（食品科學(xué)專業(yè)論文）微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵法生產(chǎn)天然香料β苯乙醇的研究.pdf

中英文摘要 摘要 本論文以酵母細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化生成的天然香料b 一苯乙醇為研究對(duì)象，主要研 究?jī)?nèi)容包括：轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸生成b 一苯乙醇酵母菌株的篩選；發(fā)酵液中底物和 產(chǎn)物的定量檢測(cè)方法；搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化，包括培養(yǎng)基組成的優(yōu)化及培養(yǎng)工藝 的優(yōu)化：樹(shù)脂的篩選及發(fā)酵液中b 一苯乙醇的分離純化：0 一苯乙醇的結(jié)構(gòu)鑒定。 從實(shí)驗(yàn)室保藏的4 l 株酵母菌種中篩選出一株酵母：腳“w e m m y c p sm a 聊f 0 塒 4 s 2 4 卯，能夠?qū)? o g l 的l 一苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為o 9 2 0 9 l 的b 一苯乙醇。根據(jù)l 一 苯丙氨酸和d 一苯乙醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，建立了測(cè)定發(fā)酵液中底物和產(chǎn)物的方法： 薄層層析法、碘蒸汽熏蒸半定量測(cè)定b 苯乙醇：水合茚三酮測(cè)定底物l 一苯丙氨 酸；高效液相色譜同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中的底物和產(chǎn)物，該法處理簡(jiǎn)單、快速、定量 準(zhǔn)確、回收率高、重復(fù)性好，可有效的用于b 一苯乙醇產(chǎn)生菌的菌種選育和發(fā)酵 工藝研究中。 為了提高產(chǎn)物濃度，對(duì)培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了優(yōu)化了的培 養(yǎng)條件：蔗糖3 5 9 厄、l 一苯丙氨酸6 9 l ，磷酸二氫鉀0 4 9 ，l ，u b i 8 9 l ；種子培 養(yǎng)基培養(yǎng)2 4 h ，接種量6 ，優(yōu)化培養(yǎng)基初始p h = 5 5 ，裝液量5 0 m l 2 5 0 m l ，溫 度2 8 ，轉(zhuǎn)速2 2 0 r m i n 。在此條件下發(fā)酵4 8 h 后發(fā)酵液中b 一苯乙醇含量可以達(dá) 到1 4 0 9 7 l ，比優(yōu)化前( o 9 2 0 l ) 提高了5 3 2 3 。 通過(guò)對(duì)1 3 種大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附特性的研究，確定了h 1 0 3 樹(shù)脂是一種 理想的b 一苯乙醇的吸附劑，該吸附樹(shù)脂對(duì)b 一苯乙醇不僅吸附量大，而且解吸率 高，適合發(fā)酵液這種復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化體系中b 一苯乙醇的分離富集。通過(guò)對(duì)h 1 0 3 樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附特性研究，確定了h 1 0 3 樹(shù)脂分離富集發(fā)酵液中b 一苯乙醇的工藝 參數(shù)：上樣濃度1 3 l 左右，上樣液p h = 5 4 8 ，上樣速度3 b v h ；用6 倍樹(shù)脂柱 床體積的9 5 乙醇以2 b v 1 1 流速進(jìn)行洗脫，可基本上將發(fā)酵液中b 一苯乙醇完全 洗脫下來(lái)，并且洗脫峰集中、基本對(duì)稱，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，b 一苯乙醇的回收率 約為8 7 6 3 。 大孔吸附樹(shù)脂醇洗液經(jīng)濃縮純化后，經(jīng)g c m s 分析，測(cè)定制得的b 一苯乙醇 純度為9 3 2 0 ；對(duì)產(chǎn)品峰質(zhì)譜圖進(jìn)行n i s t 譜庫(kù)檢索，其質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)b 一 苯乙醇的匹配度達(dá)到9 4 ，可確定其為b 一苯乙醇。 關(guān)鍵詞：克魯維酵母，微生物轉(zhuǎn)化，l 一苯丙氨酸，b 苯乙醇，樹(shù)脂 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t 昂一p h e n y l e t h a n o l ( b p e ) i sah i g h e ra r o m a t i ca l c o h o lw i t 量lar o s e l i k eo d o u rt h e f r a g r a n c eo ft h er o s ei sh i g h l yp o p u l a ra n dd e s i r e d ，m a k i n gb p et h em o s t u s e d f r a g r a n c ec h e m i c a li np e r f u m ea n dc o s m e t i c s i ti sa l s ou s e di nf l a v o rc o m p o s i t i o n s f o rf o o d m o s to ft h ew o r l d s鋤u a lp m d u c t i o no fs e v e r a lt h o u s a n dt o n si s s y m h e s i z e db yc h e m i c a lm e a i l sb u t ，d u et oi n c r e a s i n gd e m a j l df o rn a t u r a lf l a v o r s ， a l t e m a t i v ep m d u c t i o nm e t h o d sa r eb e i n gs o u g h t h a m e s s i n gt h ee h r l i c hp a m w a yo f y e a s t sb yb i o c o n v e r s i o no f l - p h e n y l a l a n i n et ob p ec o u l d b e a i lg o o do p t i o n i nt h i sw o r k ，s y s t e m a t i cs t u d i e sw e r ec a r r i e do u to nt h es c r e e n i n go fy e a s ts t r a i n s w h i c hc a nt r a n s f o r n ll p h e n y i a i a j l i n et o b p e ；d e t e h n i n a t i o n ，i s o l a t i o n p 岫f i c a t i o n ， i d e n t i f l c a t i o n ，q u a n t i 丘c a t i o nm e t h o do fb p e m y v e ，d 叼，c 已j m 口膩脅淞4 s2 彳4 dw a ss c r e e n e df r o mt h em i c r o o r g a n i s m s t r a i n sp r e s e r v e db yo u rl a b o r a t o r y t h i ss t r a i nc a l lt r a i l s f o 玎n7 o ll - p h e n y l a l a n i n e t o0 9 2 0 9 l b p e a c c o r d i n gt om ec h e m i c a ls t m c t u r e so fl p h e n y l a l a l l i n ea n db p h e n y l e m a f l o l ，w ee s t a b l i s h e ds o m em e t l l o d sf o rt h es e p a r a t i o na i l dd e t e r m i n a t i o no f m e m ：t l cm e t h o df o rt h ed e t e 皿i n “o no fb p e ；n i r 山y(tǒng) d r i nr e a c t i o nm e t h o df o rt h e d e t e 珊i n a t i o no f l p h e n y i a l a n i n e ；r p h p l c m e t l l o df o r t h e s e p a r a t i o n a n d d e t e 咖i n a t i o no fl p h e n y l a l a i l i n ea 1 1 db p h e n y l e t l l a l l o l ，m i sm e t h o dw a sa c c u r a t e ， s e n s i t i v ea i l dr e l i a b l e t h ec o n d i t i o n so fl i q u i df e h n e n t a t i o no fb p ew e r es t u d i e di ts h o w e dt h a tt h e e a e c to fs i n 9 1 ef a c t o r s ，s u c ha sc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，g m w 山f a c t o r sa n d i n o 培a n i cs a l t so nt h ep r o d u c t i o no fb p e t 1 1 r o u 曲o r 山o g o n a lt e s t ，t l eo p t i m u m m e d i u mc o m p o s i t i o nh a db e e no b t a i n e d i tw a s3 5 9 ，ls u c r o s e ，6 ll p h e n y l a l a n i n e ， 04 9 lk h 2 p 0 4a n d1 8 9 ly n b n l eo p t i m 哪s h a k i n gc u l t u r ec o n d i t i o nw a sa s f o l l o w s ：2 4h o u r ss 訂a i na g e ，6 i n o c u l a i i o nq u a l l t i 吼i n i t i a im e d i u mp h = 54 8 ，5 0m l m e d i u mi n2 5 0 m ls h a k i n gn a s k ，2 8 ，2 2 0 “m i ns h a k i n gs p e e d ，4 8h o u r si n c u b a t i o n u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，p r o d u c t i v “yo fb p ew a s1 4 0 9 7 9 ，l ，w h i l ew i t ht h ei n i t i “ m e d i u mc o m p o s i t i o n ，m er e s u l tw a s 0 9 2 0 9 l f o ri s o l a t i o no fb p e ，血ea d s o r p t i o na 1 1 dd e s o r p t i o np e r f o 咖a 【l c eo f13t y p e so f m a c r o p o r o u sa d s o r b e mr e s i n sw e r es t u d i e da 1 1 dc o m p a r e dh 1 0 3r e s i nw a ss e l e c t e d f o ri t sh i 曲a d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nc 印a c 時(shí)t h ee 艉c to fc o n c e n t r a t i o n ，p ha n d n o wr a t eo f t h ei n f u s i o no nt h ea d s o r p t i o no f h l 0 3r e s i nw e r es t u d i e dw i t hd y n a m i c a d s o r p t i o ne x p e r i m e n tt h ee x t r a c ts o i u t i o na tac o n c e m m t i o no f13 9 l ，p ho f5 4 8 ， f l o wr a t eo f3 b v mw e r et 1 1 eo p t i m a lc o n d i t i o n w h e nu s i n g6 b v9 5 e t h a n o la s i i 中英文摘要 e l u e mi n2 b v hs p e e d ，d e s o r p t i o nr a t eo fb p ec o u l dr e a c hu pt o8 7 6 3 a n d e l u t i o np e a kw a ss a t i s f a c t o 珥 n a t u r a lb p ew a si s o l a t e da n dp u r i f i e df 而mf e h n e n t a t i o nb r o t hb yc o l u m n c h r o m a t o 乒a p h yo f m a c r o p o m u sa d s o r b e mr e s i nh 1 0 3 ，a n di t sc h e m i c a ls t m c t u r ew a s i d e n t m e db ye i m s ，i t sp u r i t yw a