（茶學專業(yè)論文）茶樹β13葡聚糖酶基因的克隆及原核表達分析.pdf

摘要 茶樹是我國重要的經濟作物之一，茶葉為我國主要出n g , j 匯農產品。長期以來， 真菌病害一直是危害茶樹生長、影響茶葉產量的主要病害之一，給我國的茶葉帶來巨 大的經濟損失，因此防治真菌病害一直是人們非常關注的問題。自栽培茶樹以來，人 類采取了多種措施防治真菌病害：通過傳統(tǒng)育種方法，培育抗病新品種；施用化學殺 菌劑；采用綜合防治等方法盡量減少農藥的使用量和農藥殘留量。但由于作物本身的 遺傳資源有限，真菌的高變異性以及化學殺菌劑的污染問題，使得利用基因工程的手 段培育抗病品種成為近年來農業(yè)生物技術的研究熱點之一。 本論文中，首次從木本植物茶樹中克隆出1 3 1 , 3 一葡聚糖酶基n ( g 1 u ) 的全長序列， 并在原核表達系統(tǒng)中表達，鑒定表達蛋白的活性，為開展茶樹抗真菌病害的基因工程 研究及運用生物技術培養(yǎng)茶樹良種打下基礎。本實驗研究結果表明： 1 根據已知茶樹g l u3 - 端的部分序列設計特異引物，采用5 - r a c e 技術獲得了5 一 端核酸序列片段1 0 0 5 b p ，經過測序，在g e n b a n k 數據庫中搜索分析表明，克隆所 得堿基序列和所推導的氨基酸序列與已報道的其他植物的c d n a 相應序列有很高 的一致性，推測該特異產物為茶樹g l u 的片段。 2 ，根據已知g l u3 - 端部分序列和克隆得到的5 一端序列設計特異引物，通過采用高保 真酶體系做p c r 反應，得到全長序列2 0 0 2 b p ，開放閱讀框為1 4 8 8 b p ，編碼4 9 5 個氨基酸。在g e n b a n k 和s w i s s p o r t 數據庫中搜索分析表明，該序列所推導的氨 基酸序列與已報道的其他植物g l u 的e d n a 相應序列有3 0 - - 7 0 的一致性，推測 該全長片段為茶樹g l u 。 3 選用p e t 3 2 a 表達載體和b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 宿主菌的原核表達系統(tǒng)，對g l u 的開放閱 讀框片段進行表達。經i p t g 誘導表達的融合蛋白的分子量約為7 3 k d a ，推算出 g l u 基因表達蛋白分子量為5 3 5 k d a ，與預計的分子量5 2 9 k d a 相符。表達的蛋白 經薄層層析分析，但沒有酶活性。 關鍵詞：茶樹1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶 e d n a蛋白表達 1 1 1 a b s t r a c t t e ap l a n t 【c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) ok u n t z e s 】i so n eo ft h ei m p o r t a n ti n d u s t r i a lc r o p sa n de x p o r t a g r i c u l t u r a lp r o d u c t si nc h i n a s i n c eal o n gt i m e ，f u n g a ld i s e a s e sh a v eb e e no n eo f t h ep r i n c i p a lc a u s e s o ft e ap l a n tg r o w t ha n dt e ay i e l d ，w h i c hr e s u l t st h en a t i o n a lt e ag r e a te c o n o m i cl o s s e s 。s oh o wt o c o n t r o lf u n g a ld i s e a s e sh a sb e e no d eo f t h ec o n c e r n e dq u e s t i o n sb yt h eb r e e d e r s s i n c eh u m a ns t a r t e dt o c u l t i v a t et e ap l a n t s ，al o to f m e a s u r e sh a v eb e e na p p l i e dt oc o n t r o lt h ef u n g a ld i s e a s e s ，s u c ha sb r e e d i n g t h ef u n g u s r e s i s t a n tc u l t i v a r sb yc o n v e n t i o n a lb r e e d i n gw a y s ，t h ea p p l i c a t i o no fp e s t i c i d e s ，a n d c o l l i g a t e dw a y st or e d u c ed o s a g eo f a g r o c h e m i c a l sa n dr u d i m e n t a la g r o c h e m i c a l s b u td u et ot h el i m i t e d i n h e r i t a n c er e s o u r c e s ，t h eh i 【g hv a r i a b i l i t yo f f u n g a la n