（生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)論文）土壤耐cd2細(xì)菌分離、鑒定及生物吸附研究.pdf

西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第l 頁 摘要 我國土壤重金屬污染相當(dāng)嚴(yán)重。目前全國受c d 、c r 、p b 等重金屬污染的耕地面 積近2 0 0 0 萬h m 2 ，約占全國耕地的1 5 。全國每年因重金屬污染而減產(chǎn)糧食，直接經(jīng) 濟(jì)損失超過2 0 0 億元。由土壤重金屬污染引發(fā)的農(nóng)產(chǎn)品安全和人體健康事件也時(shí)有發(fā) 生，成為影響人類健康和社會(huì)穩(wěn)定的重要因素。土壤重金屬污染問題已經(jīng)引起了全世 界的關(guān)注。世界各國都非常重視污染土壤修復(fù)技術(shù)的研究，有關(guān)微生物修復(fù)技術(shù)的研 究更是備受關(guān)注。利用微生物作為治理重金屬污染的吸附劑，需要篩選和獲得高吸附 能力，并且兼具吸附選擇性的菌株。對菌株吸附性能和機(jī)理的研究，為化學(xué)和遺傳學(xué) 方法改造生物吸附劑提供了理論依據(jù)，也為工程菌的構(gòu)建提供了寶貴的原料。 本研究主要是從西昌礦區(qū)土壤中分離出對c d 2 + 有高耐受和高富集作用的8 株菌株， 通過生理、生化實(shí)驗(yàn)，1 6 sr d n a 分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行菌種的分類鑒定。對菌株吸 附重金屬c d 2 + 吸附能力做定量測定，同時(shí)測定菌株對其他金屬的耐受能力。最后對篩 選所得的細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒提取、酶切鑒定和質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)，目的對其耐受和1 及附重金屬 的機(jī)理有所研究。 主要研究結(jié)果： 從四川西昌某礦區(qū)土壤中篩選得到8 株能夠在液體培養(yǎng)基中耐c d 2 + 濃度在 4 0 0 m g l 以上，瓊脂平板上耐c d 7 + 濃度為8 0 0 - - 一1 5 0 0 m g l 的細(xì)菌。 對8 株菌株進(jìn)行生理、生化實(shí)驗(yàn)和1 6 sr d n a 鑒定，菌株確定均為惡臭假單胞 菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 。 菌株在含有少量c d ! + 條件下長勢好于不含c d ! + 的條件下生長。在c d 2 + 濃度為 2 5 m g l 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1 0 h 丌始進(jìn)入穩(wěn)定期，在而不含c d 2 + 的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，1 4 h 丌始進(jìn)入穩(wěn)定期。 8 株菌對c d 2 + 吸附能力不同，c d 5 對c d 2 + 的吸附率最高，為9 0 0 4 。吸附總 量2 7 0 m g ( 3 0 m 1 ) 。對照菌的吸附重量、吸附量和吸附率均為最低。 菌株除了對c d 2 + 有耐受性外，對p b “、z n “、c u “、n i “、m n 2 + 也有一定的 耐受能力，但普遍不高。低于對c d 7 + 的耐受性。 在8 株菌株中均提取到質(zhì)粒，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 關(guān)鍵詞：c d + ，惡臭假單胞菌，生物吸附，1 6 s r d n a ，重金屬 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1l 頁 曼曼皇魯皇置e 篁皇皇皇皇! ! 毫詈毫篁皇鼉詈詈詈詈詈詈置| 鼉| 置置鼉曼鼉曼曼詈皇詈皇詈曼葛i i l l i 皇量鼉詈| 舅皇置| 詈曼一 a b s t r a c t h e a v ym e t a lp o l l u t i o ni sas e r i o u sp r o b l e mi nc h i n a a tp r e s e n t ，t h ea r e ao fc u l t i v a t e d l a n dp o l l u t e db yc d ，c r , p ba n do t h e rh e a v ym e t a li sn e a r l y2 0m i l l i o nh m 2 ，a b o u t1 5 a r a b l el a n d d e c r e a s e dh a r v e s to fc r o p sb yh e a v ym e t a lp o l l u t i o nh a p p e n se a c hy e a r , t h e d i r e c te c o n o m i cl o s si sm o r et h a n2 0b i l l i o ny u a n a g r i c u l t u r a ls a f e t ya n dh e a l t he v e n t s c a u s e db yt h eh e a v ym e t a lp o l l u t i o no f t e no c c u r , i th a sb e c o m et h em o s ti m p o r t a n tf a c t o ro f h u m a nh e a l t ha n dt h es o c i a ls t a b i l i t y h e a v ym e t a lp o l l u t i o nh a sb e e nt h ew o r l d w i d ec o n c e r n e v e r yc o u n t r ya t t a c hg r e a ti m p o r t a n c et os t u d yc o n t a m i n a t e ds o i lr e m e d i a t i o