s9 3 2 0 a n dm a t c hq u a l i t yw a s9 4 w h i l e c o m p a r e dw i mm es t a n d a r dc o m p o u n db p e k e y w o r d s ：尉z 8 ，d 療l j ，c p 5 川口肼f o 塒4 2 4 4 d ，b i o t r a n s f o m ，l p h e n y l a l a n i n e b p h e n y i e t h a i l o l ，r e s i n i i i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工 作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地 方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含 本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明 確的說(shuō)明并表示謝意。 簽名 日期：勁緝多月腰日 關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明 本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī) 定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和 磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編 入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽名：杰紐 導(dǎo)師簽名： j 日期：沖6 年；月一，日 第一章緒論 第一章緒論 1 1 產(chǎn)品概況 b 一苯乙醇( b p h e n y l e t h a n 0 1 ) ，也稱2 一苯乙醇、2 一苯基乙醇，化學(xué)名稱為 b 一苯乙基醇( b p h e n ye t h y la l c o h 。1 ) ，分子式c 。h 0 ，分子量1 2 2 1 6 ， 結(jié)構(gòu)式 o h 0 一苯乙醇是一種具有淡雅細(xì)膩玫瑰香味的芳香醇，天然存在于很多花和植 物的精油中，如玫瑰、風(fēng)信子、茉莉、水仙、百合等，其它含有天然b 一苯乙醇 的產(chǎn)品是些生產(chǎn)中涉及發(fā)酵的食品，像茶葉、可樂(lè)、咖啡、面包、白酒、蘋(píng)果酒、 奶酪以及醬油等。玫瑰芳香氣味頗受人們歡迎，使得b 一苯乙醇在食品、藥品、 化妝品、煙草和目化用品中有著廣泛的應(yīng)用，它不僅是所有玫瑰香型香氣的基本 組分，而且具有協(xié)合及增效作用，是多種香型配方所需的組分。 目前，全球b 一苯乙醇的年產(chǎn)量近萬(wàn)噸，基本上都是采用廉價(jià)的化工原料化 學(xué)合成方法生產(chǎn)，僅有很少一部分是從玫瑰精油中提取的。隨著人們生活水平的 提高和對(duì)健康的關(guān)注，消費(fèi)者越來(lái)越重視食品的安全性，更加崇尚“綠色”和“天 然”，食品生產(chǎn)也越來(lái)越傾向使用天然食品添加劑。在歐洲及美國(guó)，標(biāo)有“天然” 的香味料和香料必須是用物理法、酶法或是微生物法處理自然資源生產(chǎn)出來(lái)的 o 。從玫瑰或其它植物的精油中提取b 一苯乙醇的成本非常高，因此必須尋找其 新的天然來(lái)源。生物技術(shù)法生產(chǎn)b 一苯乙醇是用酵母或基因工程菌生物轉(zhuǎn)化l 一苯 丙氨酸或者氟苯丙氨酸，進(jìn)行生物合成。 l 一苯丙氨酸( l p h e n y l a l a n i n e ) ，分子式c 。h 。n 0 ：，分子量1 6 5 1 9 ，結(jié)構(gòu)式 c 0 0 h h 2 n c h 是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人體和動(dòng)物不能靠自身自然合成的必需氨基 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 酸之一，是復(fù)配氨基酸輸液的重要成份，在食品及醫(yī)藥行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。 l 一苯丙氨酸是生物合成b 一苯乙醇應(yīng)用最廣泛的底物。 1 1 1 產(chǎn)品理化性質(zhì) b 一苯乙醇常溫下是無(wú)色透明的液體，具有玫瑰花特有的香氣，沸點(diǎn)2 1 9 8 ，冰點(diǎn)一2 7 ，閃點(diǎn)1 0 2 ，相對(duì)密度1 0 2 0 2 ，相對(duì)折光指數(shù)1 5 3 2 5 ，空氣中閾 值1 2 2 4 n g 幾，水中閾值1 0 0 0ug 幾，常溫常壓下l l 水可溶解1 9 9 ，易溶于醇、 酯、醛等有機(jī)溶劑中。b 一苯乙醇的急性毒性數(shù)據(jù)：口服l d 。1 8 9 k g 體重( 大鼠) ， 皮試l d m 5 1 0 m l k g 體重( 豚鼠) 。”“1 l 一苯丙氨酸常溫下為白色結(jié)晶體或結(jié)晶粉末，昧微苦，熔點(diǎn)2 8 3 ( 分解) ， 易溶于甲酸，溶于水，不溶于乙醇和乙醚。一般含量大于9 9 ，l 一苯丙氨酸主 要用于生產(chǎn)阿斯巴甜，也用于氨基酸輸液等。 1 1 2b 一苯乙醇用途及市場(chǎng)狀況 1 1 2 1 用途 b 一苯乙醇香氣輕柔甜和，是使用量?jī)H次于香蘭素的第二大香料成分，可用 于玫瑰、焦糖、蜂蜜及其它果香型食品香精及各種酒用香精和煙用香精的配制， 它是玫瑰和其它植物風(fēng)味中不可缺少的物質(zhì)；對(duì)堿的穩(wěn)定使得它能專門(mén)地用于肥 皂香料中；少量的b 一苯乙醇用作食品的香味成分，如軟飲料、糖果、餅干等： b 一苯乙醇也是生產(chǎn)其衍生物的不可缺少的原料，它的酯尤其是乙酸苯乙酯，也 是有很高價(jià)值的香料物質(zhì)6 1 ：0 一苯乙醇在醫(yī)藥上可用作抑菌劑。 1 1 2 2 市場(chǎng)狀況 目前，全球b 一苯乙醇的年產(chǎn)量近萬(wàn)噸，基本上都是采用廉價(jià)的化工原料化 學(xué)合成方法生產(chǎn)，僅有很少一部分從玫瑰油中提取?；瘜W(xué)合成的b 一苯乙醇市場(chǎng) 價(jià)格約為3 5 0 美元虹，而天然b 一苯乙醇價(jià)格卻高達(dá)1 ，0 0 0 美元k g 以上。天然 b 一苯乙醇的生產(chǎn)，現(xiàn)在有人估計(jì)o 5 噸年，從玫瑰或其它精油中提取價(jià)格昂貴， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需要。 隨著各國(guó)對(duì)食品安全的重視和加強(qiáng)管理，近年來(lái)各國(guó)商標(biāo)法中對(duì)加工食品的 某些限制性規(guī)定日益明確，例如在澳大利亞悉尼的街頭、日本東京的超市，你都 會(huì)在食品包裝的突出位置上看到“天然”、“含天然香料”、“無(wú)添加化學(xué)合成品”、 “無(wú)添加化學(xué)調(diào)味品”之類的字樣。