（微生物學(xué)專業(yè)論文）海洋小鏈霉菌dy2741菌株抗菌活性物質(zhì)的初步研究.pdf

、k卟；。；4lfl ；t。，；， ；t 。 摘要 對(duì)廈門周邊海域采集的不同樣品( 包括海水、海沙、海貝等) ，采用稀釋平板法 分離、純化、保藏各種海洋微生物，共分離到細(xì)菌5 7 株，放線菌1 7 株和霉菌1 2 8 株。 采用濾紙片法以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、啤酒酵母、黑曲霉為測(cè)試菌，進(jìn)行抗菌 活性菌種篩選，結(jié)果表明從海水和海貝分離出具有抗菌活性的細(xì)菌占該類樣品分離總 細(xì)菌數(shù)比例較高，分別為6 9 2 和4 5 5 ；從海水、海沙和海貝中分離出具有抗菌活 性的放線菌占從該類樣品分離總放線菌數(shù)比率高，分別占7 5 o 、8 0 o 和8 0 0 ： 從海沙和海貝中分離出具有抗菌活性的真菌占從該類樣品分離總真菌數(shù)比率高，分別 為5 4 5 和5 7 1 。海洋細(xì)菌和放線菌抗兩種細(xì)菌比率高于其它類型測(cè)試菌，而海洋 真菌對(duì)各測(cè)試菌的抗菌比率相對(duì)平均。 二 對(duì)一株分離自廈門大嶼島海域潮間帶海洋軟體動(dòng)物的放線菌進(jìn)行研究。經(jīng)過形態(tài) 特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征可以初步鑒定為鏈霉菌屬( s t r e p t o m y c e ss p ) 黃色類 群( f l a v u s ) ，1 6 sr d n a 序列與g e n e b a n k 比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建表明其與s t r e p t o m y c e s p a r v u ss t r a i nn r r lb 1 4 5 5 t 的序列同源性達(dá)9 9 。 為了提高抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量，對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。采用管 碟法測(cè)發(fā)酵液的活性，篩選出最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為氯化銨。通過響應(yīng) 面設(shè)計(jì)b o x b e h n k e n 中心組合實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最佳組成為可溶性淀粉2 0 3 5 ，氯化 銨0 4 4 2 5 、氯化鈉2 0 0 0 ；發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明最適起始p h7 0 ，最適接種菌齡 4 8 h ，最適接種量為6 ，最適裝液量為2 5 0 m l ，最適三角瓶裝量7 0 m l ，最適培養(yǎng)溫 度為2 8 ，最適培養(yǎng)時(shí)間5 d 。 菌株d y 2 7 4 1 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明：該抗菌物質(zhì)對(duì)p h 、u v 具有較好的穩(wěn)定 性，高于1 0 0 處理抗菌物質(zhì)部分失活。 通過對(duì)該菌發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的溶解性質(zhì)測(cè)定，可推知該物質(zhì)極性中等。葡聚糖 凝膠s e p h a d e xl h 2 0 柱色譜分離后，經(jīng)抗菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)活性峰，其中第2 個(gè) 峰對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性較強(qiáng)。將第2 個(gè)峰的洗脫液各組分進(jìn)行薄 層色譜分析，選取斑點(diǎn)清晰且單一的組分進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析，總離子流圖 表明該組分成分單一，根據(jù)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)以及紅外光譜分析，初步判斷該組 分為鄰苯二甲酸二丁酯( d b p ) 。 關(guān)鍵詞：海洋微生物分離，抗菌物質(zhì)，鑒定，發(fā)酵條件，分離純化 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , m a n yk i n d so fs a m p l e si n c l u d i n gs e a w a t e r , s e as a n da n ds e a s h e l l se t c ， w e r ec o l l e c t e df r o mx i a m e ns e aa r e a f i f t ys e v e ns t r a i n sm a r i n e - d e r i v e db a c t e r i a , s e v e n t e e ns t r a i n sm a r i n e d e r i v e da c t i n o m y c e t e sa n d12 8s t r a i n sf u n g iw e r ei s o l a t e df r o m t h ea b o v e s a m p l e s t h e i r