dt h ep o l l u t i o no f t h ep e s t i c i d e se t c ，w h i c hl e a d s t oa p p l y i n gt h et e c h n o l o g yo f g e n ee n g i n e e r i n gt ob r e e dt h ea n t i p a t h o g e n sc u l t i v a r sb e c o m e so n eo f t h e r e c e n tr e s e a r c hf o c u s e so f a g r i c u l t u r a lb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y i nt h i sp a p e r t h ef u l l - l e n g t he d n ao fb - 1 , 3 一g l u c a n a s eo f t e ap l a n th a db e e nc l o n e da n ds t u d i e da t t h ef i r s tt i m e t h i sg e n ew a se x p r e s s e di ne c o l ia n di t sp r o t e i na c t i v e n e s sw a sd e t e r m i n e d ，w h i c hw a s n o to n l yc o n t r i b u t et ot h eg e n ee n g i n e e r i n gr e s e a r c ho na n t i - f o n g a lp a t h o g e n so ft e ap l a n t ，b u tm a k ea b a s ef o ra p p l y i n gt h eb i o l o g i c a lt e c h n o l o g yt ob r e e dt h et e ac u l t i v a r s i nt h i sw o r k ，t h ee x p e r i m e n tr e s u l t s s h o w t h a t ： i a c c o r d i n g t o t h e p a r t i a lk n o w n3 - t e r m i n a ls e q u e n c e o f1 5 1 ，3 - g l u c a n a s eo f t e ap l a n t ，w e d e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt h eg s pp r e m i e rf o r5 - r a c er e a c t i o n a1 0 0 5 b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e db y 5 - r a c ew h i c hw a ss u b s e q u e n t l ya n a l y z e di ng e n b a n kd a t e - b a s ea f t e rs e q u e n c i n g ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo ft h en u c l e o d d ea n dd e d u c e da m i n oa c i d sh a dh i g li d e n t i t yw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gp a r to fb - 1 , 3 - g l u c a n a s ec d n a s o f o t h e rp l a n t sp u b l i s h e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h i ss p e c i f i c p r o d u c t m a yb e t h e p a r t i a l f r a g m e n t o fb - 1 , 3 - g l u c a n a s e o f t e a p l a n t 2 a c c o r d i n gt ot h ep a r t i a lk n o w n3 - t e r m i n a ls e q u e n c ea n dc l o n e d5 - t e r m i n a ls e q u e n c e ，w ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt w ot e r m i n a lg s pp r e m i e r s t h ef u l l l e n g t hf r a g m e n to f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ee d n a w a sa m p l i f i e dp c rb yu s i n gh i g h - f i d e l i t yd n a p o l y m e r a s e ，a n dt h es