（物理化學專業(yè)論文）芳香氨基酸、含硫氨基酸及其肽的激光化學研究.pdf

徐韭平：中國科學技術大學博士論文 內(nèi)容摘要 內(nèi)容摘要 f 3 8 i 3 3 5 ， 篷物分子的先化學主要是涉及蛋白質(zhì)與核酸及其組分的光化學，是研究光生物學 的基礎。生物分子對光的吸收在紫外光區(qū)，所以其光化學是研究紫釙光對它l f 】的終鼴。 光化學感興趣的氨基酸是芳香氨基酸，一是禽巰鬣基酸。這躡類氨蒸酸都愚入體掰 必蓑的氨基酸，在人體 弋謝過稷中起著藿要作鬻。在芳香氨基酸生色翻吸收紫外光引 起鵑器自質(zhì)光仡學事件中，有些分子水平的變化會導致有謄的生物效應：如引起細胞 死亡，光致變異和光致瘸等。作用方式有兩種：即通過光敏劑敏化和點接 乍用。光化 學對食硫氮基酸的研究興趣主要在于對光作用弓l 起的蛋白艨中食磙氨酸戇撰傷秘援傷 的傳遞。氨基酸、肽、蛋自族及酶款光損傷除壹接吸收u v 輻射葶| 起韻損傷夕 ，還通 過光敏裁損傷。紫井光弓l 超豹生物分子的化學交純是光生物學的重簧研究課題，其成 巢將為人們鼠分予水平上為生物合成和在遺傳學提供理論根據(jù)。 。 、1 7 本文主要結粱魏下本文戳不弱結構芳香氨基酸、甲硫氨纂酸及其肽作為研究對 象，運焉激光光解瞬態(tài)蔽牧光譜方法研究它們的單電子氧化反應，光敏化反應和光電 離過程，分析表征了三種過程中的瞬態(tài)產(chǎn)物。在三種反應體系中分別觀察到肽分子內(nèi) 的電子轉(zhuǎn)移；提出了單電子氧化反應，光敏化反應的反應極理并獲縟楣應的動力學參 數(shù)。 1 芳香氨基酸被單電子氧化( s o 。) 和光電離過程中自由基的生成過程。p i t 壤對芳香氨 基酸光電離過程的影響。二放( t r p - t y r ) 分子走的毫予轉(zhuǎn)移 含芳香氨基酸殘基的簡單膚和蛋白質(zhì)模型中，硪究分子內(nèi)黢鏈壤孑轉(zhuǎn)移一般采瘸 脈沖輻解的研究方法。本文則運照激光閑光競解方法，磷究了芳香氨基酸被單電子氧 化( s o ?！? 秘光毫離過程中懿鑫幽基豹生成邋程，分尉在t r p t y r 的單電子氧化( s 0 4 “) 和 光泡離過程中，觀察到由t r p n - t y r 斗1 印一t y r o 的自由基生成過程。p h 值對酪氨酸和 色氨酸的光電離過程有顯著影響，溶液p h 增大，光電離傾向單光子過程，溶液p 毛減 小傾向于雙光予過程，恧對苯麗氨酸幾乎沒蠢影嗽。避一步磺究衰弱，懿氨酸、色氨 酸光咆寒過程的p h 效斑分別澡予酚羥罄氫、# l 垛環(huán)上 n h 的解離。 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 內(nèi)容摘要 2 采用丙酮敏化的方法，對芳香氨基酸的激發(fā)三重態(tài)和自由基進行表征，并獲得相應 的動力學參數(shù)，在t r p - t y ，丙酮體系中，首次直接觀察到光敏劑激發(fā)三重態(tài)引發(fā)的 t r p n - t y r - + t r p t y r i o 。分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移 在丙酮存在下，色氨酸( t r p ) 和酪氨酸( t y r ) 的水溶液丙酮敏化光解，丙酮三重態(tài)與 t r p 、t y r 分別通過三重態(tài)三重態(tài)( t t ) 激發(fā)能轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移生成t r p 激發(fā)三重態(tài)、n 中心色氨酸自由基( t r p n ) 和酪氨酸的酚氧自由基( t y r o ) ；苯丙氨酸( p h e ) 不能與丙酮 三重態(tài)進行激發(fā)能轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移。含芳香氨基酸殘基肽的丙酮敏化光解，對于含色 氨酸殘基( t r p ) 的肽，丙酮三重態(tài)與t r p 分別進行t t 激發(fā)能轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移生成t r p 激 發(fā)三重態(tài)和n 中心自由基( t r p n ) ；而含酪氨酸殘基的肽，丙酮三重態(tài)僅與t y r 進行電 子轉(zhuǎn)移生成t y r 的酚氧自由基( t y r o ) 。尤其是t r p t y r a c 光解體系，首次直接觀察到光 敏劑激發(fā)三重態(tài)引發(fā)的t r p n 。一t y r o t r p t y r o 分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移。 3 運用激光光解的方法，在單電子氧化( s o 。“) 過程中，首次在中性介質(zhì)中直接觀察到 反應過程中生成了三種含硫三電子鍵自由基中間體 過去運用脈沖輻解研究h o 自由基氧化含硫氨基酸提出的機理認為生成的【s 。s r 只能存在于強酸溶液中；運用激光光解光敏化氧化含硫氨基酸也未能直接觀察到反應 過程中生成的含硫三電子鍵自由基中間體。本工作運用激光光解的方法，研究s o ?！皢?電子氧化d 一甲硫氨酸( m e t ) 、l 一甲硫氨酸甲月匕( m m e ) 、甲硫氨酰甲硫氮酸( m e t m e t ) 、 丙氨酰甲硫氨酸( a l a m e t ) 和n 一甲酰甲硫氨酰色氨酸( n f o r m y l - m e t t r p ) 的反應過程。