7 0 ；鼓氬氣3 m i n ，迅速用橡膠塞密封， 依次注入不同濃度的苯酚溶液( 苯酚濃度4 2 0 m g l 1 = c o d l o o o m g l 1 ) ：o 、4 0 0 、 8 0 0 、1 2 0 0 、1 6 0 0 、2 0 0 0 、2 4 0 0 、3 0 0 0 、4 0 0 0 、5 0 0 0 、7 0 0 0 ( 實驗結束后的污泥 樣品記為b l 、b 2 、b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 7 、b 8 、b 9 、b 1 0 、b 1 1 ) ，置于( 3 6 士1 ) 、1 2 0r p m 的恒溫搖床中進行發(fā)酵產氫實驗，設置3 個重復。 2 1 2 理化性質分析方法 v s s 和p h 的測定采用標準方法1 3 4 1 ，總糖用葸酮法測定1 3 5 1 。氫氣含量采用氣 相色譜法測定，取1 0 0 l 樣品注入配備有不銹鋼填充柱( g d x 1 0 2 ) 的氣相色 譜儀( s p 一6 8 0 0 a 6 ) 中進行分析；檢測器為熱導池，橋電流8 0 m a ：進樣器、色 譜柱和檢測器的溫度分別為l o o ，6 0 和1 0 5 ；載氣為高純氦氣，流速3 0 m l m i i l 一。 揮發(fā)性脂肪酸( v 0 l a t i l ef a t t ) ，a c i d ，v f a ) 和苯酚的測定采用氣相色譜法( 安 捷倫6 8 9 0 ) ，配備有毛細管柱d b f f a p ( 3 0m o 2 5m m o 2 5p m ) 的。液體樣 品1 2 0 0 0 叩m 離心l o m i n ，與3 甲酸等體積混合，并使用o 4 5 肛m 水系濾膜過濾， 處理后樣品待測。進樣器和檢測器溫度分別為2 2 0 、2 3 0 ，采用程序升溫的 方法，初溫l o o 保持3 m i n ，以2 0 m i nj 的速率升溫至1 8 0 ，終溫1 8 0 保 持3 m i n 。載氣為氮氣，流速5 0m l m i n 一。用g o m p e n z 方程分析累積氫的變化1 3 6 】： = 尸a ( p 一a ( p 【! 筆( 九一，) + 1 】) ( 2 1 ) r 式中，日( m l ) 為累積氫，p ( m l ) 為潛在累積氫，尺m ( m l h j ) 為最大產 氫速率，九( h ) 為延滯期。 7 強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 2 1 3 微生物多樣性分析方法 2 1 3 1 厭氧污泥總d n a 的提取 總d n a 的提取方法參考文獻進行1 3 7 】。取厭氧污泥1 2 m l ，依次加入0 1 m o l l 1 p b s ( p h 8 0 ) 5 4 0 p l ， 1 5 m o l l 1n a c l ，o 1m o l l 1 t r i sb a s e ( p h 8 0 ) ， o 1 m o l l 1 e d t a 和8 l 蛋白酶k ( 1 0 m g m l 1 ) ，3 7 、2 2 5 r m i n - 1 振蕩3 0 m i n ， 然后加入2 0 的s d s 6 0 “l(fā) ，6 5 水浴2 h 。將上述樣品8 0 0 0 印m 離心1 0 m i n 后取 上清，向其中加入等體積酚氯仿異戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混勻后離心l o m i n ，取上 清，并重復此步驟一次。加入等體積的氯仿異戊醇( 2 4 ：1 ) ，8 0 0 0 印m 離心1 0 m i n ， 取上清，并向其中加入o 6 倍體積的異丙醇，室溫沉淀2 h ，1 2 0 0 0 印m 離心2 0 m i n ， 棄上清，用7 0 冰乙醇清洗兩次，無菌吹干，加入3 0 “l(fā) t e 緩沖液溶解沉淀，置 于2 0 保存?zhèn)溆谩?2 1 3 2p c r 擴：噌 對提取的總d n a 采用嵌套式p c r 擴增【3 引。第一套p c r 擴增：引物為f o r ( 5 - g a g l l t g a t c c t g g c t c a g - 3 ) 和d e v ( 5 a g a a a g g a g g t g a t c c a g c c 3 ) ，反應體系5 0 “l(fā) ：5 lp c r b u f l f e r ， 1 p ld n t p s ，上下游引物各2 p l ，2 “l(fā) 模版，o 5 lt a q 酶，用超純水補至5 0 “l(fā) 。 