a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s a g a i n s t f o u r m i c r o o r g a n i s m s ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，e s c h e r i c h i ac o l i ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n da s p e r g i l l u sn i g e r ) w e r ea s s a y e db yp a p e rd i f f u s i o nm e t h o d i tw a sf o u n dt h a tt h er a t eo fm a r i n eb a c t e r i a p r o d u c i n ga n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e si s o l a t e df r o ms e a w a t e ra n ds e a s h e l l st ot h et o t a lo f b a c t e r i ai s o l a t e df r o md i f f e r e n ts a m p l e sw a sh i g h e r , r e s p e c t i v e l y6 9 2 a n d4 5 5 t h e r a t eo fm a r i n ea c t i n o m y c e t e sp r o d u c i n ga n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e si s o l a t e df r o ms e a w a t e r , s e a s a n da n ds e a s h e l l sw a sh i g h e r , r e s p e c t i v e l y7 5 o ，8 0 0 a n d8 0 0 a n dt h a tt h er a t eo f m a r i n ef u n g ip r o d u c i n ga n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e si s o l a t e df r o ms e as a n da n ds e a s h e l l sw a s h i g h e r , r e s p e c t i v e l y5 4 5 a n d5 7 1 r n l em t eo ft h eb a c t e r i aa n da c t i n o m y c e t e sa g a i n s t t w ok i n d so fb a c t e r i aw a sm o r et h a nt h a ta g a i n s tt h eo t h e ri n d i c a t i o ns t r a i n sa n dt h er a t eo f t h ef u g ia g a i n s ta l lt h e s ei n d i c a i t o ns t r i a n sw a so na v e r a g e am a r i n e d e r i v e da c t i n o m y c e t ed y 2 7 41i s o l a t e df r o ms e ai n v e r t e b r a t ac o l l e c t e df r o m x i a m e ni n t e r t i d a lz o n ew a ss t u d i e d a c c o r d i n gt om o r p h o l o g i c a l ，c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s a n dp h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y , t h i ss t r a i nb e l o n g e dt of l a v u so ft h eg e n u ss t r e p t o m y c e s s p 16 sr d n ac o m p a r e dw i t h t h eg e n e b a n ka n di t s p h y l o g e n e t i ct r e es h o w e dt h a t h o m o l o g yo fg e n eo r d e rb e t w e e nd y 2 7 4 1a n ds t r e p t o m y c e sp a r v u ss t r a i nn r r lb - 14 5 5 t w a s9 9 i no r d e rt oi n c r e a s ey i e l do fa n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e s ，t h ec o m p o s i t i o n so fm e d i u ma n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d i ts h o w e dt h eo p t i m i z e dc a r b o ns o u r c ew a ss t a r c h ； t h eo p t i m i z e dn i t r o g e ns o u r c ew a sa m m o n i u mc h l o r i d e a c