（植物學(xué)專業(yè)論文）人參液泡膜水孔蛋白基因pgtip1的克隆和功能研究.pdf

摘要 人參液泡膜水孔蛋白基因堙刪的克隆和功能研究 水孔蛋白屬于主要膜內(nèi)蛋白家族，是一種水分跨膜運(yùn)輸?shù)墓δ苄缘耐ǖ?蛋白。植物細(xì)胞的生長、發(fā)育與細(xì)胞內(nèi)的水分狀況密切相關(guān)，在生長發(fā)育 過程中不同水孔蛋白在時空上的特異表達(dá)表明它們參與了植物生理活動的 方方面面。植物組織在體外培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)失去對外源激素的依賴性形 成激素馴化細(xì)胞的現(xiàn)象，但目前為止激素馴化的生理機(jī)制尚未被揭示。我 們在研究激素馴化人參細(xì)胞的生長機(jī)理時首次發(fā)現(xiàn)并克隆了在馴化細(xì)胞中 特異表達(dá)的人參液泡膜水孔蛋白基因p g 皿p j ，并對它的生理功能進(jìn)行了研 究。本論文的工作分兩部分，第一部分是激素馴化人參細(xì)胞系的建立，第 二部分是人參液泡膜水孔蛋白基因段兒p 的克隆和功能研究。 激素馴化是指體外培養(yǎng)的植物細(xì)胞失去對外源生長因子需要的穩(wěn)定的 可遺傳的特征，這種現(xiàn)象在胡蘿h 、煙草、馬鈴薯、甜菜、大豆等多種植 物中有過報道。我們從依賴外源生長素和細(xì)胞分裂素培養(yǎng)的人參細(xì)胞系出 發(fā)，通過馴化、篩選獲得了不依賴任何外源激素培養(yǎng)的細(xì)胞系，并且細(xì)胞 的生長狀態(tài)和生長速度與激素依賴細(xì)胞系相似。通過掃描電鏡進(jìn)行的細(xì)胞 形態(tài)觀察結(jié)果也表明兩類細(xì)胞的形態(tài)和大小均無明顯差異。人參總皂甙含 量的測定結(jié)果顯示激素馴化人參細(xì)胞系的皂甙含量高于激素依賴細(xì)胞系， 同時，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( r 1 二p c r ) 的結(jié)果進(jìn)一步證明了皂甙合成關(guān) 鍵酶鯊烯合成酶( s q s ) 和鯊烯環(huán)氧酶( s q e ) 基因在激素馴化人參細(xì)胞中 的表達(dá)高于激素依賴的人參細(xì)胞，暗示了激素馴化人參細(xì)胞系可能具有更 強(qiáng)的皂甙合成能力。由于外源施加的激素類物質(zhì)會在一定程度上給培養(yǎng)物 帶來毒副作用，因此培養(yǎng)激素馴化細(xì)胞對植物細(xì)胞工程的研究和發(fā)展具有 重要的意義。 通過抑制差減雜交和e d n a 文庫的篩選，我們發(fā)現(xiàn)并克隆了激素馴化 人參細(xì)胞系中特異表達(dá)的液泡膜水孔蛋白基因晗z z p j 。以激素馴化人參懸 浮細(xì)胞為材料，對施加外源k t ( o 2 5 m g l 4 ) 和2 ，4 - d ( 1 5 m g l 。) 處理時 段z 妒，的表達(dá)變化作檢測，實時( r e a l t i m e ) 熒光r t - p c r 的結(jié)果表明，k t 能夠顯著上調(diào)朋丁z 尸j 的表達(dá)，而2 ，4 - d 處理則抑制了p g z 妒j 的表達(dá)，二 者共同作用時殿勉p j 表達(dá)也明顯受到了抑制，以上結(jié)果無論是在對植物細(xì) 胞激素馴化機(jī)理的探討中還是在對水孔蛋白的研究中都是沒有報導(dǎo)過的。 由于職z z p 是首次克隆到的人參水孔蛋白基因，我們還從生物信息學(xué)和體 外功能驗證上對其進(jìn)行了進(jìn)一步確認(rèn)。p g t i p l 的序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 均表明它具有水孔蛋白的特征性序列和結(jié)構(gòu)，爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)實驗也證 明了p g t i p l 是一個功能性的水孔蛋白。將強(qiáng)7 z p j 與g f p 融合表達(dá)對其進(jìn) 行的定位分析表明它主要定位于液泡膜上。由于p g 觀p j 特異表達(dá)于不依賴 外源激素培養(yǎng)的細(xì)胞中，我們推測它極有可能參與了植物細(xì)胞的生長發(fā)育。 通過在擬南芥中過量表達(dá)人參液泡膜水孔蛋白基因段z z p j ，我們對它的生 理功能作了初步研究。結(jié)果表明，過表達(dá)颶丁z p j 擬南芥的早期生長發(fā)育速 度快于野生型擬南芥，主要表現(xiàn)在根的長度增加、葉細(xì)胞變大及開花時間 早于野生型對照。另外，過表達(dá)p g z z p j 擬南芥的種子大小和重量都高于野 生型擬南芥種子，同時，種子中的脂肪酸含量達(dá)到了野生型的1 8 s 倍。以 上結(jié)果表明贍z z p j 不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長，而且還可能在植物種子中的 物質(zhì)儲藏和脂類代謝中起作用。 