反應程序：9 4 5 m i n ；前2 0 個循環(huán)，6 5 5 5 ( 每個循環(huán)降o 5 ) 4 5 s ， 7 2 1 2 0 s ，后1 0 個循環(huán)9 4 6 0 s ，5 5 4 5 s ，7 2 1 2 0 s ：7 2 5 m i n 。 第二套 p c r擴增：引物為特異性引物g c f 3 5 7 ( 5 c g c c c g c c g c g c g c g g c g g g c g g g g c g g g g g c a c g g g g g g c c t a c g g g a g g c a g c a g 3 ) 和r 9 0 7 ( 5 c c g t c a a t t c c t l t r a g t l v r - 3 ) ，反應體 系5 0 p l ：5 “l(fā)p c rb u f f e r ，l p ld n t p s ，弓i 物各2 “l(fā) ，o 5 p lt a q 酶，2 “l(fā) 模 板( 一輪擴增產物的1 0 0 倍稀釋液) ，用超純水補至5 0 “l(fā) 。反應程序： 9 4 5 m i n ：前2 0 個循環(huán)為9 4 6 0 s ，6 5 5 5 ( 每個循環(huán)降o 5 ) l m i n ，7 2 3 m i n ， 后1 0 個循環(huán)為9 4 6 0 s ，5 5 l m i n ，7 2 3 m i n ；7 2 8 m i n 。擴增產物2 0 保存。 2 1 3 3d g g e 分析 使用第二輪p c r 擴增產物進行d g g e 電泳。聚丙烯酰胺凝膠濃度為6 ，變 性劑濃度梯度為4 5 6 5 。每孔加入2 5 “l(fā)p c r 產物和6 “l(fā) 的緩沖液，置于6 0 、 8 第二章厭氧污泥種群結構的優(yōu)化 電壓1 0 0 v 的l t a e 緩沖液中電泳1 7 h ，然后用核酸染料避光染色3 0 m i n ，用雙 蒸水清洗后，使用t a l l o n 凝膠成像系統(tǒng)對圖像進行采集。 2 1 3 4 克隆測序與構建系統(tǒng)進化樹 選d g g e 圖譜上的主要條帶進行p c r 擴增，引物為不含g c 夾f 3 5 7 和r 9 0 7 。采 用上海生工膠回收試劑盒對目的產物進行回收純化。用p c r 產物克隆試劑盒將擴 增產物與p e a s y t l 載體連接，轉化到e 療感受態(tài)細胞，在3 7 孵育1 h ，將其 涂布于含氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板上，3 7 培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落于3 7 搖 床振蕩培養(yǎng)4 6 h ，用特異性引物m 1 3 進行菌落p c r 。選擇陽性克隆子菌液進行測 序，所得序列與g e n b a l l l ( 數據庫中所含序列進行比對分析后構建系統(tǒng)發(fā)育樹 ( m e g “1 ) 【3 9 1 。 2 2 結果與討論 2 2 1c h c l 3 處理污泥厭氧發(fā)酵產氫 2 2 1 1c h c l 3 濃度對厭氧污泥發(fā)酵產氫的影響 不同濃度c h c l 3 對污泥發(fā)酵產氫的影響見表2 1 。在低的c h c l 3 濃度范圍內 ( o 0 0 5 0 ) ，累積h 2 、最大產h 2 速率、h 2 含量、h 2 產率和葡萄糖轉化率隨 c h c l 3 濃度的增加逐漸增大；c h c l 3 濃度在o 0 5 0 加1 2 5 時，各參數逐漸減小； 當濃度大于o 1 2 5 時，無h 2 產生。在第一次實驗中，當c h c l 3 濃度為o 0 5 0 時，累積h 2 ( 7 5 3 m l ) 和葡萄糖轉化率( 9 9 9 3 ) 均達到最大值。綜合考慮以 上各參數，o 0 5 0 為最適產氫c h c l 3 濃度。 為研究c h c l 3 處理厭氧污泥產氫的穩(wěn)定性，將第一次實驗結束后的污泥離心 沉淀，水沖洗后接入新鮮的培養(yǎng)基，進行再次發(fā)酵產氫實驗。如表2 1 所示，當 c h c l 3 濃度為o o 0 5 0 時，累積h 2 等變化趨勢與第一次產氫實驗結果一致。在 濃度為o 0 5 0 時，累積h 2 、最大產h 2 速率、h 2 產率和葡萄糖轉化率均達到最 大值；c h c l 3 濃度大于o 0 5 0 時，各參數逐漸減小。