na n dm i c r o b i a l r e m e d i a t i o nh a sb e e nt a k e nm o r en o t i c e t h e r ei sg r e a tn e e dt os c r e e na n df i n dm i c r o b i a l s t r a i n sw i t hh i g ha d s o r p t i o nc a p a c i t ya n ds e l e c t i v ea d s o r p t i o nf o rm i c r o b i a l a d s o r b e n t d e v e l o p m e n tf o rc o n t r o l l i n gh e a v ym e t a lp o l l u t i o nt h es t u d yo na b i l i t ya n dm e c h a n i s mo f a d s o r p t i o np r o v i d e si m p o r t a n tt h e o r ye v i d e n c ef o rt h ec h e m i c a la n dg e n e t i cm a n i p u l a t i o n so f b i o l o g i c a la d s o r b e n t ，a sw e l lm a t e r i a l sf o rt h ec o n s t r u c t i o no fe n g i n e e r e dm i c r o b e s 8h i g ht o l e r a n c ea n dh i g ha c c u m u l a t i o nb a c t e r i a ls t r a i n sw a ss c r e e n e da n di s o l a t e d f r o mt h es o i l so fm i n e si nx i c h a n g , s i c h u a np r o v i n c e ，i na d d i t i o nt ou s i n gp h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lm e t h o d s ，16 sr d n am o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e sh a db e e nu s e dt oi d e n t i f yt h e c l a s s i f i c a t i o na n ds t r a i n so fb a c t e r i a q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fa d s o r p t i o no ft h es t r a i n sf o r h e a v ym e t a l sc d “h a db e e nd o n e ，a sw e l lt h ed e t e r m i n a t i o no ft h et o l e r a n c et oo t h e rh e a v y m e t a l s f i n a l l y , p l a s m i dp r e p a r a t i o n ，r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dp l a s m i de l i m i n a t i o n e x p e r i m e n t sw a su s e dt os t u d yt h et o l e r a n c ea n da d s o r p t i o nm e c h a n i s mo fh e a v ym e t a l sb y t h e s ec d “r e s i s t a n ts t r a i n s m a i nr e s u l t s ： 1 t h e8s c r e e n e ds t r a i n sw a sa b l et og r o wa tc d 2 + c o n c e n t r a t i o no fa b o v e4 0 0 m g li n l i q u i dn u t r i e n tm e d i u ma n d8 0 0 12 0 0 m g lo na g a rp l a t e 2 t h e8s t r a i n sh a da l lb e e ni d e n t i f i e dt ob ep s e u d o m o n a s p u t i d a 3 t h es t r a i n sc o u l dg r o ww e l la tl o wc o n c e n t r a t i o no fc d “s t a t i o n a r yp h a s es t a r t so n 1 0 ho n2 5 m g lo fc d 2 + a n d1 4 ho n0 r n g lo fc d “ 4 t h e8s t r a i n sh a dd i f f e r e n ta d s o r p t i o na b i l i t i e so nc d “c d 5w a st h eh i g h e s tw i t h a d s o r p t i o nr a t eo f9 0 0 4 a n da d s o r b a n c eo f2 7 0 m g ( 3 0 m 1 ) t h ec o n t o ls t r a i n sw a st h e 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 ii 頁 l o w e s t 5 t h es t r a i n sw a sa l s ot o l e r a n tf o rp b 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 、m n 2 + h o w e v e rl o w e rt h a n c d “ 6 p l a s m i dc o u l db ee x t r a c t e df