關(guān)鍵詞植物激素水孔蛋白人參擬南芥 a b s t r a c t c l o n i n ga n d f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no fp g t i pl ，at o n o p l a s ta q u a p o r i ni n p a n a x g i n s e n g w u - l i n gl i n l a n ts c i e n c e ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rw e i m i n gc a i a q u a p o r i n sa r ew a t e rc h a r m e lp r o t e i n sf o u n di nt h em e m b r a n e sa n db e l o n g t ot h em a j o ri n t r i n s i cp r o t e i n ( m i p ) f a m i l y 1 1 1 er e g u l a t i o no fc e l l u l a rw a t e r m o v e m e n ta n dh o m e o s t a s i sp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fg e n e st h a te n c o d ed i f f e r e n ta q u a p o r i n i s o f o r m sd u r i n gp l a n td e v e l o p m e n th a ss h o w nt ob e a s s o c i a t e dw i t hv a r i o u s p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s h a b i t u a t i o ni sg e n e r a l l yd e f m e da sas t a b l eh e r i t a b l e l o s si nt h er e q u i r e m e n to f c u l t u r e dp l a n tc e l l sf o ro n eo rm o r ee x t e r n a l l ys u p p l i e d g r o w t hr e g u l a t o r s t h ep h y s i o l o g i c a lb a s i so fh a b i t u a t i o ni s s t i l lu n k n o w n i n t h i ss t u d y , w ec l o n e dat o n o p l a s ta q u a p o r i ng e n ep 酊l p l ，w h e ne x p l o r i n gt h e m e c h a n i s mo fh a b i t u a t i o ni np a n a xg i n s e n g ，w h i c h s t r o n gd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e di nh a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l s f u r t h e rf u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f p 酊i p lw a sa l s oc o n d u c t e d h a b i t u a t i o ni sc o n s i d e r e da ni nv i t r oe p i g e n e t i es w i t c ht oa u t o t r o p h yf o r e x t e r n a l l ys u p p l i e dp l a n th o r m o n e s i th a sb e e nr e p o r t e di nc a r r o t ，t o b a c c o ， p o t a t o ，s u g a rb e e t ，a n ds o y b e a nc u l t u r e s w ee s t a b l i s h e dah a b i t u a t e dg i n s e n g e e l ll i n eb ys c r e e n i n gt h ea u x i na n dc y t o k i n i nd e p e n d e n tg i n s e n gc e l l s ，w h i c h c a ng r o wi nv i t r oo nh o r m o n e f r e em e d i u mw i t ht h es i m i l a rg r o w t hs p e e d c o m p a r e dw i t h t h a to ft h eh o r m o n ed e p e n d e n tc e l l s t h em o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e rs u c ha st h ec e l ls h a p ea n ds i z eo f t h e s eh a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l si sa l s o s i m i l a rt ot h a to fn o n h a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l s t h et o t a ls a p o n i nc o n t e n to ft h e h a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l sw a sh i g h e rt h a nt h en o n - h a b i t u a t e dc e l l s n 圮 e x p r e s s i o nl e v e l so fg e n e se n c o d i n gs q u a l e n es y n t h a s e 偶q s ) a n ds q u a l e n e e p o x i d a s e ( s