首 次在中性介質(zhì)中觀察到反應過程中生成了三種含硫三電子鍵自由基中間體，【s 。s r 、【s n 】+ 和【s o 】，測定了動力學常數(shù)，分析了反應機理，討論了肽分子結構對三電子鍵 形成的影響。 4 首次獲取了4 一硝基喹啉氧化物( 4 n q o ) 與含硫氨基酸及其衍生物和肽光敏化反應時， 4 n q o 與甲硫氨酸殘基發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)，觀察到4 - 硝基喹啉氧化物( 4 n q o ) 與 含硫氨基酸及其衍生物和肽光敏化反應時生成的0 【烷基自由基 以4 - 硝基喹啉氧化物( 4 n q 0 ) 為光敏劑，研究了4 - 硝基喹啉氧化物( 4 n q 0 ) 與甲硫 氨酸、甲硫氨酸甲酯、含甲硫氨酸二肽( m e t - m e t ，a l a m e t ，m e t l u e 和m e t g l y ) g l 甲硫 i l ， 田2 y - t , i ，潞業(yè)業(yè)加 油，d * j 目 、 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 內(nèi)容摘要 氨酸三肽( m e t - l u e - p h e ) 的光敏化反應。水溶液中的4 n q o 被2 4 8 n m 激光激發(fā)，生成 4 n q o 三重態(tài)，4 n q o 激發(fā)三重態(tài)被甲硫氨酸及其肽猝滅，發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應，在 2 9 0 r t m 和4 5 0 n m 觀察4 n q o h 和甲硫氨酸及其肽抽氫自由基僅烷基自由基的生成。分 析了反應機理，并得到相應的速率常數(shù)。其中0 【烷基自由基是在光敏化反應過程中首 次觀察到的，獲得到了甲硫氨酸及衍生物與4 n q o 光敏化反應中電子轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)。 5 運用可調(diào)波長激光光解方法研究芳香氨基酸的光電離過程，首次通過激光光解方法 獲得了色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸的電離電位 常用于研究激光光解的激光波長是單一固定的，給運用激光光解方法研究色氨酸， 酪氨酸和苯丙氨酸的電離電位帶來了一定的限制。本文在證實芳香氨基酸光電離為單 、 光子過程之后，通過改變激發(fā)光波長測定了色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸的電離電位。，、一 關鍵詞：芳香氨基酸，含硫氨基酸，激光閃光光解，光敏化反應，激發(fā)三重態(tài)，自由 基，電子轉(zhuǎn)移，反應機理 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 內(nèi)容摘要 a b s t r a c t t h e p h o t o c h e m i c a lp r o c e s s e s o f o n e e l e c t r o n o x i d a t i o n ，p h o t o s e n s i t i z a t i o n a n d p h o t o i o n i z a t i o no f a r o m a t i ca m i n oa c i d s 、m e t h i o n i n ea n dt h e i rd i p e p t i d e st h e s eb i o m o l e c u l e s h a v eb e e ni n v e s t i g a t e di n a q u e o u ss o l u t i o n a tr o o mt e m p e r a t u r eu s i n gk r f ( 2 4 8 n m ) l a s e r f l a s hp h o t o l y s i s t h ei n t e r m e d i a t ep r o d u c e di nt h r e e p r o c e s sw e r eo b s e r v e db yt r a n s i e n t a b s o r p t i o ns p e c t r a , a n dk i n e t i cd a t ao f t h e s er e a c t i o nw e r eo b t a i n e d t h ee l e c t r o nt r a n s f e rw a s o b s e r v e di n o n e e l e c t r o n o x i d a t i o n ( s 0 4 “) ，p h o t o i o n i z a t i o na n dp h o t o i o n i z a t i o no fa r o m a t i c a m i n oa c i d sa n dm e t h i o n i n ea n dt h e i rd i p e p t i d e sr e s p e c t i v e l y t h ed e t a i lm e c h a n i s m so fo n e e l e c t r o n o x i d a t i o na n d p h o t o s e n s i t i z a t i o nm e c h a n i s m o f s u l p h u rc