r o ma l lt h e8s t r a i n s ，t h ef u r t h e rs t u d yw a sn e e d e d k e yw o r d s ：c d 2 + ；p s e u d o m o n a sp u t i d a ；b i o s o r p t i o n ；1 6 s r d n a ；h e a v ym e t a l 西南交通大學(xué) 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并 向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授 權(quán)西南交通大學(xué)可以將本論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)掘庫進(jìn)行檢索，可以采用 影印、縮印或掃描等復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。 本學(xué)位論文屬于 1 保密口，在年解密后適用本授權(quán)書： 2 不保密使用本授權(quán)書。 ( 請?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“、”) 學(xué)位論文儲(chǔ)繇緩生 只期： 。氣9 指導(dǎo)老師簽名： 只期：私轡b 咖。 西南交通大學(xué)碩士學(xué)位論文主要工作( 貢獻(xiàn)) 聲明 本人在學(xué)位論文中所做的主要工作或貢獻(xiàn)如下： 1 從西昌礦區(qū)土壤中篩選出8 株對重金屬c d 2 + 有高耐受性的菌株。分別可在c d 。2 + 濃度為8 0 0 、1 0 0 0 、1 5 0 0 m g l 的l b 固體培養(yǎng)基上生長。 2 通過生理生化實(shí)驗(yàn)測定以及1 6 sr d n a 分子生物學(xué)技術(shù)對8 株高耐c d 2 + 的菌株進(jìn) 行菌種分類鑒定。結(jié)論得出8 株菌株均為惡臭假單胞菌。 3 利用a a s 原子吸收方法對高耐c d 2 + 菌株的金屬吸附能力進(jìn)行定量測定，8 株菌 株對c d + 的吸附性均較高。其中菌株c d 5 吸附率達(dá)到9 0 。 4 在8 株高耐c d 2 + 的菌株中均提取到了質(zhì)粒，為進(jìn)一步的細(xì)菌耐受重金屬的機(jī)理 研究提供了重要基礎(chǔ)。 本研究所篩選獲得的重會(huì)屬c d 2 + 高耐受和高富集的惡臭假單胞菌，可望作為環(huán)境 重金屬污染的細(xì)菌生物吸附劑，同時(shí)也可為工程菌的改造提供寶貴的材料。 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作所得的成 果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰 寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中作了明確說明。 本人完全了解違反上述聲明所引起的一切法律責(zé)任將由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 氣救 紉吆夕 r 期：如f 口。6 、釤 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 頁 第1 章緒論 1 1 課題的研究背景和目的 1 1 1 課題研究背景 金屬c d 在自然界中與z n 大量共存在各種天然礦藏中，其污染主要是由于礦業(yè)開 采和磷酸鹽的化肥開發(fā)與使用造成的。目前農(nóng)業(yè)中采用的c d 磷酸鹽施肥以及工業(yè)中 c d 的開采和使用，將c d 從自然環(huán)境中純化出來，并通過農(nóng)業(yè)和工業(yè)的廢水進(jìn)入人類 的生存環(huán)境中。重金屬由于在土壤中移動(dòng)性差，而且很難被自然降解，造成土壤質(zhì)量 下降，水環(huán)境惡化。長期滯留在土壤中的后果就是被植物吸收，通過食物鏈的積累損 害人類健康i 。c d 是公認(rèn)的三大有毒會(huì)屬之一，c d 在自然界中以化合物形式存在，其 中有毒的化合物種類繁多，例如c d s ，c d c l 2 ，c d ( o h ) 2 ，( c h 3 c o o ) 2 c d 3 h 2 0 ， 3 c d s 0 4 8 h 2 0 ，c d ( n 0 3 ) 2 4 h 2 0 ，c 2 c d n 2 ，c d b r 2 ，c d l 2 ，c d s e 等。而大多數(shù)的c d 化 合物都溶于水，這使得金屬c d 可以非常容易混入人的吸收途徑從而對人體造成危害1 2 j 。 由于c d 并不是人體需要的元素，而攝入定量或者過量的c d 金屬對身體損害很大：低 劑量的c d 可以引起。腎衰竭、骨礦密度降低、鈣排泄增加及生殖等毒性，高劑量的c d 可引起腎、肺、肝、骨、生殖效應(yīng)及癌癥等嚴(yán)重疾病1 3 j 。首次的臨床c d 中毒報(bào)道見1 8 5 8 年一接觸碳酸c d 粉末的工人出現(xiàn)急性的腸胃和呼吸癥狀i 訓(xùn)，a l s b e r g 和s c h w a r t z e 通過 對動(dòng)物的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)確定了多種c d 中毒的臨床特征，并報(bào)道了不同脊椎動(dòng)物如鳥 類和狗的c d 中毒后形態(tài)變化，p r o d a n 將貓暴露在c d 毒性氣體中2 4 小時(shí)后發(fā)現(xiàn)貓的 肝、肺和腎中均出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷。類似的癥狀在后面的研究中不被發(fā)現(xiàn)。