q e ) ，k e ye n z y m e so fs a p o n i nb i o s y n t h e s i s ，w e r ea l s oh i g h e ri nt h e h a b i t u a t c dg i n s e n gc e l l sc o m p a r e dw i t ht h en o n - h a b i t u a t e dc e l l s o u rr e s u l t s i n d i c a t et h a tt h eh a b i t u a t e dg i n s e n gc e l ll i n eh a sag r e a t e rc a p a c i t yf o rs a p o n i n p r o d u c t i o nc o m p a r e dw i t ht h a to ft h en o n - h a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l s s i n c et h e r e a r es i d ee f f e c t so fe x o g e n o u sg r o w t hr e g u l a t o r s ，h a b i t u a t i o ni np a n a xg i n s e n gi s o fs p e c i a ls i g n i f i c a n c e i no r d e rt oe x p l o r et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f a u t o n o m o u sg r o w t h ，w e s c r e e n e dt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s sg e n e si nh o r m o n ea u t o t r o p h i cg i n s e n gc e l ll i n e u s i n gs s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) m e t h o da n dc l o n e da n a q u a p o r i ng e n e ( p g t i p l ) s p e c i a l l ye x p r e s s e di nh o r m o n ea u t o t r o p h i cc e l l s u s i n gr e a l - t i m er e v e r s et r a n s c r i p t ( r t ) - p c rm e t h o d ，t h ee x p r e s s i o no fp g t i pl u n d e rd i f i e r e n th o r m o n et r e a t m e n tw a ss t u d i e di ns u s p e n s i o nc u l t u r e dh o r m o n e a u t o t r o p h i cg i n s e n gc e l l s i tw a sf o u n dt h a tt h et r a n s c r i p t sl e v e lo fp z t i plw a s u p r e g u l a t e dm a r k e d l yb yk t ( o 2 5m gl - 1 ) t r e a t m e n t ，d o w n - r e g u l a t e db y1 5 m g1 2 , 4 一da n da l s oi n h i b i t e db yt r e a t e dw i t hb o t ho f t h e ma tt h es a m et i m e p r e v i o u ss t u d i e sp r o v i d el i t t l ei n f o r m a t i o na b o u tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np l a n t a q u a p o f i n sa n da u x i n c y t o k i n i n a n dn or e s e a r c hw a sr e p o s e do na q u a p o r i na n d t h ep h e n o m e n o no f a u t o n o m o u sg r o w t h f o rf u r t h e rc o n f i r m a t i o no f t h i sn e w a q u a p o r i ng e n ei np a n o xg i n s e n g , w ed i d t h eb i o i n f o r m a f i c sa n di nv i t r o f u n c t i o na n a l y s i s s e q u e n c ea l i g n m e n ta n dp r e d i c t e ds t r u c t u r eo f p g t i p l s h o w e di t sd i s t i n c tc h a r a c t e r i s t i co f p l a n ta q u a p o r i na n di t sw a t e rc h a n n e l a c t i v i t yw a sd e m o n s t r a t e db yh e t e r o e x p r e s s e di nx e n o p u so o c y t e ss y s t