e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e d t h a t t h e f u l l - l e n g t ho f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ec d n a w a sc o m p o s e d o f 2 0 0 2 b p ，a n d t h e o r ：w a s1 4 8 8 b p ， c o d i n gf o r4 9 5a m i n oa c i d s t h ef u l l l e n g t hf r a g m e n tw a ss u b s e q u e n t l ya n a l y z e di ng e n b a n ka n d s w i s s - p o r td a t e - b a s e s ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i d sh a d3 0 - - 7 0 i d e n t i t y w i t ht h ec o r r e s p o n d i n gp a r to fp 1 3 g l u c a n a s ec d n a so fo t h e rp l a n t sp u b l i s h e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h i ss p e c i f i cp r o d u c tm a yb et h ef u l l - l e n g t hf r a g m e n to fb - 1 3 - g l u c a n a s eo f t e ap l a n t 3 t h eo r fs e q u e n c eo fb 一1 , 3 一g l u c a n a s ew a sc l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 aa n de x p r e s s e di n b l 2 i t r x b ( d e 3 ) t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h ef u s i o na n dt a r g e tp r o t e i ni n d u c e db yi p t gw a sa b o u t l v 7 3 k d a a n d5 3 5 k d ar e s p e c t i v e l ya c c o r d e dw i t ht h ee s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h t5 2 9 k d a e n z y m ea c t i v i t yw a sa n a l y z e db yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , b u tn oa c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d k e y w o r d s ：t e a p l a n t c a m e l l i a s i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e s ) ；b - 1 , 3 - g l u c a n a s e c d n a ；e x p r e s s i o np r o t e i n v 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成 果。盡我所知除了文中特矧j j n 以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā) 表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農業(yè)大學或其它教育機構的學位或證書 而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明 確的說明并表示了謝意。 研究生簽名 魚迄 時1 8 1 ：) o b y - 年6 月2 j f i 關于論文使用授權的說明 本人完全了解安徽農業(yè)大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保酎 送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱?？梢圆捎糜坝?、縮印或掃描等復 制手段保存、匯編學位論文。同意安徽農業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、 傳播學位論文的全部或部分內容。 ( 保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議) 研究生簽名：亟邀時間：砂5 ，年f 月確 第一導師簽名：時間： 時哞z 月 、 文獻綜述 植物抗病性及其機制一直是植物病理學和抗病育種中的熱點問題。