1 9 4 0 年報(bào)道 食物和飲水中的c d 中毒，導(dǎo)致中毒者出現(xiàn)急性的腸胃癥狀，f r i b e r g 于1 9 4 8 年詳細(xì)的 報(bào)道了c d 重污染環(huán)境中工人出現(xiàn)的中毒癥狀，報(bào)告中詳細(xì)的描述了尿蛋白和肺氣腫癥 狀特征，其在后期的研究中將兔子暴露在c d 毒性化合物氣體和金屬粉塵中發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物 體內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺氣腫和尿道炎，通過每天注射放射性的c d 硫酸鹽發(fā)現(xiàn)，在2 個(gè)月的 時(shí)間中僅有微量的c d 被自然排泄出體外，同時(shí)蛋白尿癥狀在此期i 日j 增長了5 0 倍。r 本典型的痛痛病就是由于c d 金屬中毒引起的一種骨疼病，x 光掃描發(fā)現(xiàn)患者的長骨具 有明顯的骨軟化特征而其他部位的骨頭如脊柱等也有問題，生物化學(xué)方法檢測出骨軟 化會(huì)導(dǎo)致血清中堿性磷酸酶和c d 磷酸鹽濃度增加。如此可見金屬c d 對人體具有非常 嚴(yán)重的危害，必須對c d 污染進(jìn)行治理。 重會(huì)屬污染的危害越來越得到世界各國的重視，目前治理主要可分為三類：工程治 理、物恥化學(xué)治理和塵物治王里l5 1 。工程處理本質(zhì)足將重金屬集中起來，或?qū)⑵鋸囊粋€(gè)介 質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一介質(zhì)，稀釋或者固化。通過客土、換土和深耕翻上與污土混合，可以降 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第2 頁 低土壤中重金屬的濃度，減少重金屬對動(dòng)植物產(chǎn)生的毒害嶧l 。工程處理重金屬可以緩解 污染并在短時(shí)問內(nèi)降低重金屬污染的危害，但是并沒有減少在土壤中重金屬的總量， 屬于治標(biāo)不治本，即使經(jīng)過治理但仍然具有潛在的危害，而且工程處理工程量非常大、 處理費(fèi)用也很昂貴1 7 1 。另外處理后的土壤土質(zhì)和肥力容易下降，并且很容易受p h 值等 環(huán)境因素的影響導(dǎo)致殘留的重金屬活性增大。所以并不是一種經(jīng)濟(jì)，高效，永久性的 處理方法【8 1 。 美國是最早進(jìn)行化學(xué)物理治理重金屬污染并成功產(chǎn)業(yè)化的國家，早期的方法都要 用到螫合劑，通過添加合成的螯合劑如e d t a 可以增加重金屬的溶解度和生物利用度。 螫合劑的分子結(jié)構(gòu)能與特定的重金屬形成多種配位鍵提高重金屬在土壤中液相濃度從 而增強(qiáng)其流動(dòng)性1 9 j 。由于有些金屬離子能與土壤形成很強(qiáng)的鍵，因此必須使用如e d t a 鈉鹽這樣的強(qiáng)力螫合劑，然而這樣的處理方法不僅需要大量昂貴的化學(xué)螯合劑以及設(shè) 備，而且對技術(shù)的要求很高。經(jīng)物理化學(xué)治理后也很容易產(chǎn)生化學(xué)污染，從而問接的 影響地下水和土壤的質(zhì)量。例如土壤中鐵和鈣元素在噴灑e d t a 后由于其在土壤中的濃 度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目標(biāo)重金屬，使之很容易與e d t a 結(jié)合從而越弱螫合劑結(jié)合重會(huì)屬的作用 。據(jù)報(bào)道e d t a 使用后螯合劑對土壤中c u 、p b 和z n 的結(jié)合量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于植物在土壤 中的吸收量，這使螫合劑的使用得不償失。因此采用對環(huán)境有毒，選擇性不高而且昂 貴的物理化學(xué)處理方法不如考慮更為環(huán)保經(jīng)濟(jì)措施，這樣可以避免采用的螯合劑對人 體造成新的損害1 1 1 j 。 由于化學(xué)和物理在重會(huì)屬的實(shí)際處理中存在種種的缺點(diǎn)，綠色的生物治理也越來 越多的被人們采用。動(dòng)物治理方面主要是利川蚯蚓，蚯蚓是重要的土壤有機(jī)生物之一， 在提高土壤質(zhì)量方面具有不可替代的地位。它們通過進(jìn)食、挖洞、排泄以及新陳代謝 等作用使得土質(zhì)和營養(yǎng)成分都得到提高。帶有c o o h 和c o 等官能團(tuán)化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生 和析出有利于酸化土壤并激活種重金屬，幾種膠狀物質(zhì)能軟化土壤并與重金屬離子發(fā) 生螫合作用。然而相對微生物來說由于其針對性較弱作用面較小，其處理金屬離子的 效果既不顯著也不穩(wěn)定。根據(jù)b a k e r 等人的研究，經(jīng)過蚯蚓在土壤中的活動(dòng)后p h 值降 低了o 7 0 9 ，如果土壤是酸性的紅土p h 值僅降低0 0 3 0 1 8 ，而砂土經(jīng)過處理后其p h 的降低幅度很大1 1 2 l 。這樣來說蚯蚓對土壤中金屬的效果過于依賴土壤的條件，而不能 對其中的重會(huì)屬進(jìn)行迅速而徹底的清除。 植物修復(fù)是通過植物吸收累積某種重金屬，利用植物以及相關(guān)的微生物共存體系 作用來清理土壤中重金屬的方法。根據(jù)其作用機(jī)理可以將植物修復(fù)分三類：植物吸收、 植物揮發(fā)和植物穩(wěn)定。植物的吸收是通過特定的植物吸收對應(yīng)的重會(huì)屬減少土壤的重 金屬含量從幣j 達(dá)到重金屬的去除和回收；植物的穩(wěn)定利用特殊植物將重金屬鈍化一般 是絡(luò)合螫合等作用，降低其生物利用性及流動(dòng)性，使其不能為其他的植物所利用?？赏?過植物的根內(nèi)部的吸收和富集、根表嘶的吸附、根附近土壤中鈍化沉淀三種方式進(jìn)行， 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第3 頁 無論何種方法都是通過激活或者降低土壤中重會(huì)屬來實(shí)現(xiàn)。植物對重金屬的作用有以 下幾個(gè)方面：與重會(huì)屬發(fā)生螫合作用，形成重金屬螯合物分子；植物根部通過專性原 生質(zhì)膜結(jié)合重金屬，使之發(fā)生還原反應(yīng)；根部釋放質(zhì)子來酸化土壤激活重金屬?，F(xiàn)在 使用最為廣泛的植物超富集吸附就是植物能通過土壤的中的根系對重金屬產(chǎn)生富集 作，幾種特殊的質(zhì)子從根部放出使得土壤酸化，激活重金屬并提高其生物吸收的活性 【1 3 l 。