o n t a i n i n ga m i n oa c i d sw e r e p r o p o s e d t h em a i n r e s u l t sh a v eb e e no b t a i n e da sf o l l o w ： 1 s t u d y i n gt h er a d i c a l sf o r m a t i o np r o c e s so fa r o m a t i ca m i n oa c i d si n o n ee l e c t r o n o x i d a t i o n ( s 0 4 “) a n dp h o t o i o n i z a t i o n ，a n di n t r a m o l e c u l a re l e c t r o n t r a n s f e r t h a tt h e p r o c e s so fp h o t o i o n i z a t i o n ，o fa r o m a t i ca m i n oa c i da f f e c t e db yp h v a l u eo fs o l u t i o nw a s s t u d i e d i nm o d e lo fa r o m a t i ca m i n oa c i d sa n dt h es i m p l ep e p t i d e sw i t ha r o m a t i ca m i n oa c i d ， i n t r a m o l e c u l a re l e c t r o nt r a n s f e rw a ss t u d i e da l m o s tw i t hp u l s er a d i o l y s i st e c h n i q u e i nt h i s r e s e a r c h ，i tw a ss t u d i e d ，i nl a s e ri n d u c e do n ee l e c t r o no x i d a t i o n ( s 0 4 “) a n dp h o t o i o n i z a t i o n w i t hl a s e rp h o t o l y s i sr e s p e c t i v e l y ，t h ee l e c t r o nt r a n s f e ri nt r p n - t y r 呻t r p t y r o w a sa l l o b s e r v e d d i r e c t l y t h ep r o c e s s e so fp h o t o i o n i z a t i o no ft y r o s i n e ，t r y p t o p h a na r ea f f e c t e db yp h v a l u eo fs o l u t i o n ，a n dp h e n y l a l a n i n en o f u r t h e r m o r e ，t h ep he f f e c t so fp h o t o i o n i z a t i o no f t y r o s i n e ，t r y p t o p h a nr e s u l t i n gf r o mt h ed e p r o t o n a t i o no fp h e n o l i ch y d r o x y lg r o u p ， n ho f i n d o l er i n gr e s p e c t i v e l yi na l k a l i n es o l u t i o nh a v eb e e nd e m o n s t r a t e d 2 a tf i r s t t i m e ，t r i p l e t a c e t o n ei n d u c e dr a d i c a lt r a n s f o r m a t i o n ：t r p n - t y r - - - t r p t y r o w a so b s e r v e dd i r e c t l y i np r e s e n c eo fa c e t o n e ，f o r m a t i o no fe x c i t e dt r i p l e ts t a t e so ft r y p t o p h a nr e s i d u e sa n d i v 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文內(nèi)容摘要 r a d i c a l s ( 缸p n ) ，v i aat r i p l e t t r i p l e t ( t t ) e n e r g yt r a n s f e ra n d ae l e c t r o nt r a n s f e rr e s p e c t i v e l y , w e r eo b s e r v e di nc a s eo ft r p p h e ，t r p g l ya n d n - f o r m y l m e t t r p ，w h i l eo n l yp h e n o l i c h y d r o x yr a d i c a l ( t y r o ) ，v i aa e l e c t r o nt r a n s f e r , w a so b s e r v e di nc a s eo f p h e - t y rf u r t h e r m o r e ， t r i p l e ta c e t o n ei n d u c e d r a d i c a lt r a n s f o r m a t i o n ：t r p n 。