植物抵抗病原 菌的機制般有兩種，一種是先天的結構性障礙和( 或) 誘導產生化學物質，另外一 種是系統(tǒng)性獲得性抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t e n c e ，s a r ) 【1 1 前者的典型例子是過 敏性反應( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 誘導1 2 1 ，h r 與植物的抗病性有直接的關系， 但h r 的原理還不十分清楚，一般認為植物受到病原苗感染后，細胞發(fā)生程序性死亡， 但同時植物也釋放出胞液中儲存的有害物質，如植保素和病程相關蛋白 ( p a t h o g e n s i s r e l a t e d p r o t i e n ，p r ) p j ，葡聚糖酶即是這樣一種蛋白。 1 1 3 1 , 3 葡聚糖酶的基本生物學特性 b 一1 ，3 葡聚糖酶在高等植物內廣泛分布，包括花粉管壁、精細胞壁、篩管端壁等 結構中均有存在，它們在植物正常的發(fā)育階段中發(fā)揮重要作用。以往的研究表明d 1 ，3 一 葡聚糖酶涉及到許多生理過程，包括谷類發(fā)芽、胚軸和胚芽鞘發(fā)育、韌皮部運輸和胼 胝質的運動、微管組織運輸調節(jié)和細胞壁生物合成、花的發(fā)育、小孢子形成、花粉管 發(fā)育、果實成熟、植物衰老以及固定和愈色性葡聚糖的清除等方面。在植物抵抗外來 病原菌的過程中，b 一1 ，3 一葡聚糖酶是植物過敏性反應( h r ) 中合成的重要水解酶類。 植物抵抗病菌侵害的途徑多種多樣，包括加固細胞壁、產生抗菌物質，而其首要的方 式則是h r 。根據基因的進化關系、蛋白質特點和氨基酸序列相似程度等方面，b 1 ，3 一 葡聚糖酶可以分為不同的類型。綜合以往的研究結果，b 1 ，3 葡聚糖酶可以歸納為三 種類型：定位于液泡的堿性類型、胞外定位的酸性類型、還有其它一些b 1 ，3 葡聚糖 酶在序列上與以上馕種類型相差甚遠，可以單獨作為一類【4 】。 2 p - 1 ，3 葡聚糖酶在植物抗病中的作用 d 1 ，3 葡聚糖酶是一類重要的病程相關蛋白( p r ) ，p r 類蛋白是由植物寄主基因 編碼的，在病理或相關條件下誘導產生的蛋白質，p r 類蛋白與植物系統(tǒng)獲得性抗性 ( s a r ) 和系統(tǒng)誘導性抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，i s r ) 有密切相關【5 】。根據 已經發(fā)現的p r 蛋白可分為十一類，d 1 ，3 葡聚糖酶屬于p r 一2 類【6 】o p l ，3 - 葡聚糖酶在植物的抗病過程中扮演著重要角色。p 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質是 真菌細胞壁的重要結構成分，許多真菌的菌絲尖端，b 1 ，3 葡聚糖和幾丁質暴露在表 面，能夠直接受到p 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質酶的攻擊，體外抑菌試驗表明，b 1 ，3 葡聚 糖酶對菌絲生長具有抑制作用嘲。不過，只有液泡定位的堿性葡聚糖酶能夠降解菌絲 壁，從而抑制生長，而胞間定位的類型則沒有抑菌活性【7 1 ，b 1 ，3 葡聚糖酶與幾丁質 酶共同作用時抑菌效果更明顯。當然，真菌也合成一些葡聚糖酶抑制蛋白( g l u c a n a s e i n h i b i t o rp r o t e i n ，r i p ) ，r i p 特異性地抑制寄主內源葡聚糖酶的活性【8 】，這反映了植 物與微生物共進化的一種關系。更重要的是，在水解過程中有真菌細胞壁釋放出來的 寡聚糖能夠作為植物多種抗病反應的激發(fā)因子，誘導植物的全面抗病反應【引o l 。這方 面的報道集中在大豆與大豆疫病菌的互作研究中。在大豆中，已經發(fā)現葡聚糖酶激發(fā) 子結合蛋白( g l u c a n e l i c i t o r b i n g d i n g p r o t e i n ，g e b p ) ，定位于大豆根部細胞的質膜上， 能夠特異性地結合口1 ，3 一葡聚糖酶降解過程中釋放出來的寡糖激發(fā)子，誘導植物的防 衛(wèi)反應j 。綜上所述，8 】，3 一葡聚糖酶的作用方式是由病原或植物信號因子誘導，經 過一系列的反應，植物b 1 ，3 一葡聚糖酶( 包括胞內積累的堿性類型和胞問積累的酸性 類型) 大量合成。b 1 ，3 一葡聚糖酶直接攻擊真菌絲上的葡聚糖，抑制真菌的生長，同 時，水解中產生的寡糖作為植物h r 中的激發(fā)子，誘導植物的防御反應。 3 p 1 ，3 。葡聚糖酶基因的研究 人們對包括煙草、水稻和大豆等重要農作物在內的十幾種植物中的葡聚糖酶基洲 進行了研究( 見表1 ) 。植物中的d 1 ，3 葡聚糖酶有堿性和酸性同工型【1 2 】。在健康植株 的種子發(fā)芽、下胚軸和胚芽鞘的生長、韌皮部的傳輸調節(jié)和花器官的發(fā)育等過程中都 存在堿性b 1 ，3 葡聚糖酶i i ，其表達具有器官特異性。在幼嫩的莖葉中少量表達或小 表達，在衰老部位表達量較高【1 4 l ”。在植物的萼片中表達明顯，花瓣居中，在雄蕊和 一d 皮中檢測不到該酶的表達i l6 j 。堿性b 1 ，3 葡聚耱酶也可在煙草組培組織中積累l 6 j 。 對從不同植物中分離到的c d n a 克隆和基因組克隆的研究表明，d 1 ，3 葡聚糖酶的州 工酶在物理性質、酶活性和細胞內的位置各不相同。這些同工酶大體分為3 種1 2 “第 1 種為堿性同工酶，主要在植株的液泡中組成型表達并積累：第2 種是酸性同工酶 i f 常植株中不存在，但可由病原菌和化學物質誘導產生，主要在細胞間隙表達積祟。 