r o o d i n gt o t h ed e s i g no f b o x b e h n k e nc e n t r a lc o m p o s i t e ，t h eo p t i m u mm e d i u mc o m p o s i t i o n ：s t a r c h2 0 35 ， a m m o n i u n lc h l o r i d e0 4 4 2 5 a n dn a c l2 0 0 0 o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a t i n i t i a lp hw a s7 0 ，s e e da g ew a s4 8 h ，i n o c u l a t i o nq u a n t i t yw a s6 ，t h eo p t i m u mv o l u m eo f m e d i u mi n2 5 0 m lf l a s kw a s7 0 m l ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s2 8 ca n df e r m e n t a t i o n t i m e w a s5 d n 圮a n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e si nt h ef e r m e n t e db r o t hw a ss t a b l et ot h ep ha n d u l t r a v i o l e t t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t ys t a r t e dt od e l i n ea t10 0 b yd e t e r m i n a t i o n ，i tw a sd e d u c e dt h a tt h ea n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e si nd y 2 7 4 1b r o t h h a dl i p i ds o l u b i l i t yp r o p e r t yw i t hm i d d l ep o l a r i t y o nt h eb a s i so fs e p a r a t i o no ft h e h i 一 i - - l p j ： ip 、 - s e p h a d e xl h 一2 0 ，t w op e a k sw i t ha n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya p p e a r e d ，a n dt h es e c o n dp e a k s h o w e dt h es t r o n g e ri n h i b i t i o na c t i v i t ya g a i n s ts a u r e u sa n de c o i l i no r d e rt oa n a l y z e t h e f r a c t i o n , t l cw a sa n a l y z e dt oc h o o s et h et u b ew h i c hh a dac l e a ra n ds i n g l es p o t g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( o c - m s ) a n a l y s i sw a sp e r f o r m e dt ot h i st u b e w h i l e t i cs h o w e di tw a sr e l a t i v e l yp u r e a c c o r d i n gt oc o m p a r i s o no fm ss p e c t r u ma n dt h e s t a n d a r d s p e c t r a ll i b r a r ya n df t i ra n a l y s i s ，i tw a sp r e l i m i n a r i l y i n f e r r e da s d i b u t y l p h t h a l a t e ( d b p ) k e yw o r d s ：i s o l a t i o no fm a r i n em i c r o o r g a n i s m s ，a n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e s ，i d e n t i f i c a t i o n ， f e r m e n t a t i o np a r a m e t e r s ，s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n i i i t 產(chǎn) i 、 、 p h 一乜 - 伊 “ 目錄 文獻(xiàn)綜述1 1 引言7 1 1 研究意義與理論依據(jù)7 1 2 本研究擬解決的問題。7 2 材料與方法8 2 1 材料8 2 1 1 儀器設(shè)備與試劑8 2 1 2 樣品來源8 2 1 3 菌種8 2 1 4 培養(yǎng)基：9 2 2 方法。1 1 2 2 1 海洋微生物分離方法l l 2 2 2 具抗菌活性菌種初篩1 1 2 2 3 抗菌活性測(cè)定1 1 2 2 4 放線菌d y 2 7 4 1 的鑒定1 2 2 2 5 放線菌d y 2 7 4 1 分子鑒定1 3 2 2 6 小鏈霉菌d y 2 7 4 l 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。