與第一次產氫實驗相比， c h c l 3 濃度大于o 1 2 5 時，仍有h 2 產生且無c h 4 。這表明，c h c l 3 抑制產甲烷 菌的活性在c h c l 3 去除后仍難以恢復，但是產氫菌的活性不受影響，產氫能力具 較好的穩(wěn)定性。 9 強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 表2 1 兩批發(fā)酵產氫實驗結果比較 t h b i e2 1 c o m p a r a t i v eh 2p r o d u c t i o no ff i r s ta n dr e p e a t e de x p e r i m e n t s p 猢e l 粥 c h c l l o 0 0 0 0 0 2 5 0 0 5 0 o 0 7 5 0 10 0 o 12 5 o i5 0 o 17 5 0 2 0 0 厭氧發(fā)酵產氫過程中常伴隨大量脂肪酸的產生，添加不同濃度的c h c l 3 顯著 影響液相產物的分布。乙醇、乙酸、丙酸和丁酸等主要液相產物的分布見圖2 1 。 在第一、第二批次實驗中，丁酸( 2 1 1 0 一5 8 6 8m m ) 和乙酸( 2 8 _ 4 8 6m m ) 是主 要的液相產物。丁酸隨c h c l 3 濃度的變化趨勢與累積氫一致，在c h c l 3 濃度為 o 0 5 0 時，丁酸濃度最大為5 8 6 8 m m ，當c h c l 3 濃度大于o 1 2 5 時，v f a s 的 濃度較低。如圖2 1 所示，除樣品f 7 f 9 外，其他樣品產氫結束后的液相產物中 丁酸含量最大，且丁酸乙酸 l ，故厭氧發(fā)酵類型均是典型的丁酸型發(fā)酵。 l o 第二章厭氧污泥種群結構的優(yōu)化 o 圖2 1 主要液相產物分布圖：a ：第一批實驗b ：第二批實驗 f i g 2 1t h e d i s t r i b u t i o no fs o l u b l em e t a b o l i t e so ff i r s t ( a ) a n dr e p e a t e db a t c ht e s t ( b ) 2 2 1 2 微生物種群多樣性分析 c h c l 3 顯著影響微生物群落結構，對微生物具有選擇作用。圖2 2 為不同 c h c l 3 濃度下厭氧污泥的d g g e 圖譜。在f 1 f 9 中，隨c h c l 3 濃度的變化，一 些條帶出現( 條帶1 5 、1 6 ) ，一些條帶消失( 條帶1 、1 3 、1 4 ) ，而一些菌群沒有 發(fā)生變化( 條帶3 、4 、6 、7 ) 。在樣品s 1 s 9 中，一些菌群含量逐漸減少( 條帶 強化有機j ：i f 水厭氧生物轉化作用研究 8 ) ，一些菌群含量逐漸增加( 條帶1 0 ) ，與第一批樣品比較，條帶9 、11 1 6 消失。 圖2 2 不同c h c l 3 濃度下污泥d g g e 圖譜 f i g 2 2d g g ep r o 行l(wèi) e so fs l u d g es a m p i e sw i t hd i 伺 e r e n tc h c l 3c o n c e n t r a t i o n st r e a t m e n t 注：y ：接種污泥樣品：f 1 f 9 ：添加不同濃度c h c l 3 進行產氫實驗后的污泥樣品；s 1 s 9 ： 玄除c h c l 3 進行產氫實驗后的污泥樣品。 n o t e ：y ：t h ei n i t i a ls e e ds l u d g es a m p l e ；fl f 9 ：t h es l u d g es a m p l e st r e a t e dw i t hd i f f e r e n t c h c l 3c o n c e n t r a t i o n sa tt h ee n do ff i r s tb a t c he x p e r i m e n t sl s 9 ：t h es i u d g es a m p i e so fr e m o v i n g c h c l 3a tt h ee n do tr e p e a t e de x p e n m e n t 構建系統(tǒng)發(fā)育樹( 圖2 3 ) 并進行比對結果見表2 2 。全部1 6 個克隆序列分 罹予b t l r k h o l d e r i a l e s ，c o r i o b n c | e r i n l e sa 媳c i o s l r i d i a l e s 。