e m t h e g f p t a g g e dp g t i p ld e c o r a t e dt h et o n o p l a s tm e m b r a n e w h i c hs h o w e di t s s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n s i n c et h es p e c i f i ce x p r e s s i o no fp g t l pli nh o r m o n e a u t o t r o p h i cg i n s e n gc e l l si n d i c a t e di t sp o t e n t i a li n v o i v e m e n ti nc e l ld i v i s i o na n d g r o w t h ，o v e r e x p r e s s i o no fp 窖n pn na r a b i d o p s i sw a sc o n d u c t e dt oe x p l o r ei t s p o s s i b l ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee a r l yg r o w t ha n d d e v e l o p m e n ts p e e do f p g t i p lo v e r e x p r e s s e da r a b i d o p s i sw a sf a s t e rt h a nt h a t o f t h ew i l dt y p ep l a n t s ，w h i c hw a se x h i b i t e db yt h el o n g e rr o o t s ，b i g g e rl e a f c e l l s a n de a r l i e rf l o w e r i n gt i m e m o r e o v e r , b o t ht h es e e ds i z ea n dt h es e e dm a s so f a r a b i d o p s i sp l a n t so v e r - e x p r e s s i n gp 西l p lw e r eg r e a t l ye n h a n c e dc o m p a r e d w i t h 廿l o s eo f t h ew i l dt y p e t h es e e d sf r o mt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sp l a n t sh a d 1 8 5 - f o l d h i g h e r f a t t y a c i dc o n t e n t t h a n t h a t o f t h e w i l d t y p ec o n t r 0 1 t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a tp g t i p lm i g h th a v ear o l ei ns u b s t a n c es t o r a g ea n d s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ，i na d d i t i o nt op r o m o t i n ge e l le x p a n s i o n e l o n g a t i o n k e yw o r d s ：p l a n th o r m o n e ；a q u a p o r i n ；p a n a xg i n s e n g ；a r a b i d o p s i s 人參液泡膜水孔蛋白基因以丁即1 的克隆和功能研究 文獻(xiàn)綜述 前言 植物水孔蛋白及其生理功能 在很長時間里，人們頭腦中有一個根深蒂固的觀念，那就是水分是以 自由擴(kuò)散的方式穿越細(xì)胞膜而進(jìn)出細(xì)胞的。但是，人們也注意到動植物的 一些器官、組織具有獨(dú)特的水分運(yùn)轉(zhuǎn)能力( d a i n t y ，1 9 6 3 ) ，例如：動物的 紅細(xì)胞和。腎上皮細(xì)胞，它們運(yùn)輸水分的速度遠(yuǎn)非只憑自由擴(kuò)散所能解釋的， 人的腎臟細(xì)胞平均每晝夜要過濾1 8 0 升的水，植物在種子萌發(fā)及花粉管伸 長時要伴隨著由體積增大而發(fā)生的水分快速吸收，這些現(xiàn)象均使人們猜測 是否存在專門的水分運(yùn)輸孔道( d a i n t y ，1 9 6 3 ；d a i n t y 和g i n z b u r g ，1 9 6 4 ； s t e u d l e 和t y e r m a n ，1 9 8 3 ) 。2 0 世紀(jì)9 0 年代初，w a y n e 等推測在植物的質(zhì) 膜上存在著水分運(yùn)輸通道( w a y n e 和t a z a w a ，1 9 9 0 ) 。1 9 9 2 年p r e s t o n 等第 一次分離出具有水分運(yùn)輸特性的蛋白c h i p 2 8 ( c h a n n e lf o r m i n g p r o t e i no f 2 8k d ) ，它是紅細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)在蛋白，在質(zhì)膜上形成水分選擇性運(yùn)輸通道( h o e k 和y e r k m a n ，1 9 9 2 ；p r e s t o n 等，1 9 9 2 ) ，1 9 9 7 年被基因組命名委員會重命 名為a q p l 。