整個(gè)作用過程最關(guān)鍵有三個(gè)因素：a 傳遞蛋白，帶有特殊結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)能將金 屬離子從胞外轉(zhuǎn)移到包內(nèi)，l a s a t 發(fā)現(xiàn)一種植物中的z n 轉(zhuǎn)移蛋白能特異吸附z n 離子將其 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)【1 4 】。b 生物螯合劑，作用機(jī)理同螯合劑e d t a ，有些植物能排放出物質(zhì)與 重金屬產(chǎn)生螯合作用。c 有機(jī)酸，同生物螫合劑幾種植物產(chǎn)生的有機(jī)酸能加速根部對重 金屬的吸收作用。 微生物雖然不能直接的降解和破壞重金屬，但微生物種類繁多具有多種特異的生 物活性和生物功能：如細(xì)胞代謝、表面生物大分子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、生物吸附、空泡吞飲、 沉淀和氧化還原反應(yīng)等，這些功能能針對不同的重金屬化學(xué)或物理特性與重金屬發(fā)生 反應(yīng)，影響重會(huì)屬形態(tài)改變其在環(huán)境中的遷移與轉(zhuǎn)化方式達(dá)到除去蕈金屬的作用【i 副。 真菌如曲霉、毛霉、青霉、根霉等對重金屬都具有良好的吸附作用i l 引。一些藻類如動(dòng) 膠菌、藍(lán)細(xì)菌、硫酸還原菌等，能夠在胞外產(chǎn)生聚合物與重金屬離子形成絡(luò)合物，使 重金屬失去活性1 1 7 j 。細(xì)菌如氧化硫硫桿菌、硫酸鹽還原菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單 胞萵等對重金屬都有很好的吸附作用，表1 1 列出了一些細(xì)菌對不同金屬的吸附能力。 微生物在修復(fù)被重金屬污染的土壤方面具有獨(dú)特作用例如微生物可以改變根部周圍的 微環(huán)境，根據(jù)不同的機(jī)理提高植物對重金屬的吸收，揮發(fā)或固定效率i l 引。不同微生物活性 及機(jī)理不同使得微生物治理重金屬手段靈活多變，工程菌的改造更為此類方法提供了 產(chǎn)業(yè)化的前景。 化學(xué)物理治理和動(dòng)植物治理在除去重金屬上均有著各自的不足，化學(xué)物理治理成 本過高且容易形成二次污染、動(dòng)植物治理受制與環(huán)境的條件而且周期長治理也不徹底。 相比較而占微生物治理不但能達(dá)到較好的效果而且克服了化學(xué)物理治理和動(dòng)植物治理 的不足，具有很好的前景。 表1 - 1 對金屬有吸附作川的細(xì)菌 t a b l e l 1b a c t e r i a lb i o m a s su s e df o rm e t a lr e m o v a l 微生物金屬 吸附能力( m g g ) 參考文獻(xiàn) p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s t h ，u 1 5 ，6 t s e z o sa n dv o l e s k y ( 1 9 8 1 ) 1 1 9 i p s e u d o m o n a ss p un ap o n sa n df u s t e ( 19 9 3 ) 1 2 0 i o c h r o b a c t r u ma n t h r o p i c r , c d c u n ao z d e m i re la 1 ( 2 0 0 3 ) 1 2 1 l t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sz n8 2b a i l l e te ta 1 ( 1 9 9 8 ) 1 2 2 1 c rn a c e l a y ae ta i ( 2 0 0 0 ) f 1 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第4 頁 微生物 金屬 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s c d ，z n o c i m u mb a s i l i c i u m c r s p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i s c d b a c i l l u sf i r m u s p b ，c u ，z n b c o a g u l a n sc r ( v 1 ) b m e g a t e r i u mc r ( v i ) z o o g l o e ar a m i g e r ac r ( v 1 ) c u ， s t r e p t o m y c e sn o u r s e i c d ，c u ，n i p b ，z n ，a g ， c r p b 吸附能力( r a g g ) n a n a n a 4 6 7 ，3 8 1 ，4 1 8 3 9 9 3 0 7 2 2 9 3 4 ，9 ，0 8 3 6 ，1 6 ，3 8 1 8 ，5 5 參考文獻(xiàn) p l e t t ee ta 1 ( 1 9 9 6 ) 2 4 i m e l oa n dd s o u z a ( 2 0 0 4 ) 1 2 5 1 t a n g a r o m s u ke ta 1 ( 2 0 0 2 ) 1 2 6 1 s a l e h i z a d e he ta 1 ( 2 0 0 3 ) 2 7 1 s r i n a t he ta 1 ( 2 0 0 2 ) 1 2 8 i s r i n a t he ta 1 ( 2 0 0 2 ) n o u r b a k h s he ta 1 ( 1 9 9 4 ) 1 剴 a k s ue ta 1 ( 1 9 9 2 ) 3 0 i m a t t u s c h k aa n ds t r a u b e 3 1 1 m a t t u s c h k aa n ds t r a u b e ( 19 9 3 ) m a t t u s c h k aa n ds t r a u b e ( 1 9 9 3 ) s 1 0 n g w o o d e n s i s p b ，u1 0 0 ，4 4 0 f r i i sa n dm y e r s k e i t h l 3 2 l s r i m o s u s z n3 0m a m e r ie ta 1 ( 19 9 9 ) 1 3 3 1 1 1 2 課題研究目的 從西昌礦區(qū)周邊土壤中采集土樣，篩選高耐c d l + 細(xì)菌，利用原子吸收分光光度法 測定耐c d 2 + 菌株的c d 2 + 吸附能力，對篩選得到的細(xì)茼通過生理生化實(shí)驗(yàn)以及1 6 s r d n a 的方法鑒定菌種種屬分類地位。