這兩種類型的酶由一個小的基因家族編碼，同一類型基因之間的氨基酸序列同源性高 于不同類型的。第3 種主要以煙草中細胞外表達的酸性p r q 和番茄中細胞內表達的 堿性8 一l ，3 葡聚糖酶為代表。第1 種與第2 、3 種分別有5 5 的氨基酸序列同源性 第2 、3 種之間的氨基酸序列同源性約在5 4 5 9 之間i i ”。 4 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶基因在植物抗真菌基n i 程中的應用 d 一1 ，3 葡聚糖酶的抑菌活性引起人們的重視。迄今，d 一1 ，3 一葡聚糖酶基因已經 轉入到煙草、獼猴桃和玫瑰等植物中，獲得了轉基因植株，其抗性表現不盡一致，由 于幾丁質酶和p 一1 ，3 一葡聚糖酶在體外的協(xié)同抑菌效果，更多的轉化研究則是將p 一1 ，3 一 葡聚糖酶和幾丁質酶共同導入受體植物基因組中( 見表2 ) 。j o n g e d i j k 等】將煙草的 c t a s s i 型b l ，3 - 葡聚糖酶基因和c l a s s i 型幾丁質酶基因轉化番茄肘發(fā)現，二者有明顯 寰1 p - 1 3 - 葡聚一豆其基因在不圈擅中的研究狀況 ! ! ! ! ! ：壘堅! ! ! 三苧! ! ! ! ! ! ! ! 璺z2 1 生! 圭g ! ! ! 1 2 1 蘭! ! 壘! 壘g ! ! 壁也p ! ! 翌主苧 植物鑒定或分離的酶的性質誘導物與其他植物葡聚糖酶 參考文獻 基因個數的同源性 的協(xié)同表達效果，番茄發(fā)病率降低3 6 5 8 ，但基因表達時抗病能力沒有增強。同 樣，s e l a - b u u r l a g e 等1 4 5 在煙草d 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質酶轉化煙草的研究中，發(fā)現胞 間汁液對立枯病具有很強的抑制效果，而單獨轉化其中的一個基因時，效果降低。對 于卵菌綱的真菌麗言，由于其菌絲壁不含幾丁質，轉化幾丁質酶基因沒有效果，導入 b 一1 ，3 一葡聚糖酶基因則更有意義。z h u 等【4 6 】在水稻堿性幾丁質酶基因r c h i o 和苜蓿酸 性b l ，3 葡聚糖酶基因4 g z 們轉化煙草的研究中發(fā)現，通過雜交的方式將二者協(xié)同 表達可以明顯增強煙草對蛙眼病的抗性，而且其抗性與基因的拷貝相關，表現為 ( c h i t i n a s e 2 n + g l u c a n a s e 2 n ) ( c h i t i n a s e l n + g l u c a n a s e l n ) ，即二基因在純合狀態(tài)下的協(xié) 同表達效果更好，表現在發(fā)病期的延遲，病斑數和病斑面積的減小。轉基因植株不僅 對于煙草的蛙眼病抗性提高，同時對于葉斑病及苗期猝倒病同樣有抵抗效果?？梢?。 p r 類抗病基因協(xié)同表達可能是一種創(chuàng)建抗病新資源的有效方式。 寰21 3 - 1 8 - 囊i l l 一基園撫寞基園工曩研究 a d v a n c e 口nt h e5 t u d yo f 爭1 ，3 哩i n c 瑚口eg e n e si nc o n t r o lo f f u n g a ld i s e a s e s 植物外源基因 抗病效果 參考文獻 煙草煙草b 一1 3 - 葡聚糖酶抗性提高( p h y t o n p h t h o r n p a r a s i t i c a 和p e r o n o s p o r at a b a c i n a l 獼猴桃大豆b - 1 3 - 葡聚糖酶抗性提高( b o r n t i s c i n e r e a ) 攻瑰大麥b 一1 3 - 葡聚糖酶沒有效果( d i p l o c a r p o n r o s a e ) 煙草煙草b 一1 3 - 葡聚糖酶和幾丁質酶有抑制作用( f u s a r i u ms o a n i ) 煙草 苜蓿b 一1 3 - 葡聚糖酶和水稻幾丁質酶癥狀減輕( c e r c o s p o r a n i c o t t a l l a e ) 番茄炳草b l ，3 一葡聚糖酶和幾丁質癥狀減輕3 娟5 鼴 ( f u s a r i u mo x y s p o r u m f s p h ) v o p e r s i c i ) 煙草大麥b 一1 。3 - 葡聚糖酶和幾丁質酶癥狀減輕( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 旨蓿 苜蓿b 一1 3 - 葡黎藉酶和水稻凡丁質酶抗性提高( p h y t o p h t h o r a m e g a s g e r m a ) 沒有效果( s t e m p h y l i u m 劬0 扣e ) 胡蘿h 煙草b 1 3 一葡聚糖酶和幾丁質酶 油菜煙草b 一1 。3 - 葡聚糖酶和幾丁質酶 煙草煙草b l 。3 一葡聚糖酶和幾丁質酶 抗性增強“l(fā) t e r n a r i ad a u c l ar a d i c i n a , c e r c o p o r ac a r o t a e , e r y s i p h eh e r a c l e o ( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r i u m ) 癥狀減輕( a l t e r n a r i a a l t e r n a t e ) 5 2 】 5 3 j f 5 4 3 p r 類的8 1 ，3 一葡聚糖酶或組成型、或誘導型表達，在不同組織中有不同的表達 反應，而且酶也被運輸到細胞的不同部位，對于抵御真菌病原的攻擊是具有積極意義 的。