其目的顯然是為了迎合消費(fèi)者對(duì)“天然”食 品的需要。因?yàn)槿藗儗?duì)化學(xué)合成的食品添加劑具有某種抵觸乃至恐懼心理，因而 為安全、健康寧愿付出高于合成品幾倍乃至幾十倍的價(jià)格去選購(gòu)天然產(chǎn)品，美國(guó) 一些高檔的食品寧愿用天然提取的b 一苯乙醇而不用廉價(jià)的合成b 一苯乙醇。 國(guó)際上天然b 一苯乙醇主要是以微生物轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸法生產(chǎn)，主要集中在法 國(guó)、德國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)目前尚無(wú)生產(chǎn)天然0 一苯乙醇的廠家。 國(guó)際上天然b 一苯乙醇需求增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛，當(dāng)前的生產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足消費(fèi)需 第一章緒論 要。 1 2 國(guó)內(nèi)外技術(shù)發(fā)展概況和發(fā)展趨勢(shì) 1 2 1 p 一苯乙醇的化學(xué)合成 從1 8 7 6 年發(fā)現(xiàn)0 一苯乙醇以來(lái)，已報(bào)道過(guò)多種化學(xué)合成方法。目前主要生產(chǎn) 方法有苯一環(huán)氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氫法“1 。 圖l 苯一環(huán)氧乙烷合成法 v 罵c 廠u 川d 2 憂。旦洲岬： 圖2 氧化苯乙烯加氫法 一一、h ，o o ，r 一 國(guó)際市場(chǎng)上苯環(huán)氧乙烷合成法產(chǎn)品占4 0 ，氧化苯乙烯加氫法產(chǎn)品占6 0 。苯 一環(huán)氧乙烷合成法產(chǎn)品所含微量雜質(zhì)不同，香氣差異較大，大多不能用于香料， 國(guó)內(nèi)主要采用氧化苯乙烯加氫法，而苯一環(huán)氧乙烷合成法生產(chǎn)的0 一苯乙醇產(chǎn)品質(zhì) 量尚未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)?；瘜W(xué)合成方法生產(chǎn)的b 一苯乙醇，常含有不良?xì)馕兜母碑a(chǎn)物， 如聯(lián)二苯，b 一氯代乙苯，氯乙醇等，這些雜質(zhì)難以用蒸餾、精餾、重結(jié)晶等物 理方法去除，因而產(chǎn)物的純化是一個(gè)非常突出的問(wèn)題。不同質(zhì)量等級(jí)的b 一苯乙 醇有不同的用途，只有經(jīng)過(guò)較高成本的純化后，e 苯乙醇產(chǎn)品才能達(dá)到食用和 日用香料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 1 2 2 生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)b 苯乙醇 許多發(fā)酵食品，如面包、葡萄酒、蘋(píng)果酒、啤酒、黃酒、干酪、醬油以及烏 龍茶等都帶有芬芳的香味，香味物質(zhì)都是由酵母在發(fā)酵過(guò)程中自然形成。在發(fā)酵 過(guò)程中，大多數(shù)酵母菌能產(chǎn)生雜醇油，而b 一苯乙醇是雜醇油的重要組成部分， 也是決定發(fā)酵食品品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵因素，例如，清酒中b 一苯乙醇濃度為2 0 7 0 m g 幾，黃酒中高于1 0 0 m g l 。酵母細(xì)胞可以從頭開(kāi)始合成，也可以通過(guò)氨基酸分 解代謝途徑轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸生成b 一苯乙醇。 1 2 2 1 合成b 一苯乙醇的代謝途徑 苯丙酮酸途徑： 在一些酵母細(xì)胞中，b 一苯乙醇可以通過(guò)合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑從 頭合成“1 ，即經(jīng)過(guò)莽草酸途徑形成分枝酸后，分枝酸在變位酶作用下，轉(zhuǎn)變成預(yù) 苯酸，經(jīng)過(guò)脫水、脫羧后形成苯丙酮酸，苯丙酮酸脫羧產(chǎn)生苯乙醛，苯乙醛脫氫 便生成b 一苯乙醇，代謝途徑如圖卜3 。 洲 v 9 蘭 o 江南大學(xué)碩一l 學(xué)位論文 l 一苯丙氨 圖卜3l 一苯丙氨酸的代謝途徑 4 一磷酸赤蘚糖 磷酸烯醇式丙酮酸 轉(zhuǎn)氨酶 莽草酸 i 分枝酸 i 預(yù)苯酸 苯丙酮酸途徑 i 苯丙酮酸+ 苯乙醛+ b 苯乙醇 艾氏途徑 苯乙胺+ 苯乙醛+ b 一苯乙醇 順式肉桂酸卜3 一酮基乙二酸。卜t c a肉桂酸途徑 艾氏途徑： 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，l 苯丙氨酸分解轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，酪氨酸再?jīng)過(guò)尿黑酸降 解為延胡索酸和乙酰乙酸。而在微生物細(xì)胞中，l 一苯丙氨酸的分解代謝可能存在 幾種途徑。其中之一是肉桂酸途徑，降解過(guò)程的第一步是苯丙氨酸脫去氨基產(chǎn)生 順式肉桂酸，如在擲抱酵母( 勛。，曲o 陽(yáng)日s ，d 5 日u 5 ) 和薪紅酵母( 肋d 面f d 川拈 “t j n 括) 細(xì)胞中。對(duì)于把氨基酸僅作為氮源利用的微生物來(lái)說(shuō)，肉桂酸已沒(méi)有 進(jìn)一步降解的必要：而對(duì)于能夠利用氨基酸作為碳源的微生物，肉桂酸則經(jīng)過(guò)原 兒茶酸進(jìn)一步降解為3 一酮基乙二酸，3 酮基乙二酸最終進(jìn)人到t c a 循環(huán)中”1 。 在微生物細(xì)胞中，l 一苯丙氨酸分解的另一條途徑是通過(guò)氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用生 成苯丙酮酸，再脫羧形成苯乙醛，苯乙醛經(jīng)氧化脫氫酶作用生成0 一苯乙醇，代 謝途徑見(jiàn)圖卜3 。這個(gè)途徑首先是由e h r l i c h 在1 9 0 7 年發(fā)現(xiàn)，后來(lái)便以他的名字命 名。l 一苯丙氨酸去羧基生成苯乙胺，苯乙胺伴隨著有氧化特征的去氨基作用生成 苯乙醛，苯乙醛再經(jīng)過(guò)還原作用也可生成苯乙醇( 圖3 ) ，然而，通常情況下這個(gè) 反應(yīng)很少發(fā)生。 在酵母細(xì)胞中，b 一苯乙醇合成走哪一條途徑取決于培養(yǎng)基中氮源的種類， 只有當(dāng)l 一苯丙氨酸作唯一氮源存在時(shí)，艾氏途徑才能占優(yōu)勢(shì)。如果環(huán)境中有其它 更容易利用的氮源存在，即使在較高的l 一苯丙氨酸濃度條件下，l 苯丙氨酸仍有 一部分通過(guò)其它途徑被代謝，如通過(guò)肉桂酸途徑降解為3 一酮基乙二酸而進(jìn)入t c a 循環(huán)，而且這個(gè)降解途徑不能完全被抑制，所以任何條件下，l 一苯丙氨酸不可能 完全轉(zhuǎn)化為b 一苯乙醇0 1 。 