通過對篩選出的耐受菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，以及質(zhì)粒消除 實(shí)驗(yàn)，目的明確其耐c d 2 + 機(jī)理。期望得到若干株c d n 高耐受、高富集細(xì)菌，以用于環(huán) 境重會(huì)屬污染治理以及工程菌的構(gòu)建等，并為進(jìn)一步的基兇工程改造提供理論依據(jù)。 1 2 課題的研究內(nèi)容和意義 1 2 1 課題研究內(nèi)容 本研究通過c d 2 + 濃度梯度培養(yǎng)基，從西昌礦區(qū)土壤中篩選得到對c d 2 + 高耐受的菌 株。利用生理、生化試驗(yàn)檢驗(yàn)和1 6 s r d n a 分子生物學(xué)方法鑒定菌株的種屬。并利用原 子i 吸收分光光度計(jì)測定其對c d 2 + 的吸附能力。檢測微生物是否還有耐c d 2 + 質(zhì)粒，并通 過質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)確定質(zhì)粒對該微生物耐c d 2 + 性的影響。本研究為構(gòu)建基因工程菌提供 宿主菌，生物吸附劑工業(yè)化發(fā)展提供了材料和理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容包括：高耐c d 2 + 細(xì)菌的篩選，生理生化鑒定，1 6 s r d n a 鑒定，對c d 2 + 吸附性的定量測定，質(zhì)粒提取、 酶切、消除，初步確定耐c d 2 + 機(jī)理等。 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第5 頁 1 2 2 課題研究意義 隨著世界各國城市發(fā)展以及對各種工業(yè)化產(chǎn)品的需求增加導(dǎo)致礦產(chǎn)開發(fā)、污染類工 業(yè)快速擴(kuò)張以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中采用的化肥等化學(xué)品種類和數(shù)量的增加，重金屬污染r 益 嚴(yán)峻，特別是通過各種渠道進(jìn)入土壤后，為人類社會(huì)造成了巨大的危害和隱患。本研 究從西昌礦區(qū)周邊的土壤中篩選出了具有對c d 2 + 高耐受、高富集的菌株，能為今后構(gòu) 建特定和高效的基因工程微生物奠定良好基礎(chǔ)，為利用微生物進(jìn)行c d 2 + 污染的修復(fù)奠 定基礎(chǔ)。 1 3 論文主要內(nèi)容和組織 本文分為三章，按如下的結(jié)構(gòu)組織 第一章為緒論，介紹了論文的研究背景、研究目的和論文的主要內(nèi)容以及重金屬 污染治理的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀。 第二、三章分別為重金屬c d 2 + 高耐受細(xì)菌的分離和篩選、生理生化鑒定和1 6 s r d n a 鑒定，以及重金屬吸附能力的定量和定性檢測。對菌株質(zhì)粒的提取、消除實(shí)驗(yàn)以及酶 切鑒定。并對結(jié)果進(jìn)行分析與討論，得出初步結(jié)論。 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第6 頁 第2 章土壤耐c d 2 + 細(xì)菌分離、鑒定及吸附研究 2 1 實(shí)驗(yàn)材料 2 1 1 主要儀器 超低溫( 7 0 ) 冰箱：基因公司 普通冰箱：海爾公司 w p 7 0 0 ( 2 1 ) 型微波爐：g a l a n z 公司 d 3 5 2 0 中型低溫離心機(jī)：k e n d r o 公司 大型低溫離心機(jī)：h i m a cc r2 2 gh i g h - s p e e dr e f r i g e r a t e dc e n t r i f u g e ，日本 東芝株式會(huì)社出品 d n p 9 0 8 2 型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 z d p 1 5 0 型恒溫?fù)u床：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 s i m f 1 2 4 型制冰機(jī)：s a n y o 公司 h h s 4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇金城田勝實(shí)驗(yàn)儀器廠 d s x 2 8 0 a 不銹鋼手提式滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠 e p p e n d o r f 移液器：f i n n p i p e t t e 公司 d y c 3 1 a 型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京市六一儀器廠 凝膠成像系統(tǒng)( b i oi m a g i n gs y s t e m ) ：基因公司 s w - c j 2 f 型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 0 2 m l p c r 管、1 5 m l e p 管、l m l 藍(lán)色槍頭、2 0 0 d 黃色槍頭、1 吮l 白色槍 頭，均無r n a 酶：購自a x y g e n 電子天平：成都倍賽克儀器儀表研究所 p c r 儀：b i o r a d 分光廣度儀：型號(hào)7 3 1 型，上海精密 