1 4 2 2 7 小鏈霉菌d y 2 7 4 1 發(fā)酵條件優(yōu)化1 4 2 2 8 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究。l5 2 2 9 抗菌譜測(cè)定。l5 2 2 1 0 抗菌物質(zhì)的溶解性質(zhì)以及分離、純化和鑒定1 6 3 結(jié)果與分析1 8 3 。l 海洋微生物分離與具抗菌活性菌種篩選18 3 1 1 細(xì)菌分離與抗菌活性菌種初篩計(jì)分析1 8 3 1 2 放線菌分離與抗菌活性菌種篩選統(tǒng)計(jì)分析1 9 3 1 3 真菌分離與抗菌活性菌種篩選統(tǒng)計(jì)分析1 9 3 2 放線菌d y 2 7 4 1 鑒定2 0 3 2 1 菌株d y 2 7 41 形態(tài)觀察2 0 3 2 2 菌株d y 2 7 4 1 培養(yǎng)特征2 0 3 2 3 生理生化特性2 l 3 2 3 菌株d y 2 7 4 11 6 sr d n a 分子鑒定2 2 i v 3 3 菌株d y 2 7 4 1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化2 4 3 3 1 培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)抗菌物質(zhì)抑菌效果的影響2 4 3 3 2 碳源對(duì)抗菌物質(zhì)抑菌效果的影響2 5 3 3 3 氮源對(duì)抗菌物質(zhì)抑菌效果的影響2 6 3 3 4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)培養(yǎng)基組成2 7 3 5 菌株d y 2 7 4 1 發(fā)酵條件優(yōu)化3 2 3 5 1 起始p h 對(duì)抗菌物質(zhì)抑菌效果的影響3 2 3 5 2 接種菌齡對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響3 2 3 5 3 接種量對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響。3 3 3 5 4 裝液量對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響3 3 3 5 5 發(fā)酵溫度對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響。3 4 3 5 6 抗茵物質(zhì)產(chǎn)生的時(shí)間3 5 3 5 7 發(fā)酵條件優(yōu)化前后比較3 5 3 6 抗菌譜測(cè)定3 6 3 7 發(fā)酵液抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)3 6 3 7 1u v 穩(wěn)定性3 6 3 7 2p h 穩(wěn)定性3 6 3 7 3 熱穩(wěn)定性3 7 3 8 抗菌物質(zhì)的溶解性質(zhì)以及分離、純化和鑒定3 7 3 8 1 抗菌物質(zhì)的溶解性測(cè)定3 7 3 8 2 葡聚糖凝膠s e p h a d e xl h 2 0 柱色譜分離各組分的抑菌活性3 9 3 8 3 活性成分分析結(jié)果3 9 4 討論4 3 4 1 海洋微生物分離與具抗菌活性菌種篩選4 3 4 2 放線菌d y 2 7 4 1 菌種鑒定4 3 4 3 菌株d y 2 7 4 1 的發(fā)酵條件優(yōu)化4 3 4 4 菌株d y 2 7 4 1 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究4 3 4 5 活性成分的研究4 4 5 結(jié)論4 5 參考文獻(xiàn)4 6 j 目c 謝5l 作者簡(jiǎn)介5 2 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文5 2 v l j h - ( 、 - _ ， ， 縮略詞 p c r t l c m l n h d u v m s i r 縮略詞附表 英文全名 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h m i n u t e h o u r d a y u l t r a v i o l e t m a s ss p e c t r u m i n f r a r e ds p e c t r u m v i 中文名 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 薄層層析色譜 分鐘 小時(shí) 天 紫外線 質(zhì)譜 紅外光譜 - 氣 - 譬 一 i 耳 - r j l 疊 _ 文獻(xiàn)綜述 海洋占地球表面積的7 1 ，生物量約占地球生物總量的8 0 ，其中除了人類熟 知的魚、蝦、貝類等生物外，僅較低等的生物種類約2 0 多萬種，是地球上最大的資 源能源寶庫，豐富的資源有待于人們研究利用。目前人們對(duì)海洋生物的認(rèn)識(shí)仍相當(dāng)有 限，利用率僅l 左右。海洋生物的特殊生境意味著海洋生物的新陳代謝和生存繁殖 方式的特殊性，從而產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)特殊的生命活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物【啦捌。 美國(guó)是較早注意開發(fā)海洋生物資源的國(guó)家之一。上世紀(jì)六十年代初b u r k h o l d e rp r 利用哥倫比亞大學(xué)的l a m o n t 地質(zhì)觀察站建立了海洋生物學(xué)計(jì)劃1 4 】。