一t y r 斗t r p t y r o 。w a so b s e r v e dd i r e c t l y , a n dt h et r a n s f o r m a t i o nr e s u l t i n gf r o mi n t r a m o l e c u l a re l e c t r o nt r a n s f e rw a s s u g g e s t e d 3 w i t hl a s e rp h o t o l y t i c a lt e c h n i q u e ，i nt h ep r o c e s so fo n ee l e c t r o no x i d a t i o n ( s 0 4 ) ， t h r e ek i n d so fs u l f u r - c o n t a i n i n gr a d i c a l sw e r eo b s e r v e d d i r e c t l y i nn e u t r a l a q u e o u s s o l u t i o n t h e p h o t o i n d u c e do x i d a t i o nr e a c t i o no fd - m e t h i o i n e ( m e t ) ，l m e t h i o i n e m e t h y le s t e ra n d m e t m e ta l a m e tn - f o r m y l m e t t r pd i p e p t i d e sb ys o a 。w a si n v e s t i g a t e du s i n g2 4 8 n ml a s e r p h o t o l y s i so fk 2 s 2 0 8a n da b s o r p t i o ns p e c t r u mm e t h o d t h ep r e s e n c eo f t h r e ee l e c t r o n - r a d i c a l c a t i o ni n t e r m e d i a t e s s s 】+ ，【s n 】+ a n d 【s 。o w e r eo b s e r v e db yt r a n s i e n ta b s o r p t i o n s p e c t r a t h ek i n e t i c s o fo x i d a t i v er e a c t i o nh a sb e e ni n v e s t i g a t e da n dk i n e t i c sc o n s t a n t so f o x i d a t i v er e a c t i o nd e t e r m i n e d t h er e s u l t sa r ec o m p a r e dt ot h o s eo fp u l s er a d i o l y s i s ad e t a i l o x i d a t i o nm e c h a n i s mo fs u l p h u rc o n t a i n i n ga m i n oa c i d sw a sp r o p o s e d t h es t r u c t u r eo f a m i n oa c i da n d p e p t i d ei n f l u e n c ei n f o r m a t i o no f t h r e e e l e c t r o nb o n dw a s s u g g e s t e d 4i np h o t o c h e m i c a lr e a c t i o no f4 - n i t r o q u i n o l i n e1 - o x i d e ( 4 n q o ) w i t hm e t h i o i n e ( m e t ) a n di t s d i p e p t i d e s ，p h o t o i n d u e e d e l e c t r o nt r a n s f e rf r o ma m i n oa c i d st o4 n q ow a s o b s e r v e dd i r e c t l y u t i l i z i n g4 - n i t r o q u i n o l i n ei o x i d e ( 4 n q o ) a sap h o t o s e n s i t i z e r , p h o t o c h e m i c a lr e a c t i o n s o f4 n q ow i t hm e t h i o i n e ( m e t ) ，m e t c o n t a i n i n gd i p e p t i d e s ( m e t m e t ，a l a m e t ，m e t - l u ea n d m e t g l y ) ，a n dm e t c o n t a i n i n gt r i p e p t i d e s ( m e t l u e - p h e ) w e r ei n v e s t i g a t e d f o r m a t i