2 1 2 主要試劑 蠟狀芽孢桿菌：購自微生物菌種保藏中心 p c r 引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 、胰蛋白胨( t r y t o n e ) ：購自o x i o d 公司 t r i sb a s e ：購自s i g m a 公司 限制性內(nèi)切晦：購自t a k a r a 公司 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 第7 頁 t a q 酶、d n t p ：購自t a k a r a 公司 質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：購自o m e g a g o l d v i e w 、g r e e n v i e w 核酸染料：購自賽百盛基因技術(shù)有限公司 其他所用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純 2 1 3 主要試劑配制 l b 液體培養(yǎng)基( 1 l ) ： 蛋白胨1 0 0 9 、酵母提取物5 0 9 、n a c i1 0 0 9 ，溶于8 0 0 m l 超純水中，定 容至1 0 0 0 m l ，用n a o h 調(diào)p h 至7 0 ，高壓蒸汽滅菌，4 c 保存。 l b 固體培養(yǎng)基( 1 l ) - 蛋白胨1 0 o g 、酵母提取物5 o g 、n a c i1 0 o g ，溶于8 0 0 m l 超純水中，定 容至1 0 0 0 m l ，用n a o h 調(diào)p h 至7 0 ，分裝成1 0 0 m l ，每1 0 0 m l 添加1 5 9 瓊脂粉，高壓蒸汽滅菌，4 。c 保存。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 蛋白胨1 0 0 、牛肉膏3 0 9 、n a c i5 0 9 ，溶于8 0 0 m l 超純水中，定容至 1 0 0 0 m l ，用n a o h 調(diào)p h 至7 0 ，高壓蒸氣滅菌，4 。c 保存。 硝酸鹽還原培養(yǎng)基 蛋白胨1 0 0 9 、n a c l5 o g 、k n 0 31 - 2 9 、溶于8 0 0 m l 超純水中，定容至1 0 0 0 m l ， 用n a o h 調(diào)p h 至7 4 ，高壓蒸氣滅菌，4 。c 保存。 n i 2 + 儲(chǔ)存液( 1 0 9 l ) ： 稱敢n i s 0 4 6 h ：o4 4 7 9 9 ，溶于8 0 m l 超t , e t g e e ，定容至1 0 0 m l ，過濾除菌， 室溫保存。 c u 2 + 儲(chǔ)存液( r a g l ) - 稱取c u s 0 4 5 h ：o3 9 2 9 9 ，溶于8 0 m l 超純水中，定容至1 0 0 m l ，過濾除菌， 室溫保存。 z n 2 + 儲(chǔ)存 液0 0 9 l ) ： 稱取z n s 0 4 6 h 2 04 3 9 8 9 ，溶于8 0 m l 超純水中，定容至1 0 0 m l ，過濾除菌， 室溫保存。 m n + 儲(chǔ)存液( 1 0 l ) ： 稱取m n c l 2 4 h 2 03 6 0 2 9 ，溶于8 0 m l 超純水中，定容至1 0 0 m l ，過濾除菌， 室溫保存。 c d 7 + 儲(chǔ)存液( 4 0 9 l ) ： 稱取3 c d s 0 4 8 h ! o9 1 2 9 9 ，溶f8 0 m l 超純水中，定容至1 0 0 m l ，過濾除菌， 室溫f 泉存。 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第8 頁 l b c d 2 + 平板： 蛋白胨1 0 9 、酵母提取物5 9 、n a c i1 0 9 ，溶于8 0 0 m l 超純水中，定容至 1 0 0 0 m i ，用n a o h 調(diào)p h 至7 o ，分裝成1 0 0 m l ，每1 0 0 m l 添加1 5 9 瓊脂粉， 高壓蒸汽滅菌，當(dāng)溫度降至7 0 每1 0 0 m l 加入適當(dāng)體積的c d 2 + 儲(chǔ)存液 ( 5 0 9 l ) ，使其終濃度達(dá)到目的濃度，倒平板，4 c 保存。 5 x t b e 儲(chǔ)存液： 4 4 5 m mt r i s 堿( p h 7 5 ) 、4 4 5 m m 硼酸和1 0 m me d t a ，超純水定容，室 溫保存。 加樣緩沖液( 6 x ) ： 甘油3 0 ，溴酚藍(lán)0 1 2 ，二甲苯青藍(lán)0 1 2 ，室溫保存。 1 0 s d s ： 在9 0 m i 超純水總?cè)芙? 0 9 電泳級(jí)s d s ，加熱至6 8 。c 助溶，加入幾滴濃鹽 酸調(diào)節(jié)p h 至7 2 ，定容至1 0 0 m l ，分裝備用。 n a c l 溶液( 5 m o l l ) ： 稱取n a c i2 9 2 2 9 ，溶于8 0 m l 超純水中，定容至1 0 0 m l ，高壓蒸汽滅菌， 室溫保存。 溶菌酶( 5 0 m g f m l ) ： 稱取5 0 m g 溶菌酶粉劑溶于l m l1 0 m mt r i s c l ( p h 8 0 ) ，得到5 0 m g m l 溶菌 酶溶液。 1m t r i s 堿( p h 8 0 ) ： 1 2 1 1 9 t r i s 堿溶于8 0 m l 超存水，h c i 調(diào)p h 至8 o ，超純水定容至1 0 0 m l ， 高壓蒸汽滅菌，室溫保存。 0 5 me d t a ( p h 8 0 ) ： 1 8 6 1 9e d t a 溶于8 0 m l 超純水，n a o h 調(diào)p h 至8 0 ( 約需l gn a o h 顆粒) ， 超純水定容至1 0 0 m l ，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。 t e ( p h 8 0 ) ： 1 0 m mt r i s 堿( p h 8 0 ) ，l m me d t a ( p h 8 0 ) ，超純水定容，高壓蒸汽滅菌， 室溫保存。 