a q p l 的發(fā)現(xiàn)，掀起了人們分離、鑒定水孔蛋白( 亦稱水通道蛋 白) 的高潮。短短幾年內(nèi)，人們已在細(xì)菌、酵母、動物、植物中分離出許 多水孔蛋白同源基因。在植物中第一個水孔蛋白y t i p 是由m a u r e l 等于 1 9 9 3 年從擬南芥中分離出來的。y t i p 的c r n a 在爪蟾卵母細(xì)胞( x e n o p u s o o c y t e s ) 中的異源表達(dá)，證明它具有水分運(yùn)輸特性，屬于植物水孔蛋白中 的液胞膜內(nèi)在蛋白( t o n o p l a s tm e m b r a n ei n t r i n s i ep r o t e i n ，t i p ) 。植 物質(zhì)膜內(nèi)在蛋白( p 1 a s m am e m b r a n ei n t r i n s i cp r o t e i n ，p i p ) 也是在擬 南芥中首次發(fā)現(xiàn)的。k a m m e r l o h e r 等( 1 9 9 4 ) 用擬南芥根質(zhì)膜內(nèi)在總蛋白產(chǎn) 生的多克隆抗血清來免疫篩選擬南芥根的e d n a 文庫，得到了幾個陽性克隆， 經(jīng)鑒定為植物質(zhì)膜水孔蛋白。 水孔蛋白與g o r i n 等( 1 9 8 4 ) 從牛晶體纖維細(xì)胞膜中分離到的m i p ( m a j o r i n t r i n s i cp r o t e i n ) 基因具有很高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性，因此將它 們同歸于m i p 家族，分子質(zhì)量在2 6 3 4k d 之間，在生物膜中形成水通道并 協(xié)助水分跨膜運(yùn)輸?shù)哪?nèi)在蛋白。絕大多數(shù)水孔蛋白形成水的選擇性通道， 但也有一些水孔蛋白同時也可運(yùn)輸小分子中性親水溶質(zhì)。與動物相比，植 物具有龐大的水孔蛋白家族，在已經(jīng)研究的擬南芥中有3 5 個成員，玉米中 有3 1 個成員，水稻中有3 3 個成員，其編碼基因的核苷酸長度一般為7 0 0 9 0 0 b p ，大約2 5 0 3 0 0 個氨基酸，而且在核酸和蛋白質(zhì)水平上，同源性都非常 高，如擬南芥的p i p 2 ：2 和p i p 2 ：3 的同源性達(dá)到驚人的9 6 8 ( j a v o t 等， 2 0 0 3 ) 。正如水分參與的生理活動是極其廣泛的一樣，水孔蛋白參與的生理 活動也是極其廣泛的。許多研究表明，植物水孔蛋白的表達(dá)具有嚴(yán)格的時 人參液泡膜水孔蛋白基因如r ”j 的克隆和功能研究文獻(xiàn)綜述 空特異性，并在轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾等水平上受到精密的調(diào)控。本 文參考近年來有關(guān)水孔蛋白研究的文獻(xiàn)，對水孔蛋白的基礎(chǔ)研究及其在植 物生理活動中的作用做一概述。 1 水孔蛋白的基本特征 1 1 結(jié)構(gòu)特征和透水機(jī)制 水孔蛋白( a q u a p o r i n ，a q p ) 屬于主要膜內(nèi)在蛋白( m a j o ri n t r i n s i c p r o t e i n ，m i p ) 家族，由2 5 0 3 0 0 個氨基酸殘基組成，分子量在2 6 - 3 4k d a 之間( p a r k 和s a i e r ，1 9 9 6 ：s c h a f f n e r ，1 9 9 8 ；b a i g e s 等，2 0 0 2 ；t y e r m a n 等，2 0 0 2 ) ，一級結(jié)構(gòu)高度保守。由一級序列可知a q p 蛋白多肽由兩個對 稱的部分組成( r e i z e r 等，1 9 9 3 ) ，以四聚體的形式存在于膜上，但每一 個單體就是一個獨(dú)立的功能單位。如圖1 所示，a q p 蛋白共有6 個跨膜a 螺旋( h 1 一h 6 ) ，在跨膜螺旋之間形成5 個環(huán)( a - e ) ，n 端和c 端都在膜 內(nèi)側(cè)。其中在b 環(huán)和e 環(huán)各有一個非常保守的n p a ( 天冬酰胺一脯氨酸一丙氨 酸，a s n p r o a l a ) 區(qū)域。在該區(qū)域產(chǎn)生突變后，a q p l 的水通道功能就喪失 了( p r e s t o n 等，1 9 9 4 ) 。n p a 結(jié)構(gòu)域非常保守，與水通道的形成直接相關(guān)， 可視為a q p 的標(biāo)志性序列。 圖l 水孔蛋白 的二級結(jié)構(gòu)。 ( b u c h a n a n 等， 2 0 0 0 ) 水通道的三維結(jié)構(gòu)看起來像什么? 與動物水通道蛋白的生化和結(jié)構(gòu)分 柝結(jié)合起來的建模研究給出了預(yù)測( 圖2 ) 。a q p 以四聚體的形式存在，在 每一個亞基內(nèi)都會形成一個微孔，兩個n p a 區(qū)域折疊進(jìn)入膜內(nèi)形成了狹窄 的“漏斗形”水通道( j u n g 等，1 9 9 4 ) 。在植物中，最近人們也得到了精 度為5a 的菠菜水孔蛋白s o p i p 2 ：1 ( k u k u l s k i 等2 0 0 5 ) 的三維結(jié)構(gòu)。 人參液泡膜水孔蛋白基因甩z 口，的克隆和功能研究 文獻(xiàn)綜述 圖2 人紅細(xì)胞中的 a q p l 的三維結(jié)構(gòu)。 從胞外可以看見8 個 不對稱亞基，這8 個 亞基形成2 個四聚 體。