o n o f e x c i t e dt r i p l e ts t a t e so f4 n q oa n d4 n q o r a d i c a l ( 4 n q o h ) a n dm e tr a d i c a l ( 一a l k y t h i o a k y l a r a d i c a l ) w e r eo b s e r v e d t h ek i n e t i c so f r e a c t i o nh a sb e e ni n v e s t i g a t e da n dk i n e t i cp a r a m e t e r s o fr e a c t i o n sw e r ed e t e r m i n e d f u r t h e r m o r e ，t r i p l e tt 4 n q o + i n d u c e dae l e c t r o nt r a n s f e r p r o c e s s ( 4 n q o + c h s c h 3 時 4 n q o 卜一十s ( c h c h s 十c h 3 ) w a so b s e r v e dd i r e c t l ya tf i r s tt i m e ad e t a i lm e c h a n i s mo ft h ep h o t o c h e m i c a lr e a c t i o no f 4 v 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文內(nèi)容摘要 n i t r o q u i n o l i n e1 - o x i d e ( 4 n q o ) w i t hm e t h i o i n e ( m e t ) a n d i t sd i p e p t i d e sw a s s u g g e s t e d 5 t h e p r o c e s s e so fp h o t o i o n i z a t i o no f a r o m a t i ca m i n oa c i dw a ss t u d i e db yc h a n g e a b l e w a v e l e n g t hl a s e rp h o t o l y s i st e c h n i q u e ，t h er e d o xp o t e n t i a l so ft r y p t o p h a n ，t y r o s i n ea n d p h e n y l a l a n i n e w e r ed e t e r m i n e db yl a s e rp h o t o l y s i st e c h n i q u ea tf i r s tt i m e b e c a u s el a s e rw a v e l e n g t hw a sg e n e r a l l yf i x e di nl a s e rp h o t o l y s i st e c h n i q u e ，i tb e c a m e d i f f i c u l tt h a tt h er e d o xo fa r o m a t i ca m i n oa c i dw a sd e t e r m i n e db yt h i sl a s e rp h o t o l y s i s t e c h n i q u e i n t h i s w o r k ，a f t e rm o n op h o t o n i cp r o c e s s w a sp r o v e di n p h o t o i o n i z a t i o n o f a r o m a t i ca m i n oa c i d ，t h er e d o xp o t e n t i a l so ft r y p t o p h a n ，t y r o s i n ea n dp h e n y l a l a n i n ew e r e d e t e r m i n e db yc h a n g e a b l ew a v e l e n g t hl a s e rp h o t o l y s i st e c h n i q u ea tf i r s tt i m e k e y w o r d ： a r o m a t i ca m i n o a c i d s ，s u l p h u r - c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s ，l a s e r f l a s h p h o t o l y s i s ，p h o t o s e n s i t i z a t i o n ，p h o t o i o n i z a t i o n ，r a d i c a l ，e x c i t e dt r i p l e ts t a t e s ，t r a n s i e n t s p e c i e s ，e l e c t r o nt r a n s f e r , r e a c t i o nm e c h a n i s m v 1 報送博士學位論文簡況表 蠹采拇j 淪又逛蟊 芳絳拳勃姿、躲急采硌娃s 艄激蝴 作者姓名。 繡趣蕁 授予學位的 ，。