然而，迄今為止，沒有證據表明該酶在“病原寄主”的相互作用為“基因對基因” 模式，而更為可能的是，該酶參與的是一種對病原攻擊的廣泛的，非特異性的反應。 由此可見，多種因素參與了植物對于病原攻擊的防御反應，這些因素的協(xié)同表達 往往能增強寄主的抗病能力，不僅僅是葡聚糖酶和幾丁質酶，而且還有幾丁質酶和核 糖體失活蛋白等等，因而多因素的改造將成為植物抗病育種的一個發(fā)展方向。 5 b 一1 ，3 一葡聚糖酶與其它防衛(wèi)蛋白的協(xié)同表達 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶基因可以在植物抗病反應中獨立地發(fā)揮作用，但在植物整個抗病 系統(tǒng)反應中，各種防衛(wèi)反應往往表現出協(xié)同作用。 體外試驗表明，6 1 ，3 葡聚糖酶與幾丁質酶共同作用時能有效地抑制供試的1 8 種 真菌中的1 5 種。b o i l e rt 等( 1 9 8 3 ) 悼鄙報道，在幾丁質酶與8 1 ，3 葡聚糖酶的協(xié)同作 用下對真菌細胞壁的降解作用增強。將c l a s si 幾丁質酶和c l a s si1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶的基 因修飾后再轉入煙草，從轉入修飾過的基因的煙草胞外檢測出其產物，這兩種酶在體 外仍具抑菌活性，兩酶共存時有增效作用。這兩種酶在體外對鐮刀菌( f u s a r i u ms o l a n i ) 4 m 嗍 叫 等真菌也呈現了抑制活性。 b 1 ，3 葡聚糖酶或幾丁質酶與核糖體失活蛋白也具有很強的協(xié)同作用。李明等 ( 1 9 9 9 ) 【56 j 將含有大麥核糖體失活蛋白( b r i p ) 編碼序列的質粒p r c 2 4 b r i p 改造 后，依次與含有水稻堿性幾丁質酶基因r c h l 0 和水稻酸性幾丁質酶基因r a c 2 2 編碼 序列的質粒p a b c 2 以及含有苜蓿b 一1 ，3 葡聚糖酶編碼序列的質粒p a a g 8 9 連接，得 到了中間載體p r a s l 0 。p r a s l 0 再與根癌農桿菌雙元載體p c a m b i a l 3 0 0 連接，得 到了合適水稻轉化的雙元載體p r a s l 3 0 0 ，并導入到根癌農桿菌l b a a 4 4 0 4 中。蔡應 繁等( 2 0 0 0 ) t 5 7 5 8 j 構建了來自大麥c d n a 克隆的b 1 ，3 葡聚糖酶基因等的植物表達載體， 通過基因槍法等導入棉花，已獲得轉基因棉株。 可見，8 1 ，3 葡聚糖酶是植物抗真菌病中重要的抗性物質之一，而且作為植物內 源蛋白的b 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質酶，在轉基因植物的安全性方面更有其利用價值。 有的學者( m e i n s ，fj l l 9 9 3 ) 甚至預測，由病原微生物侵染誘導植物產生的i 類b 1 ，3 葡聚糖酶和幾丁質酶的結合可能是潛在的體外殺真菌劑【5 9 l 。將其應用于植物抗真菌 病基因工程中，外源b ! ，3 葡聚糖酶既可單獨地被導入植物發(fā)揮作用，又可與其它防 衛(wèi)蛋白一起轉入植物協(xié)同表達。 6 p l ，3 。葡聚糖酶基因的表達調控 不同類型的b 1 ，3 葡聚糖酶具有不同的誘導調控形式，酸性1 3 - 1 ，3 一葡聚糖酶分泌 到細胞問隙，其表達受病原菌攻擊、水楊酸和細胞分裂素的誘導，而對乙烯和傷害的 誘導不敏感。堿性類型則在健康的植株根部和下部葉片中組成性表達。堿性6 1 ，3 葡 聚糖酶定位于液泡，受到病原侵染、乙烯和紫外輻射以及傷害的誘導，但受細胞分裂 素和生長素的抑制i 矧，堿性b 1 ，3 ，葡聚糖酶一般對s a 的誘導不敏感【6 l 】。 從擬南芥中克隆的b g 4 和b g 5 則不受病原菌和水楊酸的誘導，植株營養(yǎng)生長期 間也不受階段發(fā)育調控和激素的誘導，但對于b g 4 ，子房的花柱和隔膜中表達量高， 該基因的表達與生殖過程有關1 6 2 1 。 b 一1 ，3 一葡聚糖酶基因的表達中。一些順式因子和反式因子在轉錄調控中發(fā)揮了重 要作用。在水楊酸應答元件( a s l i c y l i c a c i d r e s p o n s e e l e m e n t ，s a r e ) 的研究中，s h a l l 等【6 3 】發(fā)現在p 1 ，3 葡聚糖酶基因p r - 2 d 的啟動子序列中，一個2 5 b p 的順式元件對于 s a 的誘導具有重要作用，試驗表明核內存在反式因子與其特異結合m 】。大量研究表 明，水楊酸是植物抗病反應中的重要信號分子，s a 調控轉錄可能涉及到基因啟動子 的多個區(qū)域。 煙草b 1 ，3 葡聚糖酶基因g l n 2 啟動子區(qū)中存在乙烯應答元4 鍛 e t h y l e n er e s p o n s e e l e m n e t ，e r e ) ，其核心序列為a g c c g c c ，又稱為a g c 盒【6 ”。