存在_ 于除1 1 9 桷既奄樣 品中條帶4 與蚴印辦口p 陽p 口“c f v d m ，? ss t r a i nv t te 一0 3 2 3 4 l ( 嚴格厭氧的g + 菌) 的相似度達到9 9 ，為h p b f 4 0 4 。嚴格厭氧的g + 菌c s ，砌“聊( 條帶6 、7 ) 是 主要的產氫菌屬【4 2 4 3 1 。條帶6 ( c - f d s ，油“mc p ，f 材，d s fs t r a i nd 3 ) 存在于所有樣品中， 高濃度的c h c l 3 抑制產氫菌的活性，故樣品f 7 f 9 無氫氣產生。存在于除f 9 和 s 9 的所有樣品中的條帶7 屬于嘞j 肛肋z 刪s p h p b 4 ，對c h c l 3 具有一定的耐性， 但c h c l 3 濃度過高亦會使其失去活性。 1 2 b t l r l l o ! d e r i n i 縞 - 。叫 o 0 2 圖2 3 基于1 6 sr d n a 序列的優(yōu)勢種群系統(tǒng)發(fā)育樹 f i g 2 3p h y l o g e n e t i c 垤eo fd o m i n a mm i c r o b i a is p e c i e sb 笛e do nl6 sr d n a 辯q u e n 注：以n e i g l l b o r j o i n i n g 方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹；b 鋤d 標記為d g g e 圖譜中用于再擴增條帶 的1 6 sr d n a 序列；節(jié)點數字為以b 0 0 t s t m p1 0 0 0 次進行自展分析的支持率：標尺0 0 2 為2 的核苷酸替換頻率。 n o t e ：p h y lo | g e n e t i c 訂e ew 撼c o n s 仃u c t e d 吣i n gn e i g h b o r j o i n i n ga l g o r i t h m t h em a r k e db 卸d 1 3 強化有機廢水厭氧生物轉化作用研究 w 豳r e a m p l i n e dl6 sr d n ag e n es e q u e n c e sf r o md g g eb a n d n u m b e r sa te a c hn o d ei n d i c a t et h e s u p p o r t i n gp e r n t a g eb yb o o t s t r a p 鋤a l y s i sw i t h lo o oi t e r a t i o n s t h e a l eb a r 他p 陀s e n t so 0 2 s u b s t i t u t i o n sp e rn u c l e o t i d ep o s i t i o n u n c u l t u r e dd 西p 刀p ，口印c l o n ej 2 7 ( 條帶1 ) 僅出現在樣品f 1 f 8 中，其含量 隨c h c l 3 濃度的增加逐漸減少，與累積氫的變化趨勢一致，故u n c u l t u r e d 佻p ”p 砌 可能為h p b 。u n c u l t u r e db a c t e r i 哪c l o n e1 9 8 ( 條帶1 5 ) 的含量隨c h c l 3 濃度增 加逐漸增大，其變化趨勢與累積氫相反，需要進一步研究其生理特性。條帶1 6 與u n c u l t u r e db 材，砌d ，出，f 口c p 口pb a c t e r i u m 的相似度為9 4 ，在c h c l 3 濃度大于 o 1 5 0 時，此菌仍具有一定的活性。脅，6 唧f ，f 刀刪s p p t 5 ( 條帶8 ) 僅存在于 少量樣品中( y 、f l 、f 2 、f 7 f 9 、s 1 s 3 ) ，可適應c h c l 3 濃度較低的環(huán)境，但 高濃度的c h c l 3 會抑制其活性。條帶3 、1 0 與婦甩，廳加d 6 口c 陀，f “朋s p 7 、 七月砌加d 6 口c 胞，- f 姍，s p l e l b 4 6 的相似度分別為1 0 0 、9 9 ，如療，廳f 刀d 6 口c 胞，f 姍zs p l e l b 4 6 ，僅存在于樣品s 2 s 9 中，其相對含量的變化趨勢與累積氫一致，故為 h p b 【4 4 1 。