c z 學籍、專整 躥缸務 作者單僦 呻、亂斜式鵂赫j 潞 地址 寢 瓣懶蝴 導師姓名 厶篡绔 專業(yè) 羧9 翟拶 技術職務 一 導拜單位 、中刪表繡鈿啤 地址 愛黼鐮橢裂鍛 t 論文隸屬學科分類號4 1 0 6 4 蒯一蒡輯瞧麓燃擁囊搠糍燃燃 論文文摘( 約4 0 0 - 5 0 0 亭，申文) 1f 、泌f 結拘巧 敏蠊艟，甲硫甄鏨酸及其藤作為研究塒黎，遠用磁先 旄解麟態(tài)躐救 j l r 臻研究c ：d f j 的i f ie 氧純?nèi)唐?，光敏純聶癍冪t 毫離過稷，分撬、喪挺了三辯過程t # 蹬；蜷冬產(chǎn)鐃。在穰“y i ，；7 終彖中分鍘觀察到默分予幽的瞧f 轉(zhuǎn)摶：褪出，單電子氧化反威， 二t 艘 ：短擅舳拋、：剁噬寸捷得枷府的動力學? 數(shù)。j ) 芳香瓴塾酸被單t l 于氧化( s ( “) 和圯 ”。，j 程中i - ib 憚l ：，戊j i 程f f t 值對芳番馘揍酸地哇l 離過程的影喊、二肽( t m - t y t j ，j ：“附電子轉(zhuǎn) 一“、荊激光莧斛的方法，托肇電予毓純( s 0 4 “j 過程t 沁蔣旅在中掛 ；。+ l 斑察到 i i ：p 圭三戚i 立爭爭鑫藏s i 于鍵自 n 德中蝴攙。3 j 簿敬獲取了4 w f 。嘲敏化鰳( 4 n q , v 0 蛾氮鏨艘及其銜- ：蜘豐f j 肽光敏化反成時，4 n ( 、1 f1 與甲硫瓴酸殘 2 xjl h = 轉(zhuǎn)移的直授j 幅，觀察到4 一硝鏨雌晰氧化物( 4 n q o ) - l j 禽硫氮基酸及其衍嫩物 川1 0 圮敞化成廊時生成烷蕊自洳基。4 ) 運j 霸司謫波妊激怒f t 覓解方法磅究芳香氨基酸 ： 、圪l 離迸襻，薄敬疆過壤巍兜蜒方法簸褥了照鑷酸，臻馥熬蜘苯魏氨黢鮑電離瞧垃。 論文在何時釋琵駐何釋方式發(fā)襲 獲褥學位毽期 ) 嬲7 f 報送日 9 。j 備注 期 收藏擎糟：_ 隸涮- 瑟誼( 中國嗣家熠l0 館) 。執(zhí)行鄙f j ：心內(nèi)資料組。 往i 一般府注明中國圖f s 資料分類法的婁號 2 為了文獻標引f ：作從涂丈中選墩出來埔班表示全文主禚內(nèi)容信意款韜煎舉i 司袋術沿?？?篇論文選取3 8 個詞作為芰鍵譎。為了萄際交濺，庵標注與中文霹趣豹英文莢鍵謁。 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 1 芳香氨基酸、含硫氨基酸及肽的光化學概述 第一章芳香氨基酸、含硫氨基酸、衍生物及肽的光化學概述 摘要：簡要介紹了芳香氨基酸和含硫氨基酸及其肽的化學結構、物理化學性質(zhì)及光化學 原理，回顧了它們光化學及激發(fā)態(tài)研究的發(fā)展歷史，提出了芳香氨基酸和含硫氨基酸及 其肽的光化學研究中有待解決的問題和工作的研究方向。 1 1 引言 生物分子的光化學主要是涉及蛋白質(zhì)、酶與核酸及其組分的光化學，是研究光生物 學的基礎。主要研究紫外光對它們的作用。蛋白質(zhì)與核酸的光化學是與光生物學的發(fā) 展聯(lián)系在一起的，并且已經(jīng)成為光生物學中的一個組成部分。推動蛋白質(zhì)與核酸光化 學發(fā)展的動力是分子生物學的興起和激光光解技術在化學領域中的廣泛應用l 。由于 人們對蛋白質(zhì)與核酸的結構及其在生物合成和在遺傳學中的作用有了進一步的了解，對 紫外光引起的這些生物大分子物質(zhì)的化學變化就有可能從分子水平找到理論根據(jù)。大 多數(shù)氨基酸對紫外和可見光是透明的。光化學感興趣的氨基酸有下列兩類，一類是芳 香氨基酸，一類是含硫氮基酸。這兩類氨基酸都是人體必需的，在人體代謝過程中起著 重要作用。對芳香氨基酸的研究主要集中在對光作用引起的芳香氨基酸的激發(fā)態(tài)，電子 轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)中個別色氨酸對蛋白質(zhì)總發(fā)光的貢獻，內(nèi)在和外在芳香氮基酸 的生色團所處的微環(huán)境及其溶劑的極性和弛豫的關系，蛋白質(zhì)發(fā)光的不均一性及其與結 構的關系等5 ?！薄?。通過上述的研究，可以提供生物大分子的構象以及大分子內(nèi)組份之間 的相互作用，以彌補x 射線晶體分析的不足，并最終可以闡明溶液狀態(tài)下的生物大分子 的構象。 芳香氨基酸生色團吸收紫外光引起的蛋白質(zhì)光化學事件中，有些分子水平的變化 會導致有害的生物效應。如引起細胞死亡，光致變異和光致癌等。氨基酸的光損傷除 直接吸收u v 輻射引起的損傷外，還通過光敏劑引起損傷。即通過光敏劑間接作用。 研究含硫氨基酸光化學的興趣主要在于對光作用引起的蛋白質(zhì)殘基含硫氨基酸的 損傷和損傷的傳遞。含硫氨基酸本身不直接吸收紫外光，而是通過光誘導的光敏劑的激 發(fā)三重態(tài)對其作用。含硫氨基酸在輻射損傷機理和輻射中的保護作用早就引起人們的注 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 a 芳香氨基酸、含硫氨基酸及肽的光化學概述 意，并進行了深入的研究。主要的研究手段是脈沖輻解和激光光解瞬態(tài)吸收光譜。 主要研究內(nèi)容為含氨硫基酸及肽光敏化氧化反應m 】。 、 最近，有關大氣臭氧層的研究報告指出，臭氧含量明顯減少，南極臭氧空洞正以 每年一個美國陸地面積的速度增大，使地面紫外光幅射增強，皮膚癌，黑色素瘤發(fā)病 率上升。因此，深入開展對蛋白質(zhì)，氨基酸的光化學和光物理、光生物效應等方面的 研究至關重要。 l2 芳香氨基酸的光化學 1 2 1 芳香氨基酸的結構與能級圖 在討論芳香氨基酸的光化學之前，簡要介紹一下芳香氨基酸的結構能級圖和紫外 吸收光譜。