( b u e h a n a l 等， 2 0 0 0 ) 除了保守的n p a 區(qū)域外，在緊鄰n p a 區(qū)域靠近膜外側(cè)，a q p 還具有一個 相對保守的被稱之為a r r ( a r o m a t i c a r g ) 的結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域由第二個 螺旋( h 2 ) 、第五個螺旋( h 5 ) 和e 環(huán)上4 個( 個別為5 個) 在空間上相 鄰的氨基酸殘基構(gòu)成( 圖3 ) 。a r r 區(qū)域是在水通道中除n p a 區(qū)域之外另 一個孔徑較窄的位點，其孔徑的大小，對a o p 的選擇性和水分的通透性具 有很重要的意義( w a l l a c e 和r o b e r t s ，2 0 0 4 ) 。例如，人類水孔蛋白a q p i 和大腸桿菌甘油通道蛋白g i p f 都屬于m i p 家族，它們的結(jié)構(gòu)相似，但前者 只能通過水分，后者只能通過甘油。a q p i 的a r r 區(qū)域由p h e 一5 8 ( 螺旋2 ) 、 h i s 一1 8 2 ( 螺旋5 ) 、c y s 一1 9 1 ( e 環(huán)) 、h r g 一1 9 7 ( e 環(huán)) 組成，形成孔徑為 2 8a 的狹小的位點，僅比水分子直徑( 2 4a ) 略大，排除了其他較大分 子進(jìn)入通道的可能性；而g i p f 的a r r 區(qū)域由t r p 一4 8 ( 螺旋2 ) 、g l y 一1 9 1 ( 螺旋5 ) 、p h e 一2 0 0 ( e 環(huán)) 、a r g 一2 0 6 ( e 環(huán)) 組成，形成孔徑為3 6a 的較寬的位點，便于較大分子的甘油的通過。 圖3 水孔蛋白 a r r 結(jié)構(gòu)域示 意圖( a r r 結(jié) 構(gòu)域緊鄰n p a 靠近膜外一 側(cè)) 。( w a l l a c e 和r o b e r t s 2 0 0 4 ) 將人的a q p l 蛋白提純，測定嵌入a q p i 的脂質(zhì)體的水分滲透系數(shù)p f ， 推算出每a q p l 分子每秒鐘可通透1 1 4 1 0 1 4c m 3 的水分子( z e i d e l 等， 1 9 9 2 ) 。正如j u n g 等( 1 9 9 4 ) 的“漏斗”模型所推測的。b 環(huán)和e 環(huán)通過 n p a 區(qū)域的相互作用形成了水通道的部分表面結(jié)構(gòu)，螺旋2 和螺旋5 以及螺 人參液泡膜水孔蛋白基因戶窖t i p i 的克隆和功能研究 文獻(xiàn)綜述 旋1 和4 的c 端部分則形成了水通道另外的表面部分( m u r a t a 等，2 0 0 0 ) 。 水分通過a q p l 的活化能e a 值為1 3k jm o l ，與氫鍵斷裂的最大能量1 2 6k j m o l l 相近，這預(yù)示著水分通過水通道的過程中可能存在著氫鍵的斷裂與再 形成。根據(jù)m u r a t a 等( 2 0 0 0 ) 所報道的a q p l 晶體結(jié)構(gòu)，p h e 2 4 、i l e 6 0 、 l e u l 4 9 和v a l l 7 6 分布在通道內(nèi)表面，形成一個疏水環(huán)境，b 環(huán)和e 環(huán)的n p a 區(qū)域的a s n 7 6 和a s n l 9 2 存在于通道最狹窄的部位，且面向通道內(nèi)側(cè)而形成 一個正電區(qū)域。水分子中的氧原子由于電負(fù)性而面向帶正電的n p a 區(qū)域， 斷裂自身氫鍵，并先后與a s n l 9 2 和a s n 7 6 形成兩個氫鍵，這時水分子的氧 原子與通道軸線垂直，又由于這是一個疏水環(huán)境，故這個氧原子不能和其 他基團(tuán)形成氫鍵。當(dāng)后一個水分子靠近這個區(qū)域時，同樣先與a s n l 9 2 形成 氫鍵，a s n l 9 2 就將與前一個水分子的氧原子形成的氫鍵釋放，這樣水分子 就一個一個通過了水通道中部的狹窄區(qū)域( 圖4 ) 。 圖4 水分子通過水通道蛋 白a q p l 的機(jī)制。水分子 在一側(cè)親水一側(cè)疏水的環(huán) 境里一個一個通過水通道 ( a ) ；水分子與a s n 7 6 和 a s n l 9 2 形成氫鍵及其釋放 ( b 、c ) 。( m u r a r a 等， 2 0 0 0 ) 1 2 分類與分布 a q p 是一個大家族，根據(jù)其多肽序列( 特別是c 端和n 端的長度) 和分布 情況，植物a q p 可以分為四類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白( p l a s m a m e m b r a n ei n t r i n s i c p r o t e i n ，p i p ) 、液泡膜內(nèi)在蛋白( t o n o p l a s ti n t r i n s i cp r o t e i n ，t i p ) 、 與大豆n o d 2 6 同源的內(nèi)在蛋白( n o d 2 6 一l i k em i p ，n i p ) 和堿性小內(nèi)在蛋白 ( s m a l la n db a s i ci n t r i n s i cp r o t e i n s ，s i p ) 。其中p i p 分布在質(zhì)膜上， 根據(jù)c 端和n 端的特征，又可分為p i p l 和p i p 2 ，p i p 2 比p i p l 具有較長的c 末端 和較短的n 末端，p i p 2 的通透水分的能力一般高于p i p l 。t i p 多肽長度短于 p i p 和n i p ，具有很高的通透水分的能力( s c h a f f n e r 等，1 9 9 8 ) 。