y 匿 酸 第一章緒論 1 2 2 2 合成b 一苯乙醇的微生物 多種酵母具有從頭合成和生物轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸生成b 一苯乙醇的能力，如馬 克斯克魯維酵母( 朋秒y 盯叩y c p s 肋刪j a ，7 嬲) 發(fā)酵5 d ，可產(chǎn)生濃度為4 0 0m g l 的 b 一苯乙醇“0 1 ，發(fā)酵畢赤酵母( 廳曲婦角珊日t a 門(mén)曲發(fā)酵1 6h ，可形成濃度為5 0 5 5 m g 幾的b 一苯乙醇“。此外，還有酸酒酵母( 白c 曲a r d 幔y c p s 一叮月0 、產(chǎn)阮球擬 酵母0 t o r u i o p s j s ut j n 畝、甍毽壯轅霉t c i a d o s p o r i u m ci a d o s p o r i o i d e 島、乳 酸克魯維酵母( 們妙陽(yáng)r d 毋y c p s 兒c j 曲、釀酒酵母、異常漢遜酵母( s 鯽u 厶 卸啪a ) 等，都能在生長(zhǎng)過(guò)程中從頭合成一定量的b 一苯乙醇“”。 不少真菌也具有從頭合成或轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸為b 一苯乙醇的能力，如火木層 孔菌( 肋p j 力“s 伽j a ，j ) 、平滑層孔菌( p 厶ey 冶af u 0 、楊木層孔菌( 尸打 鯽u j a 0 、安息香薄皮孔菌( 厶c 砌d 砌6 鯽z d j 月刪) 、帚狀地霉( 飴d 打拍冊(cè) p e n i c i h a t u m 、喪9 ；菌0 f e r i c i u me r i n a c e u 自、毛龜黑j 憾0 n i g r o p o r u sd u r u 由 和黑曲霉( 爿5 p 盯百曬門(mén)啦0 等，但合成或轉(zhuǎn)化能力相對(duì)較低“”。 1 2 2 3 生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)b 苯乙醇的研究進(jìn)展 1 9 8 5 年r o d o p u l oe ta 1 用翰c c 加r d 毋y c p s 訂，7 j 和脅“s 拈“f - 拈發(fā) 酵葡萄汁，7 天后生產(chǎn)出1 2 m g l b p e o ”： 1 9 9 3 年j i a n g 用一朋咿y 盯r c e s 腮塒j a 力垤菌株5 天后生產(chǎn)出7 2 m g l b p e 。： 1 9 9 5 年f a b r ee ta 1 用朋址r p 盯d 緲c 8 s 舾刪j a 門(mén)“s 菌株5 天后生產(chǎn)出 4 0 0 m g l0 一p e n ； 1 9 9 4 年a 1 b e r t a z z ie ta 1 用腳d e c 七e ? as a 亡u 2 7 療u sc b s5 7 6 1 和i 眙月s e 門(mén)，a a 口船如c b s1 1 0 在含2 9 幾l p h e 而不含其它氮源的培養(yǎng)基中2 4 h 后得到1 7 g l0 一p e ；相同條件下他們用婦c 動(dòng)a ，歸e sc 盯e 叮s j a p n c y c7 3 9 得到1 5 9 l b p e 1 ： 2 0 0 0 年h u a n ge ta 1 用戌曲婦如珊月t a ，7 sl 一5 發(fā)酵含有l(wèi) g 幾l p h e1 6 天后生產(chǎn)出4 5 3 m g 幾b p e “； 2 0 0 1 年s t a r k 等人用工c p ，p 訂s j a eg i v2 0 0 9 在含6 9 ll p h e 的培養(yǎng)基 中4 8 h 后得到2 3 5 9 lp p e 0 1 。 b p e 對(duì)酵母細(xì)胞有毒害作用，當(dāng)發(fā)酵液中b p e 積累到一定濃度時(shí)，便會(huì) 抑制酵母細(xì)胞的正常生理代謝。為此，國(guó)外有研究人員采用原位產(chǎn)物分離技術(shù)( i n s i t up r o d u c tr e m o v a l ) ，可使得b p e 的產(chǎn)率大大提高。 2 0 0 2 年，s t a r ke ta 1 以油醇作萃取劑，用sc 盯e y j s j a p 進(jìn)行兩相補(bǔ)料 分批培養(yǎng)，發(fā)酵液中b p e 可達(dá)到1 2 6 9 幾“”； 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 0 0 3 年，e t s c h m a n ne ta 1 用朋“r 舊，d 刪c e s 腳，x j 卸“sc b s6 0 0 以油醇 作為萃取劑進(jìn)行兩相發(fā)酵，搖瓶中b p e 可達(dá)3 9 l 。培養(yǎng)工藝優(yōu)化后，產(chǎn)率可達(dá) 到5 6 9 幾1 。 國(guó)內(nèi)報(bào)道的微生物法生產(chǎn)b p e 只有華寶香化科技發(fā)展有限公司曾做過(guò)酵母 發(fā)酵煙草加工副產(chǎn)物生產(chǎn)b p e 的研究，并申請(qǐng)了該方面的專利。 1 2 3 原位產(chǎn)物分離技術(shù)在b 一苯乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用 和其它醇類物質(zhì)一樣，高濃度日一苯乙醇對(duì)微生物細(xì)胞有一定的毒性。培養(yǎng) 基中加入較高濃度的l 一苯丙氨酸前體，酵母能夠轉(zhuǎn)化形成的8 一苯乙醇達(dá)到的濃 度就等于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度：此外，酵母在發(fā)酵中自身也會(huì)產(chǎn)生大量的乙醇， 而且乙醇和b 一苯乙醇聯(lián)合作用產(chǎn)生的毒性比它們各自產(chǎn)生的毒性作用累加要 高。所以在要求達(dá)到高產(chǎn)量生產(chǎn)b 一苯乙醇工藝過(guò)程中，必須考慮b 一苯乙醇和乙 醇對(duì)酵母的毒性。克服b 一苯乙醇和乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的毒性，可以借鑒高濃度乙 醇發(fā)酵技術(shù)。從菌種角度考慮，不同的酵母菌或同種不同菌株對(duì)b 一苯乙醇的耐 受性不同，例如，濃度為2 o g l 的b 一苯乙醇就能完全抑制馬克斯克魯維酵母的 生長(zhǎng)，而對(duì)于釀酒酵母，達(dá)到相同的抑制效果時(shí)，b 一苯乙醇濃度需4 o g 幾以上 拍町 因而可以選育耐高濃度b 一苯乙醇和乙醇的酵母菌株作為生產(chǎn)菌種，或采用 克拉布特里陰性酵母，如馬克斯克魯維酵母和異常漢遜酵母：從發(fā)酵工藝角度考 慮，一方面，控制葡萄糖濃度可以阻止克拉布特里陽(yáng)性酵母產(chǎn)生乙醇，如采用補(bǔ) 料分批發(fā)酵。