芳香氨基酸的特點是具有共軛結構，如苯環(huán)，苯酚和吲哚，都具有n 電子， 易于激發(fā)，是紫外特定的生色團。能吸收大于2 4 0n m 波長的紫外光，發(fā)射熒光m 訓a nm 1 7 8 一 二0 0 一 ：5 0 _ j= i 一 3 0 0 一 加0 6 0 0 0 一ili 1 0 0 1 0 吸收熒光磷光 卜p h e2 t y r3 - t r p4 t r ! 附j 禁戒躍遷 圖1 1 芳香氨基酸的能級圖 圖1 1 是芳香氨基酸的能級圖l ；圖l 一2 是芳香氨基酸的結構圖。 吼蹴 p h e n y l a l a n i n e ( p h e ) 苯丙氨酸 h 心吣篇刪 t y r o s i n e ( t y r ) 酪氨酸 一2 h ，c h c 0 0 h 。i n h ， h t r y p t o p h a n ( t r p ) 色氨酸 了n q 堡蘭竺! ：! 里型蘭墊查查蘭墮主笙莖以芳香氮基酸、含硫氨基酸及肽的光化學概述 竺二二二= = ：= 二= = = ：= = 竺竺：二竺竺 圖i 2 芳香氨基酸的分子結構 1 2 2 近紫外光輻射的激發(fā) h e r s h e n s o n ，w e t l a u f e r ，b r o w n 等人都對芳香氨基酸的紫外吸收光譜作了深入細致 的研究腳?！?。色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸的最長波長的電子躍遷在近紫外區(qū)。 圖l 一3 萋 霎 拿 萋 霎 寶 圖1 3 芳香氨基酸的紫外吸收光譜m 】：( a ) t y r ；( b ) p h e ；( c ) t r p 是芳香氨基酸的紫外吸收光譜1 3 1 。 苯丙氨酸在2 5 81 1 1 1 1 處有一弱吸收帶，t y r 吸收峰 的極大值分別出現(xiàn)在2 3 5n l n 與2 8 0 n m 左右。色氨酸在水溶液中的光譜的極大是在2 2 0 l l l n ，與2 8 0 n m 波長處，此外偏振研究的結果指出，在2 6 0 3 1 0 n m 范圍內(nèi)至少有兩個獨 立的電子躍遷分別與用自冶場方法計算預計在這個區(qū)域中存在兩個躍遷的結果一致1 2 6 1 ( 圖中看不出) 。 1 2 4 芳香氨基酸光化學研究概述 研究大致分三個階段，第一階段是7 0 年代以前。這個時期對氨基酸與蛋白質(zhì)光化 學研究不是用單色光，著重分析破壞后的光解產(chǎn)物如n h ，、c o ：與s 以及光譜特性。 3 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 a 芳香氨基酸、含硫氮基酸及肽的光化學概述 這種分析對紫外光輻射的生物學效應意義不大 2 2 ，2 7 m l ；第二階段是7 0 年代的工作，主 要用閃光光解技術進一步研究酶的失活機理及有關模型，當時提出的主要模型之一是 g r o s s w e i n e r 提出的酶的失活量子產(chǎn)率( a ) 決定于酶中主要的胱氨酸與色氨酸殘基的 光解 2 s - 3 1j ；第三階段是近年來開始的用脈沖激光研究一些芳香氨基酸與酶的作用，提出 芳香氨基酸紫外光光解的多通道學說，并研究其間發(fā)生的電子、能量轉(zhuǎn)移。激光光解 芳香氨基酸研究的體系分三個層次，芳香氨基酸：芳香氨基酸的二肽：取代的芳香氨 基酸( 磷?；膖 r p - t y r ) 和含芳香氨基酸的蛋白質(zhì)和酶( 胰蛋白酶、白蛋白等) 。研 究的手段有單光子光解和雙光子光解。研究的內(nèi)容包括光解機理，電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn) 移阻3 9 l 。 f 激光光解 b e n t 與h a y a o n 首先用四倍瀕y a g 激光器發(fā)出波長為2 6 6 n m ( 1 5n s ) 脈沖光激發(fā)， 3 t y r + j - 3t y r o + + e 函+ h ( 1 1 ) ( 12 ) 研究2 5 時的芳香氨基酸及肽的光化學【3 2 “i 。發(fā)現(xiàn)t y r 的光解是通過三重態(tài)( ，t y r * ) 雙光 子過程發(fā)生的【3 2 i ( ( 1 1 ) ( 12 ) 式) ，其它研究有報道單光子過程的【4 1 - 4 2 , 4 4 , 4 6 ，也有報道雙光 子過程的【4 3 , 4 5 。t y r 的光解瞬態(tài)吸收光譜表明，3 t y r 在2 5 0n m 。2 7 5n m 有強吸收3 5 0 n r n 吸收為酪氨酸陰離子自由基( 3 t y r 一0 + ) ， 大于6 0 0n r n 的是水合電子( e a q 。) 的吸收峰。含 有t r y 的蛋白質(zhì)光離解產(chǎn)生的水合電子可與氨基酸、肽鍵、二硫化物、含s h 氨基酸等 反應，并導致去氨基作用，電子轉(zhuǎn)移反應與鍵斷裂等，從而影響蛋白質(zhì)的構象和活力。 但由于儀器掃描的限制，沒有觀察到三重態(tài)的吸收峰。p h e 光解是經(jīng)三重態(tài)通過雙光子 過程發(fā)生的1 3 3 3 5 , 4 0 ，光解過程生成芐基和水合電子，瞬態(tài)吸收光譜表明吸收峰位于2 4 0 n m ，3 2 0n m 和6 0 0 r f f f l ，三重態(tài)壽命3 1 s ，oe 。q 為0 0 3 4 t r p 的光解機理比較復雜， 與介質(zhì)p h 有關，中性或堿性介質(zhì)中為單重態(tài)過程( ( 1 3 ) 式) ，酸性介質(zhì)中為三重態(tài)過程 5 ”o ( ( 1 4 ) 式) 。 