n i p 主要 分布在豆科的根瘤中，其序列特點與p i p 和t i p 有較大的不同( r e i z e r 等， 人參液泡膜水孔蛋白基因p g t i p l 的克隆和功能研究文獻(xiàn)綜述 1 9 9 3 ) ，且其在擬南芥和玉米中的膜定位至今未知。c h a u m o n t 等( 2 0 0 1 ) 研究玉米m i p 的結(jié)構(gòu)與分類時發(fā)現(xiàn)了一類新的a q p ，即s i p ，它的多肽長度短 于p i p ，與t i p 相當(dāng)，s i p 的n 端尤其短，且等電點較高，具有更多的堿性氨 基酸，人們推測s i p 可能表現(xiàn)與其它a q p 不同的通道選擇性( m u r a t a 等，2 0 0 0 ； f u 等，2 0 0 0 ) 。 對植物a q p 的種類研究得比較詳盡的是擬南芥、玉米和水稻。在擬南芥 中發(fā)現(xiàn)了3 8 個同源基因，其中有3 個是假基因，在另外的3 5 個基因中分 別有1 3 、1 0 、9 和3 個p i p 、t i p 、n i p 和s i p ( w e i g 等，1 9 9 7 ：q u i g l e y 等，2 0 0 1 ) 。通過對玉米的3 1 個水孔蛋白的a d n a 序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中 有1 3 個為p i p ，有1 1 個為t i p ，有4 個為n i p ，還有3 個為s i p ( c h a u m o n t 等，2 0 0 1 ) 。最近，s a k u r a i ( 2 0 0 5 ) 等通過檢索水稻基因組測序數(shù)據(jù)庫發(fā) 現(xiàn)在水稻中存在3 3 個a q p ，其中1 1 個p i p ，1 0 個t i p ，i 0 個n i p ，和2 個 s i p 。此外，在蘿h 中也發(fā)現(xiàn)了8 個m i p ，其中有3 個p i p l ，3 個p i p 2 和2 個t i p ( s u g a 等，2 0 0 1 ；s u g a 等，2 0 0 2 ) 。目前人們在哺乳動物中僅發(fā)現(xiàn) 1 1 種水孔蛋白( m a t s u z a k i 等，2 0 0 2 ) ，而植物存在如此種類繁多的水孔 蛋白家族成員意義何在是一個值得思考的問題。 許多水孔蛋白在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的實驗結(jié)果表明t i p 、p i p 2 具有較 強(qiáng)的通透水的能力，而p i p l 往往只有很低的水孔蛋白活性，甚至根本沒有 透水能力( d a n i e l s 等，1 9 9 4 ；k a m m e r l o h e r 等，1 9 9 4 ；y a m a d a 等，1 9 9 5 ； w e i g 等，1 9 9 7 ；b i e l a 等，1 9 9 9 ；d i x i t 等，2 0 0 1 ；m o s h e l i o n 等，2 0 0 2 ) 。 后來又有研究發(fā)現(xiàn)，玉米水孔蛋白z m p i p l ：2 和z m p i p 2 的m r n a 共同注射于 卵母細(xì)胞中，水分滲透系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于z m p i p i ：2 或z m p i p 2 單獨(dú)注射，且水 分滲透系數(shù)的增加依賴于z m p i p i ：2 的m r n a 的注射量。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)， z m p l p 2 能增加z m p i p i ：2 - g f p ( 綠色熒光蛋白) 在爪蟾卵母細(xì)胞膜上的熒光 強(qiáng)度，反之，z m p i p i ：2 卻不能促進(jìn)z m p i p 2 一g f p 在爪蟾卵母細(xì)胞膜上的熒光 強(qiáng)度( f e t t e r 等，2 0 0 4 ) 。因此，z m p i p 2 可能具有穩(wěn)定或促進(jìn)z m p i p i ：2 透水能力的功能，體內(nèi)p i p l 和p i p 2 可能是以一種非常精密的方式協(xié)同作 用的。 根據(jù)對通透物質(zhì)的選擇性，水孔蛋白可分為“正統(tǒng)”水孔蛋白( o r t h o d o x a q u a p o r i n s ，b o r g n i a 等，1 9 9 9 ) 和多功能水孔蛋白?！罢y(tǒng)”水孔蛋白指 僅能單純通過水分子而不能通過其他小分子的水孔蛋白，上述討論的很多 水孔蛋白都屬于這一類，例如擬南芥的一t i p ( m a u r e l 等，1 9 9 5 ) 和y t i p ( m a u r e l 等，1 9 9 3 ) 。另有一些水孔蛋白不僅能通過水分子，還能通過甘 油、氨、尿素、c o 。、硼酸或過氧化氫等小分子( t y e r m a n 等，2 0 0 2 ) 。最早 發(fā)現(xiàn)的這一類蛋白是大腸桿菌的g i p f ( m a u r e l 等，1 9 9 4 ) ，當(dāng)時認(rèn)為g l p f 僅能通過甘油，稱之為水甘油通道蛋白( a q u a 9 1 y c e r o p o r i n ) ，后來發(fā)現(xiàn) g i p f 也能通過水分子( b o r g n i a 和a g r e ，2 0 0 1 ) 。大豆的n o d 2 6 也屬于這一 類多功能水孔蛋白，除了水分子外，它還能通過甘油和甲酰胺( r i v e r s 等， 6 人參液泡膜水孔蛋白基因t g t i p l 的克隆和功能研究 文獻(xiàn)綜述 1 9 9 7 ) 。 水孔蛋白廣泛地分布于各種植物中( s c h a f f n e r ，1 9 9 8 ) 。