e r e 結構在許多病 原反應基因的啟動子中存在，與相應的乙烯應答元件結合蛋白( e t h y l e n er e s p o n s i v e e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，e r e b p ) 作用1 ”1 。 v a n d e r h e e 等州對煙草的研究表明酸性葡聚糖酶基因上游1 7 5 0 b p 序列含有多個 調控元件，而堿性葡聚糖酶基因啟動子1 4 7 6 到“6 的區(qū)段是其器官特異表達和階段 發(fā)育調控以及侵染和其它脅迫處理誘導所必須的，啟動子序列中含有若干個g c 元件 ( g g c g g c t c t t a ) n - - i 能與煙草堿性葡聚糖酶基因的誘導表達有關。 多項研究表明一個基因的上游序列中可以存在某種誘導因子的多個j ：陵式；：件，途 些順式元件之間的關系是極為復雜的。另一方面，即使在一個很小的區(qū)段，如2 5 b p 區(qū)段中，也可能存在緊密毗鄰的幾個元件，這給順式元件的鑒定帶來困難。反式因子 與順式因子之間的作用可能并不是真正專一性的，隨著外界環(huán)境條件的改變，這種特 異性也可能發(fā)生改變，就s a 而言，在b 1 ，3 葡聚糖酶基因p r - 4 的5 上有序列中就存 在多個反應區(qū)段，而且調控s a 的過程中也可能遠遠不止一兩種反式因子。 6 二、引言 一、j l 口 真菌病害一直是危害植物生長、影響作物產量的主要病害，病發(fā)流行時損失巨大 一般年份的損失及化學農藥防治造成的污染亦相當嚴重。因此如何有效地防治真菌病 害一直是育種學家們努力攻克的難題。自栽培農業(yè)以來，人類采取了多種措施來防治 真菌病害，多數病害的防治主要依賴于化學農藥的使用和抗病育種，但傳統(tǒng)抗病育種 費事費力，而化學農藥的使用易對環(huán)境造成污染，危害人類、牲畜的健康。防治該類 病害的根本措施是利用抗病品種，但由于病菌變異迅速，抗源缺乏及目前常規(guī)育種手 段繁雜，抗病品種遠遠滿足不了生產上的需要。所以，人們考慮應用生物技術來防治 植物病害，解決上述難題。利用生物技術防治植物病害，主要涉及植物抗性基因和病 原菌無毒基因的分離和克隆、對病原菌代謝過程中產生的酶的抑制劑及抗菌蛋白的研 究。出于基因工程技術的迅速發(fā)展，利用動物、植物和微生物的基因相互轉移，突破 了遠緣雜交不親和性的困難，開辟了作物抗病育種的新途徑。 植物基因工程是在分子水平上定向重組d n a 并導入植物細胞改造其遺傳特性 從而使作物的性狀得到改良，或者作為重要經濟價值的生產體系?；蚩寺〖夹g、 d n a 重組技術、分子雜交技術及基因表達調控等分子生物學操作技術的發(fā)展為植物 蛙因工程奠定了基礎。 自1 9 8 3 年首次獲得轉基因煙草以來，迄今通過基因工程技術已可以把不同來源 ( 包括動物、植物和微生物) 的基因導入植物細胞并整合迸植物基因組中，獲得轉 基因植株。山于植物基因工程技術不僅不受物種之問的生理障礙的限制?？梢猿浞掷?j j 不f 司種質基因資源來改良農作物，而且克服了傳統(tǒng)育種方法存在的培育新品種j 囂要 的時間長，過程煩瑣，需要耗費大量的人力和物力的局限性，因此基因工程技術已成 為改良植物性狀，培育優(yōu)良高產作物新品種的分子育種技術。 1 研究意義 茶樹病害與其它作物相比，在病原菌方面有如下特點：到目前為止，我國茶樹l 。 部和莖部幾乎沒有發(fā)現細菌病原物，也很少有病毒和類病原體引起的病害，以真菌病 害最多。大量的病蟲害嚴重影響了茶葉的質量和產量，茶葉作為一種飲料，若以化學 方法防治茶樹病蟲害，直接關系到人們的身體健康，所以茶葉的農藥殘留量問題已經 越來越引起人們的普遍關注。長期以來，茶葉工作者采用綜合防治等方法盡量減少農 藥的使用量和農藥殘留量，同時通過各種方法選育抗病蟲的品種，但進展不大，因此 利用轉基因技術培育抗病蟲品種已迫在眉睫【6 ”。到目前為止。已從許多不同植物分離 到6 1 ，3 一葡聚糖酶基因，而且毗煙草中p - l ，3 - 葡聚糖酶研究最透徹，但在木本植物中 關于b 一1 ，3 一葡聚糖酶的作用卻知之甚少。本研究對茶樹鮮時中具有廣譜抗真菌病害的 b i ，3 葡聚糖酶基因c d n a 進行了克隆、序列的測定和酶活性檢測，旨在為開展茶樹 抗真菌病害的基因工程研究及運用生物技術培養(yǎng)茶樹良種打f 基礎。 2 技術路線和研究內容 2 1 技術路線 茶樹葉片總r n a 的提取和c d n a 的第一鏈合成 上 b - i ，3 一葡聚糖酶c d n a 的5 - r a c e 擴增 土 1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖酶c d n a 全序列的擴增 構建原核表達載體并轉入e c o l i 中 、l 表達蛋白檢測和酶活性鑒定 2 2 研究內容 2 21d l ，3 葡聚糖酶c d n a 的5 - r a c e 反應：根據已知3 一端的部分序列設計特異引 物，進行5 - r a c e 反應，擴增5 - 端的序列。 2 2 2b l ，3 一葡聚糖酶c d n a 全序列的擴增：根據已知3 端的部分序列和克隆得到的 5 - 端序列設計全長特異引物，擴增全長序列。 2 2 3 原核表達重組載體的構建：選用p e t 3 2 a 原核表達載體和b l 2lt r x b ( d e 3 ) 宿主菌， 將g l u 基因構建入p e t 3 2 a 載體，轉化b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 菌株，經i p t g 誘導表達蛋白。 