1 ：另一方面則是開(kāi)發(fā)一種從發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)回收b 一苯乙醇的技 術(shù)，即原位產(chǎn)物分離技術(shù)( i ns i t up r o d u c tr e m o v a l ，簡(jiǎn)稱i s p r ) ，就是在水相 的發(fā)酵培養(yǎng)基中加人水不溶性的有機(jī)溶劑，0 一苯乙醇溶解到有機(jī)溶劑中，發(fā)酵 液中的b 一苯乙醇濃度降低，從而降低對(duì)酵母細(xì)胞的毒害作用，有利于l 一苯丙氨 酸向b 一苯乙醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，圖4 是e t s c h m a n n 設(shè)計(jì)的i s p r 工藝簡(jiǎn)圖”。采 用i s p r 技術(shù)發(fā)酵，b 一苯乙醇的轉(zhuǎn)化率可以大幅度提高”o 。 圖4 搖瓶和發(fā)酵罐生產(chǎn)b 一苯乙醇的原位分離技術(shù)示意圖 第一章緒論 1 2 4 發(fā)酵液中b 一苯乙醇提取研究概況 目前，關(guān)于b 一苯乙醇提取方法的文獻(xiàn)報(bào)道很少，資料中探討比較多的主要 是有機(jī)溶劑萃取法、吸附分離法、超臨界c o 。萃取法、全蒸發(fā)法等等”“。常用的 是有機(jī)溶劑萃耿法，常用有機(jī)溶劑為乙醇、甲醇、丙酮等，由于乙醇毒性低、易 回收利用，所以在大量提取時(shí)，一般采用一定濃度的工業(yè)乙醇進(jìn)行提取。但是有 機(jī)溶劑萃取法存在溶劑殘留和生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。樹(shù)脂吸附分離法通過(guò)物理吸附 從水溶液中選擇性地吸附目標(biāo)產(chǎn)物，近些年來(lái)成為分離天然b 苯乙醇的有效方 法2 “。 1 2 5 發(fā)展趨勢(shì) 在當(dāng)今生物技術(shù)迅速發(fā)展并轉(zhuǎn)化為商品的時(shí)代，生物化工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分迅 猛，據(jù)有關(guān)方面預(yù)測(cè)，未來(lái)將有2 0 一3 0 的化學(xué)工藝過(guò)程會(huì)被生物技術(shù)過(guò)程所取 代。同時(shí)，隨著石油等非再生資源日益減少、世界人口和環(huán)境壓力的增加，應(yīng)用 現(xiàn)代生物技術(shù)改造和替代傳統(tǒng)化工工藝的趨勢(shì)越來(lái)越引起人們的重視，為傳統(tǒng)技 術(shù)或常規(guī)技術(shù)所不能解決的重大問(wèn)題帶來(lái)新的曙光。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)b 一苯乙醇 順應(yīng)了這一要求，而人們對(duì)天然添加劑的青睞，促成了天然b 一苯乙醇的高價(jià)格， 這些原因使得生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)b 一苯乙醇成為一個(gè)頗有吸引力的研究課題。 1 3 本課題的研究意義 雖然過(guò)去b 一苯乙醇的生產(chǎn)一直使用傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法，生產(chǎn)技術(shù)成熟， 產(chǎn)品價(jià)格低廉，但隨著時(shí)間的推移，人民生活水平不斷的提高，消費(fèi)者越來(lái)越關(guān) 注食品的安全性問(wèn)題，越來(lái)越追求“天然、綠色”的食品，對(duì)化學(xué)合成的食品添 加劑產(chǎn)生抵觸情緒，意識(shí)到化學(xué)合成品可能對(duì)身體健康所帶來(lái)的副作用；另一方 面，不少國(guó)家開(kāi)始指定更為嚴(yán)格的食品法規(guī)，開(kāi)始強(qiáng)調(diào)食品安全的重要；而能夠 符合“天然”要求的b 一苯乙醇一直是通過(guò)從植物中提取而得到的，由于受到植 物原料來(lái)源，地域以及氣候等因素的影響，產(chǎn)量很小，只占世界b 一苯乙醇市場(chǎng) 年銷量的o 2 ，價(jià)格昂貴，不能滿足日益增長(zhǎng)的需求。這三個(gè)方面的原因使香料 工業(yè)越來(lái)越感興趣于利用其它的天然資源來(lái)生產(chǎn)天然b 一苯乙醇，這種普遍趨勢(shì) 己經(jīng)在許多文章中被提到。歐美的立法機(jī)構(gòu)認(rèn)可采用生物活細(xì)胞或其中的組成部 分( 例如酶) 所生產(chǎn)的物質(zhì)為天然產(chǎn)物，這樣，一種有效的替代方法，即利用微生 物細(xì)胞生產(chǎn)天然b 一苯乙醇的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，成為很有前途的替代方法。 微生物轉(zhuǎn)化法相對(duì)于傳統(tǒng)的化學(xué)合成法和植物提取法具有以下優(yōu)點(diǎn)： a 有害物質(zhì)含量低； b 可大規(guī)模生產(chǎn)； c 生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)影響； d 反應(yīng)條件溫和： e 比提取法成本低； 江南大學(xué)碩：【：學(xué)位論義 無(wú)疑，天然b 一苯乙醇的市場(chǎng)潛力是非常巨大的，而采用微生物轉(zhuǎn)化法來(lái)生 產(chǎn)天然b 一苯乙醇越來(lái)越成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。對(duì)此投入力量進(jìn)行研發(fā)，會(huì)給 國(guó)家?guī)?lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)有益于人民生活水平的提高。 1 4 本課題的研究任務(wù) 1 4 1 技術(shù)路線 c 0 0 hc 0 0 o o h | r 、n h 2t 怕。l n i 鉗廠磚斗o d e c a r b o 帥s 。 r hd 邑h 州m 9 e 帖蘭r 南。蕊白弋白。主毛由 l - p h e 哪a n i n ep h e n y i p y n j v a t e p h e n 卅a c e f a l d e h y d e 2 。p h e n y i e l h a n 0 1 1 4 2 本課題的主要研究?jī)?nèi)容 ( 1 ) 篩選出能夠轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸生成b 一苯乙醇的酵母菌株； ( 2 ) 建立測(cè)定生物轉(zhuǎn)化體系中底物和產(chǎn)物的方法； ( 3 ) 探究轉(zhuǎn)化發(fā)酵的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)工藝的最優(yōu)條件； ( 4 ) 進(jìn)行發(fā)酵液中b 一苯乙醇的提純工作； ( 5 ) 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物予以結(jié)構(gòu)鑒定。 