在器官水平 上，一些a q p 可在多個器官中表達(dá)；另有一些a q p 則具有表達(dá)的特異性， 例如t i p ( j o h n s o n 等，1 9 8 9 ；t a k a h a s h i ，2 0 0 4 ) 、t o b r b 7 ( y a m a m o t o 等， 1 9 9 1 ) 和l i m p 2 ( g u e n t h e r 和r o b e r t s ，2 0 0 0 ) 分別是在擬南芥種子、煙草 根和百脈根根瘤中特異性表達(dá)的。在組織水平上，有一系列的報道認(rèn)為水 孔蛋白在根或葉的維管組織及其附近區(qū)域有表達(dá)( s c h a f f n e r ，1 9 9 8 ) ，這 可能有利于水分通過維管束。在細(xì)胞水平上，植物水孔蛋白主要分布在質(zhì) 膜和液泡膜上。另外，豆科植物根瘤中的一些水孔蛋白分布在類菌體周膜 ( p e r i b a c t e r o i dm e m b r a n e ) 上，這些水孔蛋白與大豆的n o d 2 6 ( r i v e r s 等，1 9 9 7 ) 有高度同源性，被稱為n i p ，不過現(xiàn)在也有不少n o d 2 6 的同源物 在非豆科植物( 如擬南芥) 中被發(fā)現(xiàn)( b a i g e s 等，2 0 0 2 ) 。 水孔蛋白在植物中的含量也是相當(dāng)高的。例如，蘿h 的t i p 占總液泡膜 蛋白的4 0 ( h i g u c h i 等，1 9 9 8 ) ；菠菜的s o 一6t i p 占總液泡膜蛋白的1 0 1 5 ( k a r l s s o n 等，2 0 0 0 ) ；蘿h 的p i p 也占總質(zhì)膜蛋白的1 0 ( m a e s h i m a ，2 0 0 1 ) ； 擬南芥的五種p i p l 至少占總質(zhì)膜蛋白的1 ( r o b i n s o n 等，1 9 9 6 ) ；擬南芥 p i p 2 貝u 占總質(zhì)膜蛋白的1 5 ( j o h a n s s o n 等，1 9 9 6 ) 。水孔蛋白在植物中有 如此高的含量和廣泛的分布暗示著它們在植物生命活動中具有極其重要的 作用。 2 水孔蛋白的活性調(diào)控 水孔蛋白在生物膜上的存在，不僅使水分跨膜運(yùn)輸成為可能，而其更 大的生物學(xué)意義在于它能使植物快速靈敏地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間的水分流 動，有些水孔蛋白是組成型表達(dá)的，而多數(shù)水孔蛋白是受環(huán)境因子，如干 旱、鹽、激素、光等誘導(dǎo)表達(dá)的，這些就涉及到水孔蛋白的表達(dá)調(diào)控。調(diào) 控機(jī)制大致可以分為三類：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控和翻譯后修 飾。在轉(zhuǎn)錄水平上主要通過控制水孔蛋白的合成速度實現(xiàn)，而最近幾年的 研究熱點集中在翻譯后修飾，包括“門控”和亞細(xì)胞區(qū)域化( 轉(zhuǎn)運(yùn)與膜定 位) 。 2 1 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 2 1 1 發(fā)育階段調(diào)控 植物體的許多水孔蛋白的表達(dá)是受發(fā)育階段嚴(yán)格調(diào)控的。例如擬南芥 a - - t i p ，存在于種子貯存液泡膜上，它在種子成熟后期積累，在種子萌發(fā) 后逐漸消失，而y - - t i p 是在a - - t i p 消失的過程中出現(xiàn)的液胞膜內(nèi)在蛋白， 主要存在于幼嫩組織的伸長區(qū)或分化的細(xì)胞中。油菜b n p i p i 則在種子萌發(fā) 人參液泡膜水孔蛋白基因尸g t i p i 的克隆和功能研究 文獻(xiàn)綜述 時期表達(dá)。水孔蛋白的這種時空特異性表達(dá)主要是由其啟動子調(diào)控元件決 定的，包括c a m p 反應(yīng)元件( c r e 元件) 以及c c a a t b o x ( h o z a w a 等，1 9 9 6 ： m a t s u m u r a 等，1 9 9 7 ) 。 2 1 2 環(huán)境因子的誘導(dǎo)表達(dá) ( 1 ) 對干旱的響應(yīng) 已有大量文獻(xiàn)報道了a q p 對于干旱在轉(zhuǎn)錄水平上的響應(yīng)，既包括干旱 誘導(dǎo)a q p 的表達(dá)，也包括干旱抑制a q p 的表達(dá)。例如，水稻的r t i p l ( l i u 等，1 9 9 4 ) 、煙草的n e m i p 2 和n e m i p 3 ( y a m a d a 等，1 9 9 7 ) 都在干旱脅迫后增 加表達(dá)，而擬南芥的，一p 、d t i p 和r d 2 8 卻在甘露醇脅迫下表達(dá)量下 降( w e i g 等，1 9 9 7 ) 。擬南芥中1 3 個p i p 都對干旱產(chǎn)生響應(yīng)( j a n g 等，2 0 0 4 ) ， 有的表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)，有的表達(dá)則強(qiáng)烈下調(diào)。a b a 是干旱的信號傳遞分子，某 些對干旱響應(yīng)的a q p 同時也對a b a 響應(yīng)，如水稻的用h a 、弧p ，船日( m a l z 和s a u t e r ，1 9 9 9 ) 和，儼( l i u 等，1 9 9 4 ) 、冰葉日中花的 - p i p a 2 ( m a r i a u x 等，1 9 9 8 ) 等，而也有一些對干旱響應(yīng)的a q p 并不對a b a 響應(yīng)，例如冰葉 日中花的。一p ，忍躍m