2 2 4 表達蛋白檢測和酶活性鑒定：選用薄層層析法分析表達蛋白的酶活性。 ， 三、材料與方法 1 材料 鮮葉采自安徽農業(yè)大學茶業(yè)系教學茶園，品種為龍井4 3 4 c a m e h 脅s m e n s 擔( l ) 0 k u n t z e s 一芽二葉初展。 2 儀器與試劑 2 1 主要儀器設備 p c r 儀：b i o t r m e t r a - t g r a d i e n t 凝膠成像系統(tǒng)：上海天能( t a n n o ng i s 凝膠圖像處理系統(tǒng)) 電泳儀：北京六一儀器廠 超低溫冰箱：r 本s a n y o 高速冷凍離心機：b e c k m a nc o u l t e r 臺式離心機：上海安事科學儀器廠 制冰機：上海安亭科學儀器廠 恒溫冷凍水循環(huán)儀：德國h u b e r 公司( p l o y s t a t ek 6 - 1 ) 電子天平：m e t i l e r1 o l e d o 公司 d h 計：m e t i l e rt o l e d o 公司 7 5 6 m c 紫外可見分光光度計：上海第三儀器廠 超凈工作臺：上海浦東物理光學儀器廠 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠 電熱恒溫培養(yǎng)箱：南京儀器廠 真空干燥箱：m e d c e n t e re i n r i c h n 州g e ng m b hv a c u c e l l 微量移液器：吉爾森數字可調式移液器和e p p e n d o f f 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏試驗設備有限公司 2 。2 試劑 上海生工產品：d n am a r k e r 、t a qd n a 聚合酶，p c r 合成系統(tǒng)、g e le x t r a c t i o n k i t c l o n t e c h 公司產品：s m a r tr a c e e d n a a m p l i c a t i o nk i t ( 含t h ea d v a n t a g e2 p c r k i t 和n u c l e o t r a pg e le x t r a c t i o nk i t ) 、a d v a n t a g e g c2p c r k i t p h a m a c i a 公司產品：m r n a 提取純化試劑盒 9 t a k a r a 公司產品：曲i 、b a m h l 、p m d 1 8 - t 載體、t a q t md n a 聚合酶 p y r o b e s t t md n a 聚合酶、x - e c o t t 4 id i g e s tm a r k e r p r o m e g a 公司產品：1 4d n a 連接酶和m m l v 逆轉求酶 n o v a g e n 公司產品：菌株e c o l ib l 2 1 t r x b ( d e 3 ) i i 收達拔體p e t 一3 2 a ( + ) m b i 公司產品：d n am a r k e r 與蛋白質m a r k e r 實驗中所用引物的合成及p c r 產物的n y ：- ：作皆山上海 j - ；l l 合作寵成。 3 方法 3 1 茶鮮葉中r n a 的提取、檢測與e d n a 第一鏈的合成 3 1 1 總r n a 的抽提與檢測：參考文獻 e 7 6 8 的方法，稍有修改 i ) 茶鮮葉( 一芽二葉初展) 放在研缽中，加入液態(tài)氮和玎i 溶性聚乙烯毗略炕酮 ( p v p p ) 磨成粉術，p v p p 設5 和1 0 ( w w ) 2 個處理。準確稱取i 司樣重量的粉 末( 按粉術：鮮葉= l ：0 8 折算為4 5 0 m g 鮮葉) 分別放入冰上預冷的離心管中。 2 ) 每管加入o 9 m l 變性溶液( 含4 m o l l 異硫氰酸胍，2 5 m m o l l 檸檬酸鈉p h 7 0 0 5 十二烷基肌氨酸鈉，o 1 m o l l 2 - 巰基已醇) ，冰浴1 5 r a i n ，間歇緩慢攪動。 3 1 4 c ，1 4 0 0 0 9 ，離心2 0 m i n ，將上清液移至干凈的預冷的離心管中。 4 1 加入1 1 0 體積2 m o l ln a a c ，p h 4 0 ，等體積飽和酚( p h 3 5 ) ，1 5 體積氯仿 異戊醇( 4 9 ：1 ) ，顛倒l o 次，充分混勻，冰浴1 5 r a i n ，讓其靜止分層。 5 14 ，1 4 0 0 0 9 ，離心2 0 m i n 。將上清液移至干凈的離心管中，加入等體積的異 丙醇，混勻后簧7 0 冷凍一個小時或2 0 冷凍2 小時以上，沉淀r n a 。 6 14 c ，1 3 0 0 0 9 離心2 0 m i n ，棄1 1 清。川2 5 0 p l 變性溶澉徹底溶解沉淀加入 等體積的異丙醇，混勻后置。7 0 冷凍3 0 分鐘或型長時m ，沉淀r n a 。 7 14 c ，1 3 0 0 0 9 ，離心2 0 m i n ，j f j1 m l7 5 乙醇淋沈( 即離心) r n a 沉淀2 次。 每次冰浴5 m i n ，4 c ，1 2 0 0 0 9 ，離心5 m i n 。 8 ) 除盡乙醇空氣中干燥沉淀。剛3 5