條帶1 3 、1 4 的克隆序列屬于不可培養(yǎng)細菌，僅存在于樣品y 中，在 c h c l 3 濃度較低的環(huán)境中其活性即被抑制。 1 4 第二章厭氧污泥種群結構的優(yōu)化 表2 2d g g e 優(yōu)勢條帶的基因序列比對結果 t a b l e2 2a 幣l i a t i o no fd g g ed o m i n a n tb a n d sb yt h e16 sr d n as e q u 朗c e so fv 鰣。吣s 鋤p l e s 2 2 1 3 最適產氫微生物種群結構 c h c l 3 濃度為o 0 5 0 ( f 3 ) 時，累積氫、h 2 含量、最大產h 2 速率和底物利 用率均達到最大值，污泥產氫效果最好。c h c l 3 去除后，以上各參數的變化趨勢 與第一批次實驗結果一致。微生物多樣性分析結果表明，樣品- s 3 與f 3 具有相 似的微生物群落結構，是最適產氫微生物群落，主要的微生物有u n c u l t u r e d b a c t e r i 哪c l o n en b tl7 6 c ol 、，口玎，辦伽d 6 口c ，p ，甜小s p 7 、 zp 口“c f ，d ，口力ss t r a i nv t t e - 0 3 2 3 4 l 、c 卯，”，d s fs n 面nd 3 、c - d s 護觸“朋s p h p b - 4 。這表明，c h c l 3 處理厭 氧污泥后，微生物群落結構具有一定的穩(wěn)定性。 強化有機尸發(fā)水厭氧生物轉化作用研究 2 2 2 苯酚處理污泥厭氧發(fā)酵產氫 2 2 2 1 底物的轉化與產氫 不同濃度苯酚處理厭氧污泥發(fā)酵產氫，累積h 2 、底物降解率等參數變化見 表2 3 。累積氫隨苯酚濃度的增加而增加，在濃度為8 0 0 m gc o d l 。1 時，h 2 體積 達到最大值3 2 4 2 m l ，同時，產h 2 速率、h 2 產率和總糖降解率均達到最大，分 別為2 6 8m l h 一、o 8 7m o lh 2 m o l 1g l u c o s e 、9 9 9 4 ；然后累積h 2 隨苯酚濃度的 增加而降低，在濃度為7 0 0 0 m gc o d l d 時，無h 2 生成，這主要是因為高濃度的 苯酚對產氫菌的活性產生抑制作用1 4 ”。圖2 4 為發(fā)酵液中v f a s 各組分含量，乙 酸、丙酸和丁酸是主要的代謝產物，且丁酸濃度隨苯酚濃度的變化趨勢與累積氫 一致。反應結束后，p h 均有不同程度下降，這主要與發(fā)酵制氫過程中v f a s 的 生成有關。綜合分析結果表明，厭氧污泥最適產氫苯酚濃度為8 0 0 m gc o d l 一。 表2 3 不同苯酚濃度對厭氧污泥發(fā)酵產氫的影響 t a b l e2 3e f to fd i 毹r e n tc o n c e n 仃a t i o 璐o fp h e n o lo n 鋤r o b i ch 2p r o d u c t i o n 在厭氧條件下，苯酚首先轉化為中間產物，再徹底分解為c h 4 和c 0 2 。本 研究中，反應結束后，樣品中苯酚的濃度均有一定程度的下降，但在整個反應過 程中，未檢測出c h 4 。這表明苯酚被轉化為中間產物，沒有徹底分解。 1 6 第二章厭氧污泥種群結構的優(yōu)化 ，、 莖 e c o d m 蟣) 圖2 4 主要液相產物各組分含量 f i g 2 4d i s 仃i b u t i o no fs o l u b l em e t a b o l i t e s 2 2 2 2 微生物種群多樣性分析 根據d g g e 圖譜可半定量分析不同菌群的相對含量【矧。由圖2 5 可以看出， 苯酚對厭氧污泥中微生物群落結構具有顯著影響，隨苯酚濃度的增加，不同樣品 中菌群的相對含量有增加( 條帶l o 、1 1 、1 7 ) ，有減少( 條帶1 4 ) ，甚至消失( 條 帶7 ) 。其中，一些菌群的相對含量無明顯變化( 條帶5 、6 、1 3 ) 。 1 7 8lioa四_dic q i q = l o - o co一萎_cdocoj 強化有機廢水從鋱生物轉化作用研究 圖2 5 小l 剄苯酚派廈f 污泥d g g e 圖諸 f i g 2 5d g g ep r o n l e so fs l u d g es a m p l e sa td i f l 一e r e n tp h e n o lc o n c e n t r a t i o n s 注：b 1 b 1 1 ：添加不同濃度苯酚發(fā)酵產氫結束后的污泥樣品 n o t e ：b1 一bl1