第二章轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸生成b 一苯乙醇菌株的篩選及檢測(cè)方法的建立 第二章 轉(zhuǎn)化l 苯丙氨酸生成b 苯乙醇菌株的篩選 及檢測(cè)方法的建立 2 1 前言 報(bào)道的能夠生物轉(zhuǎn)化l - 苯丙氨酸生產(chǎn)天然b 一苯乙醇的微生物中最主要的是 酵母菌，不同酵母產(chǎn)生p 一苯乙醇的程度很不相同。報(bào)道的能夠產(chǎn)生b 苯乙醇的酵 。母菌奄k l “y v e r o m y c e sm a r x i d n u s 、s a c c h d m v c e sc e r e v i s i n e 、p 記h i df e r m e n f n n s 、 k z d p c 婦，口5 d f “r 胛螂、 舶仃s e 門(mén)“腸徹d 肌d 腸、z j 臀d s d c c 向口，d 啪y c 盯，口o f f 、 p f c 曬 徹d 塒口腸、c 協(xié)v 拈p d ，口，淞婦n 鉀等等。為了得到一產(chǎn)量較高的菌株，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室 保藏的據(jù)報(bào)道可能能夠轉(zhuǎn)化l 一苯丙氨酸生成b 一苯乙醇的4 1 株酵母菌予以初篩和 復(fù)篩，從中篩選出一產(chǎn)量最高的菌株作為目標(biāo)菌株。同時(shí)建立了測(cè)定發(fā)酵液中底 物和產(chǎn)物的方法，包括t l c 法測(cè)定發(fā)酵液中產(chǎn)物的產(chǎn)量、水合茚三酮法測(cè)定發(fā) 酵液中底物含量、r p h p l c 法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中底物和產(chǎn)物。 2 2 材料與方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 試劑與原材料 l 一苯丙氨酸醫(yī)藥級(jí)江蘇無(wú)錫晶海氨基酸股份有限公司 b 一苯乙醇對(duì)照品 實(shí)驗(yàn)試劑s i g m a 化學(xué)試劑公司 硫酸鎂分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 磷酸二氫鉀分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 磷酸氫二鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 無(wú)氨基酵母氮源( 町b )生化試劑上海生工生物技術(shù)發(fā)展有限公司 薄層層析硅膠g f 2 5 4 化學(xué)純中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司 甲醇色譜純江蘇漢邦科技有限公司 乙腈色譜純江蘇漢邦科技有限公司 甲醇分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 乙酸乙酯 分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 正己烷分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 二氯甲烷分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 乙腈分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 甲酸分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 氯仿 分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 無(wú)水乙醚分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 冰醋酸 分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 ，-r i l 江南大學(xué)碩：t 學(xué)位論文 苯分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 苯酚分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 9 8 濃硫酸分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 異丙醇分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 酵母膏生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 蛋白胨生化試劑國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 葡萄糖分析純 國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 蔗糖分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 果糖生化試劑上海試劑二廠 麥芽糖分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 木糖生化試劑上海試劑二廠 乳糖生化試劑上海試劑二廠 半乳糖 分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 甘油分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 可溶性淀粉 分析純國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 羧甲基纖維素鈉化學(xué)純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 瓊脂 生化試劑國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 茚三酮分析純國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 麥芽汁( b x l o o )自制 超純水自制 2 2 1 2 儀器與設(shè)備 薄層層析缸上海醫(yī)用分析儀器廠 u v 1 2 0 1 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京瑞利分析儀器公司 a g i l e n t1 1 0 0 高效液相色譜儀系列 安捷倫科技有限公司 電子天平( m e t t l e r t o l e d o ，a b1 0 4 一nm a x l 0 1 9 ，d = o 1 m g ) 0 4 5pm 微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠 臺(tái)式離心機(jī)t d l 一5 上海安亭科學(xué)儀器廠 無(wú)菌超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜h y g i ia 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司 s p x 一2 5 0 型生化培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 電熱鼓風(fēng)干燥箱n c l 0 1 2 a南京市長(zhǎng)江電器儀器廠 h d 一3 紫外檢測(cè)儀上海滬西分析儀器廠 2 2 1 3 微生物菌種 實(shí)驗(yàn)室保藏酵母菌株4 1 支 o j1j1j 第二章轉(zhuǎn)化l 一苯丙氦酸生成b 一苯乙醇菌株的篩選及檢測(cè)方法的建立 2 2 1 4 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂( b x1 0 。) 