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第9 頁 2 2 實(shí)驗(yàn)方法 2 2 1c d 2 + 高耐受菌株的篩選 2 2 1 1 耐c d 2 + 菌株的分離 1 、從四川省西昌市某礦區(qū)采取土壤樣品，稱取l o g 加入到1 0 0 m l 的l b 培養(yǎng)基中，劇 烈震蕩以打散土壤。 2 、吸取上述土壤混懸液l o o p l ，在不同重金屬c d 2 + 濃度的培養(yǎng)基平板上涂布，倒置 平板于3 0 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至單菌落長出。 3 、挑選在高濃度c d “平板上長勢較好的單菌落，在l o o m g lc d 2 + 的l b 平板上劃 線純化，將純化的菌種放入4 冰箱中保存?zhèn)溆谩?2 2 1 2 耐c d ! + 菌株的篩選 1 、從分離得到的菌種平板上挑取單克隆于3 m l3 0 m g lc d “的l b 液體培養(yǎng)基中， 3 0 ，2 0 0 r p m 震蕩過夜培養(yǎng)。 2 、依次按2 的接種量，接種到c d 2 + 濃度遞增的l b 液體培養(yǎng)基中3 0 。c ，2 0 0 r p m 震蕩培養(yǎng)。 3 、選取能夠在4 0 0 m g l 以上c d 2 + 濃度的l b 培養(yǎng)基中生長的菌株，在1 0 0 m g lc d 2 + 的l b 平板上劃線純化，將純化的菌種放入4 c 冰箱中保存?zhèn)溆谩?2 2 1 3 耐c d 2 + 菌株的保存 1 、在3 0 m g lc d 2 + 的l b 平板上挑取單克隆于3 m ll o o m g lc d 2 + 的l b 液體培養(yǎng)基 中，3 0 ，2 0 0 r p m 震蕩培養(yǎng)。 2 、當(dāng)o d 6 0 0 達(dá)到o 4 加6 時(shí)，吸取5 0 ( 0 1 菌液加入到1 5 m le p 管中。 3 、加入等體積的3 0 甘油，混勻。 4 、在液氮中速凍2 - 3 m i n ，7 0 保存。 2 2 2 高耐受菌株生理生化鑒定 2 2 2 1 革蘭氏染色 1 、染色劑： a 結(jié)品紫液：甲液，結(jié)品紫2 0 9 、乙醇( 9 5 ) 2 0 m l ：乙液：草酸按0 8 9 ，蒸餾水 8 0 m l 。將 卡l 、乙兩液混合，靜置于不透氣棕色瓶中，4 8 h 后使j j 。 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 0 頁 b 碘：碘1 0 小碘化鉀( k i ) 2 0 9 ，蒸餾水3 0 0 m l 。先將碘化鉀( k i ) 溶于少量蒸 餾水( 3 5 m 1 ) 中，再放入碘，溶時(shí)可稍加熱，待碘全溶后加水至3 0 0 m l 。此溶液穩(wěn)定， 在不透氣的棕色瓶中保存。 c 脫色液：9 5 的乙醇。d 復(fù)染液：即0 5 番紅( s a f r a n i n ) 水溶液。取2 5 番紅( 又 稱沙黃) 的酒精溶液2 0 m l ，蒸餾水混溶。 2 、用具：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、蒸餾水、吸水紙。 3 、染色觀察：a 涂片：取一張干凈載玻片于其中央滴一滴蒸餾水，按無菌操作用接 種環(huán)挑取已培養(yǎng)好的菌株少許于水滴中，調(diào)勻并涂成l c m 2 的薄層； b 干燥：涂片最好在室溫中干燥。也可手持載玻片一端，小心地在酒精燈上放微微 加熱，讓水分蒸發(fā)，但切勿直接將玻片在火焰上加熱，以防標(biāo)本烤枯變形； c 初染：在涂片上加結(jié)晶紫一滴，約l m i n 后，水洗； d 媒染：滴加碘液并保存l m i n ，水沈： e 脫色：將載玻片上的水甩干凈，用9 5 酒精滴沈片至滴出的酒精剛剛出現(xiàn)紫色為 止，約2 0 s ，立即用水沖洗； f 復(fù)染：用番紅染色l m i n ，水洗，吸干； g 鏡檢：油鏡下觀察，被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌( g + ) ，被染成紅色者為革 蘭氏陰性菌( g 一) 。 2 2 2 2 氧化酶試驗(yàn) 1 、挑取耐c d 2 + 菌株單菌落于l b 斜面固體培養(yǎng)基中，3 0 。c 過夜培養(yǎng)。 2 、配制成1 0 的二甲基對苯撐二胺水溶液，保存在棕色瓶中，將二甲基對苯撐二 胺水溶液滴在一張放在結(jié)晶的培養(yǎng)皿巾的濾紙上，使濾紙剛好濕潤。 3 、用接種環(huán)取少量菌苔涂抹于滴有二甲基對苯撐二胺水溶液的濾紙上。 4 、在1 0 秒內(nèi)菌苔或邊緣呈現(xiàn)紅色者為陽性，在3 0 秒內(nèi)出現(xiàn)紅色者為遲緩陽性； 不呈現(xiàn)紅色或3 0 秒以后才呈現(xiàn)紅色則為陰性。 2 2 2 3 過氧化氫酶試驗(yàn) 1 、挑取耐c d 2 + 菌株單菌落接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，3 0 。c 過夜培養(yǎng)。 2 、挑取一小環(huán)菌苔涂抹在滴有5 h ! o ! 的玻璃片上，如有氣泡產(chǎn)生則為過氧化氫 酶陽性，無氣泡則為陰性。 2 2 2 4 明膠液化實(shí)驗(yàn) 1 、從分離得到的菌種平板上挑墩單克隆于l b 液體培養(yǎng)基中，3 0 。c ，2 0 0 r p m 震蕩 西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 1 頁 過夜培養(yǎng)。 2 、用穿刺接種法接種高耐c d 2 + 細(xì)菌于明膠液化培養(yǎng)基中，3 0 。c 培養(yǎng)4 8 h 。 3 、觀察培養(yǎng)基有無液化及液化后的性狀( 因明膠在高于2 5 * ( 7 時(shí)自行液化，觀察時(shí) 應(yīng)放在冰浴中觀察) 。 2 2 2 5 淀粉水解試驗(yàn) 1 、從分離得到的菌種平板上挑取單克隆于l b 液體培養(yǎng)基中，3 0 。c ，2 0 0 r p m 震蕩 過夜培養(yǎng)。 2 、制備淀粉固體培養(yǎng)基平板，用接種環(huán)接環(huán)取少量高耐c d 2 + 細(xì)菌點(diǎn)接在培養(yǎng)基表 面，3 0 培養(yǎng)2