從南極洲和地處加 勒比海熱帶波多黎各島鄰近海域采樣分離到1 5 1 株微生物【5 】。其中一株假單胞菌 p s e n d o m o n a sb r o m o u t i l i s 產(chǎn)生一種新的吡咯化合物抗生物質(zhì)，對(duì)g + 菌有很強(qiáng)的抑制作 用【6 l 。這一報(bào)導(dǎo)標(biāo)志著從海洋微生物尋找新的抗生物質(zhì)的可能性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)， 由于海洋與陸地生態(tài)環(huán)境的極大差異，使得海洋生物天然產(chǎn)物與陸地生物相比更加多 樣和豐富。海洋微生物來源新化合物數(shù)量以令人難以置信的速度被發(fā)現(xiàn)，并且不斷有 新骨架的化合物被報(bào)道例。 1 海洋微生物活性產(chǎn)物的研究進(jìn)展 劉晶晶等對(duì)2 0 0 0 年前后已報(bào)導(dǎo)的海洋微生物產(chǎn)生的重要活性物質(zhì)進(jìn)行綜述【7 1 ?，F(xiàn) 將2 0 0 0 2 0 0 4 年報(bào)導(dǎo)的細(xì)菌和放線菌產(chǎn)生新抗生物質(zhì)的簡(jiǎn)況如表1 1 所示。 表1 12 0 0 0 - 2 0 0 4 年報(bào)道的的由細(xì)菌或放線菌產(chǎn)生抗生物質(zhì)簡(jiǎn)況 t a b 1s o m en e wf o u n da n t i b i o t i c sp r o d u c e db yb 眥f i ao ra e t i n o m y c e t e sd u r i n g2 0 0 0 2 0 0 4 國(guó)內(nèi)很早就使用海洋生物治療疾病，一些中醫(yī)經(jīng)典書籍( 黃帝內(nèi)經(jīng)，神農(nóng)本 草經(jīng)，本草綱目等) 都記載了大量的生物藥，如牡蠣，珊瑚，海藻等。但從海洋 微生物中尋找抗生物質(zhì)的研究則起步較晚，黃維真等報(bào)導(dǎo)【8 1 ，在福建鼓浪嶼沿海的海 泥中分離到一株海洋放線菌魯特格鏈霉菌鼓浪嶼亞種( s 搋r u t g e r s e n s i ss u b s p g u l a n g y u n e n s i s ) ，它產(chǎn)生廣譜、低毒性的抗生物質(zhì)m i n o b i o s a m i n e 和肌醇胺霉素等，對(duì) 綠膿桿菌和一些耐藥性g 。菌具有較強(qiáng)的抗性。王書錦等【9 】在黃海、渤海、遼寧近海地 區(qū)采樣，分離至u 5 6 0 8 株海洋細(xì)菌，測(cè)定表明，約有2 5 的菌株具有不同程度的抗病原 真菌、病原細(xì)菌的能力。劉全永等【l o 】從海洋細(xì)菌l u b 0 2 q b 分離到廣譜抗真菌活性物質(zhì)， 對(duì)人和動(dòng)物條件病原菌白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 有較強(qiáng)的抑制作用。2 0 0 6 年谷 俊等【ll j 從連云港沿海海泥中分離到的一株放線菌m 3 2 4 ，其代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球 菌、綠膿桿菌等具有抗菌活性。同年崔洪霞等【1 2 】從膠州灣采集2 5 6 株鏈霉菌，對(duì)其進(jìn) 行抗菌活性的篩選，發(fā)現(xiàn)有2 2 的海洋鏈霉菌具有不同的抗性，并對(duì)m 0 9 5 的代謝產(chǎn) 物進(jìn)行分離，得到全霉素，對(duì)金黃色葡萄球菌和絲狀真菌毛霉均有顯著的抑制作用。 王瑩、吳根福報(bào)導(dǎo)【1 3 j 從東海溫州海域采樣，分離至1 j 1 9 5 株海洋細(xì)菌，篩選出2 2 株菌具 有抗菌活性。 2 0 0 2 年w o o 等1 1 4 j 從海洋鏈霉菌a 4 7 7 發(fā)酵液中得到一種1 6 0 k d 的蛋白質(zhì)s a p ，對(duì)真 菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。2 0 0 3 年r o b e r t 等【1 5 l 從夏威夷淺海淤泥中分離出一株鏈霉菌 b d 2 1 2 ，分離出一新化合物b o n a c t i n ，對(duì)g 。、g + 和真菌具有抑制作用。2 0 0 4 年r e i d i n g e r 2 等【l6 】從日本深海的海泥中分離出小單胞菌a b 1 8 0 3 2 菌株，并從代謝物中分離出新抗 生素a b y s s o m i c i n s ，對(duì)耐藥的m r s a 具有抑制活性。2 0 0 5 年i r m a 等【l 。玎從海泥中分離到 一株鏈霉菌m a r 4 ，從代謝產(chǎn)物中分離出3 種新的萜類化合物對(duì)耐藥性的m r s a 和腸 桿菌都有抑制作用。2 0 0 7 年v e n k a t 等i l8 】從關(guān)島海泥中篩選一株放線菌n p s 0 0 8 9 2 0 ，經(jīng) 鑒定屬于新屬m a r i n i s p o r a ，產(chǎn)生3 種新化合物l i p o x a z o l i d i n o n ea ，b 和c ，對(duì)葡萄球 菌等多種致病菌均有抑制活性。2 0 0 8 年k a t h e r i n e 等【1 9 】從加利福尼亞州圣地亞哥的海泥 中分離出一株新放線菌n p s l 2 7 4 5 ，從代謝產(chǎn)物中分離出一組吡咯類化合物l y n a m i c i m a e ，對(duì)g + 和g 均具有抗菌活性，尤其對(duì)耐藥性的m r s a 和腸桿菌活性較好。 