。 種子培養(yǎng)基( g l ) ：葡萄糖1 0 ，麥芽汁( b x1 0 。) 3 ，蛋白棟5 ，酵母膏3 。 發(fā)酵培養(yǎng)基( g l ) ：葡萄糖3 0 ，l p h e7 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，k h 2 p 0 4o 5 ，婚1 7 。 2 2 2 實(shí)驗(yàn)方法 2 2 2 1 菌種培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)：將保存的斜面菌種，接一環(huán)到新鮮的斜面培養(yǎng)基上，2 8 ，培養(yǎng) 2 3 d ： 種子培養(yǎng)：接斜面菌體一環(huán)到種子培養(yǎng)基中，2 8 ，2 2 0 r i n i n 培養(yǎng)2 8 h ，裝液 量5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶； 發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入5 種子液( 約3 1 0 。7 個(gè)) ，2 8 ，2 2 0 r m i n 培養(yǎng)4 8 h ，裝液量5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶。 2 2 2 2 菌種初篩 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，4 0 0 0 r m i n ，離心1 5 m i n ，上清液經(jīng)0 4 5um 微孔濾膜過(guò)濾， 再用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)t l c 分離，碘蒸汽熏蒸顯色，對(duì)各菌株 發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較，選取十株產(chǎn)b 一苯乙醇較高的的菌株再予以進(jìn)一步的復(fù)篩。 2 2 2 3 菌種復(fù)篩 將初篩的十株酵母對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液，經(jīng)0 4 5pm 微孔濾膜處理后，上高效液相 色譜予以分析，以外標(biāo)法測(cè)定其中產(chǎn)物含量，選取一產(chǎn)量最高的菌株作為目標(biāo)菌 株。 2 2 2 4 菌體生物量的測(cè)定 取5 0 m l 發(fā)酵液于4 0 0 0 r m i n 下離心1 0 m i n 后，用蒸餾水洗滌離心一次，于 1 0 5 下烘干至恒重，稱重，單位m 5 0 m l 。 2 2 2 5t l c 法測(cè)定發(fā)酵液中b 苯乙醇的含量 配制o 5 的羧甲基纖維素鈉水溶液，煮沸以加速其溶解，自然冷卻后，在研 缽中與硅膠一起研磨，均勻后，在潔凈平滑的玻璃板上傾注硅膠，待硅膠成光滑 鏡面后，常溫下靜置至干燥。使用前1 0 5 下活化1 小時(shí)，置于干燥器中備用。 通過(guò)試驗(yàn)來(lái)確定合適的展開(kāi)劑。 將待測(cè)發(fā)酵樣品用乙酸乙酷萃取靜置分層后，分取有機(jī)相，用微量進(jìn)樣器在 干燥后的薄板上點(diǎn)樣2 0ul ，并用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干，兩點(diǎn)間相距l(xiāng) c m 以上。樣品沿 向下，將薄板放入缸中，溶劑前沿至距上沿約1 c m 時(shí)取出薄板晾干后顯色。 展開(kāi)后的板在2 5 4 肌l 的紫外燈下發(fā)出明顯的熒光，被樣品覆蓋的地方呈現(xiàn)出暗 斑，由斑的大小及深淺可以區(qū)別出樣品濃度的大小。 也可以用硫酸、硝酸、硫酸硝酸、高錳酸鉀一硫酸、重鉻酸鉀硫酸在薄板上 適當(dāng)噴霧來(lái)觀察b 一苯乙醇的顯色，噴霧后，加熱到1 0 0 1 2 0 即可產(chǎn)生特殊顏色 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 的斑點(diǎn)“。 出于底物與產(chǎn)物均有苯環(huán)的存在，碘蒸氣與之加成后呈現(xiàn)出黃褐色的色斑， 除了大小和面積外，顏色的深淺也代表著物質(zhì)的含量。由于碘蒸氣熏蒸效果好， 操作方便，所以采用其作為初步估計(jì)產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑。 2 2 2 6 茚三酮法測(cè)定發(fā)酵液中l(wèi) 苯丙氨酸的含量1 2 4 2 5 ，2 6 t 2 7 l 茚三酮反應(yīng)( n i n h y d r i nr e a c t i o n ) 這是氨基酸的。一n h 2 所引起的反應(yīng)。d 一氨基 酸與水合茚三酮一起在水溶液中加熱，可發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。首先是氨基 酸被氧化分解，放出氨和二氧化碳，氨基酸生成醛，水合茚三酮?jiǎng)t生成還原型茚 三酮。在弱酸性溶液中，還原型茚三酮、氨和另一分子茚三酮反應(yīng)，縮合生成藍(lán) 紫色物質(zhì)。反應(yīng)過(guò)程如圖2 1 。 o 0 c “+ m + c 。+ h 彳。 o h 、h i | o 遙娠型旁f i l 瞄炎 o0 o o 冷c ： 藍(lán)萋魚(yú)p 傷 0 。j 圖2 一l 茚三酮反應(yīng) l 一苯丙氨酸和茚三酮反應(yīng)縮合生成藍(lán)紫色物質(zhì)，根據(jù)反應(yīng)所生成的藍(lán)紫色溶 液顏色的深淺，在5 7 0 眥波長(zhǎng)下進(jìn)行比色就可測(cè)定樣品中氨基酸的含量。 2 2 2 7 高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中l(wèi) 苯丙氨酸和b 苯乙醇 將待測(cè)樣品進(jìn)樣前用o 4 5um 微孔濾膜過(guò)濾處理，濾液立即上h p l c 分析， 用c 1 8 柱( d i k m ad i 鋤o n s i l c l 8 ，2 5 0 n 1 1 1 1 4 6 m m ，5um