中性或堿性介質(zhì)中的過程為： 哪 1 唧_ 呻+ e - a + h + ( 1 3 ) 鷺業(yè)平：中國科學技術大學博士論文a 芳香氨基酸、含硫氨基酸及肽的光化學概述 酸性介質(zhì)中的相應過程： t r p 吐，3 t r p _ t r p h + + e a q 2 t r p + f t r p ) 2 t r p + h 2 0 + t r p - h ( t r p - o h ) + o h ( h ) 哪+ 島_ t r p ：堅哪h + o h ( 1 4 ) ( 1 5 ) ( 1 6 ) ( 1 7 ) 4 5 0 4 6 0 r a n 為三重態(tài)吸收，3 3 0 h m 和5 3 0 r i m 為色氨酸自由基的吸收，水合電子e 。吸 收大于6 0 0 h m ，三重態(tài)壽命2 0 一4 5n s ，水合電子壽命與d h 值有關。 f 2 1 電子轉(zhuǎn)移 人們對氨基酸，肽鏈，蛋白質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移研究早在7 0 年代就已開始。p r u t z l a n d 為這個領域的創(chuàng)始人【4 7 - 5 4 ，b o b r o w s k i 等人1 5 5 - 6 0 】對氨基酸，肽鏈的電子轉(zhuǎn)移作出了大量 富有創(chuàng)造性的研究，尤其m a r c u s 【s i i 等人電子轉(zhuǎn)移理論的創(chuàng)立并獲得茹貝爾獎給氨基 酸、肽鏈、蛋白質(zhì)的研究注入強大生命力，研究經(jīng)久不衰。隨著時間分辨技術如脈沖 輻解，激光光解，e s r 等現(xiàn)代實驗技術不斷完善，為進一步深入研究丌劈了廣闊前景。 在實際研究中對芳香氨基酸的電子轉(zhuǎn)移運用較多的研究手段是脈沖輻解。p r u t z 和 l a n d i 】最早研究色氨酰酪氨酸二肽的電子轉(zhuǎn)移是由脈沖輻解產(chǎn)生的重氮離子作為引發(fā) t r p 一t y r o t _ t r p h t y r o ( 1 ，8 ) 5 1 0n m 4 0 5 n m 3 9 0 n m 劑。5 1 0 m n 是吲哚自由基的特征吸收峰，3 9 0n m 4 0 5n m 是酚氧自由基的特征吸收( ( 1 8 ) 式) 。電子轉(zhuǎn)移受t r p 和t ”的連接順序和在肽鏈中相隔距離等因素的影響。含t r p 和 t y r 二肽的電子轉(zhuǎn)移的速率按下列次序減少【6 2 】：( 數(shù)字為相對速率) d t r p h l t y r o h l t r p h l t y r o h c l t r p h l t y r o h l t y r o h l t r p h 1 2765 f a r a g g i l 6 2 - m 等人的研究表明t r p h 和t y r o h 在肽鏈中的連結次序影響電子轉(zhuǎn)移速 率。p r u t z i s 】等人的研究工作表明電子轉(zhuǎn)移速率隨溫度升高而增加。p r u t z 進一步研究 發(fā)現(xiàn)t m 和t v r 二肽可發(fā)生電子的逆向轉(zhuǎn)移】。近年來，對芳香氨基酸電子轉(zhuǎn)移研究 興趣集中在肽鏈的長度對電子轉(zhuǎn)移的影響。mf a r a g g i f 6 2 刪等人報道了長肽鏈的電子轉(zhuǎn) 十 徐業(yè)平：中國科學技術大學博士論文 1 芳香氨基酸、含硫氨基酸及肽的光化學概述 移速率常數(shù)與p h 的關系，并在含t r p 和t y r 的二肽中插入谷氨酸，賴氨酸，研究它們 的電子轉(zhuǎn)移反應?，F(xiàn)在研究最普遍的是在含t r p 和t y r 的二肽中插入脯氨酸。研究電 子轉(zhuǎn)移的速率與t r p 和t y r 分隔距離的依賴關系1 6 2 刪。 ( 3 ) 能量轉(zhuǎn)移 早在1 9 2 8 年w a r b u r g 與n e g e l e i n ( “刪就已證明，一氧化碳中毒的酵母血紅蛋白中 的芳香氨基酸吸收光能后，可引起血紅素連接的一氧化碳基團的斷裂【6 7 1 ，從對酶的失 活作用中看到，蛋白質(zhì)不同部位吸收光能后，可將能量遷移到失活的部位郵i 。對蛋白 質(zhì)的研究表明，一些發(fā)色團吸收光能后，可以引起不直接吸收光的另一些發(fā)色團中發(fā) 出熒光。蛋白質(zhì)熒光的偏振度往往可以證明在大分子中同一種發(fā)色團之間可發(fā)生能量 轉(zhuǎn)移。含有芳香氨基酸的二肽( 即摻入到肽中的芳香氨基酸) ，通過共振機制將激發(fā) 能轉(zhuǎn)移到其它發(fā)色團【6 ，在二肽t r p t y r 中測不出酪氨酸的熒光 6 9 - 7 0 i ，e d e l h o c h 等人認 為這是因為激發(fā)能從酪氨酸轉(zhuǎn)移到鄰近的色氨酸上1 7 0 1 。b u c h e r ”i ，v l a d i m i r o v 與 k o n e v l 7 “，k a r r e m a n 及其同事1 以及s t r y e r l 7 2 吩別討論過蛋白質(zhì)分子中的能量轉(zhuǎn)移。能 量轉(zhuǎn)移是從苯丙氨酸寸酪氨酸一色氨酸轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)按含t r p 和t y r 的情況分成a 與 b 兩類。a 類蛋白質(zhì)中含t y r 一種，b 類蛋白質(zhì)