相對(duì)于海洋細(xì)菌和放線菌，海洋真菌活性成分的發(fā)現(xiàn)相對(duì)稍晚，到了上世紀(jì)8 0 年代中期才開始有少量報(bào)道，第一個(gè)報(bào)道的海洋真菌抗生素是l e p t o s p h a e r i n 。2 0 0 2 年 d a f e m e r 2 0 j 從真菌z o p f i e l l al a t i p e sc b s 6 11 9 7 中得到兩個(gè)化合物z o p f i e l l a m i d e sa 、b ， 其中前者對(duì)g + 具有較強(qiáng)的抑制作用。同年j a d l l l c 0 等【2 1 】從海綿l p 廳口絕so l e m d a 分離到一 株真菌c u r v u l a r i al u n a t a ，從代謝產(chǎn)物中得到3 個(gè)化合物：c y t o s k y r i na ，a b s c i s i ca c i d 和l u n a t i n ，它們對(duì)多種細(xì)菌均有抑制作用。2 0 0 9 年e d i l i pd es i l v a t z z l 從新澤西海域分 離的真菌p e n i c i l l i u ms p 的代謝產(chǎn)物中分離到化合物p f l1 4 0 和a k a n t h o m y c i n ，前者對(duì) 枯草桿菌和白色念球菌有抗性，后者對(duì)金黃色葡萄球菌具有活性。同年k o n g l d a t t r i s u 啪n 世寸- 2 3 j 從海洋真菌m 窖加印d ，口s p p s u f 1 8 中分離b p y r o n e ，對(duì)金黃色葡萄球菌 具有抑制作用。 近年來我國(guó)對(duì)海洋真菌生物活性物質(zhì)報(bào)道逐漸增多。2 0 0 5 年趙玲玲等1 2 4 】從3 株9 f 系列海洋真菌中分離得到4 個(gè)化合物，分別是t r a n s d e h y d r o c u r v u l a r i n ，t e r r e i n ，p a x i l l i n e 和c i t r e o p y r o n e ，對(duì)稻瘟病菌p 2 2 b 均有不同程度的抑制活性。2 0 0 7 年郭江等【2 5 】發(fā)現(xiàn)海 洋真菌菌株m 4 0 1 代謝物對(duì)藤黃八疊球菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色 葡萄球菌、弗氏志賀氏菌和黑曲霉也有不同程度的拮抗作用。2 0 0 8 年譚倪等【2 6 】從南海 紅樹林內(nèi)源真菌f u s a r i u ms p # z z f 5 1 分離得到一金屬銅絡(luò)合物，該絡(luò)合物對(duì)多種細(xì)菌 和癌細(xì)胞均有抑制活性。邵長(zhǎng)倫等【2 7 】從紅樹林分離到一株內(nèi)生真菌b 7 7 。首次從海洋 真菌中分離得到的化合物3 o m e t h y l f u s a r u b i n 和f u s a r u b i n ，體外實(shí)驗(yàn)表明化合物對(duì)金 黃色葡萄球菌具有較好抑制活性。 我國(guó)已將開發(fā)海洋生物資源列入國(guó)家自然科學(xué)基金和8 6 3 計(jì)劃項(xiàng)目。還有沿海省 區(qū)和有關(guān)機(jī)構(gòu)及高等院校也投入相當(dāng)?shù)馁Y金。本實(shí)驗(yàn)室從廈門海域采樣，篩選具有抗 菌活性的海洋微生物，分離到一株具有抗菌活性的海洋小鏈霉菌。 2 海洋微生物活性產(chǎn)物研究意義 目前已發(fā)現(xiàn)的抗生素有三分之二來自于放線菌1 2 8 1 ，因此在海洋放線菌中尋找新型 抗菌活性物質(zhì)成為目前研究的熱點(diǎn)1 2 9 , 3 0 1 。海洋的特殊環(huán)境如高壓、高鹽、低溫、貧營(yíng) 養(yǎng)或無光照等，這些造就了海洋微生物菌群的特異性，使其能夠產(chǎn)生不同于陸生微生 物的活性物質(zhì)。在近年的研究中，已有近萬種新的海洋天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，這些海洋天然 產(chǎn)物具有抗菌、抗氧化、細(xì)胞毒活性、免疫調(diào)節(jié)等作用，已成為當(dāng)今世界新藥研發(fā)的 熱點(diǎn)。有的藥物已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段或已進(jìn)入臨床，并取得了豐碩的成果【3 。各國(guó)學(xué) 者正夜以繼日的從海洋微生物中分離具有抗菌抗腫瘤等的活性物質(zhì)，近年國(guó)內(nèi)海洋微 生物代謝產(chǎn)物研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)和新活性化合物的研究報(bào)道也 明顯增多【3 2 , 3 4 1 。2 1 世紀(jì)，海洋必將成為尋找新藥的重要藥庫。 與此同時(shí)，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性是自然界的生物現(xiàn)象，每一種抗生素進(jìn)入臨床 后往往伴隨著耐藥性產(chǎn)生。正常的敏感菌株也可通過變異或者基因轉(zhuǎn)移而獲得耐藥性 【3 5 】。長(zhǎng)期用藥，亂用和不合理的用藥可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。多重耐藥菌的出現(xiàn)， 如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌、耐青霉素的肺炎鏈球 菌、耐萬古霉素的腸球菌等，給人類健康帶來極大的威脅。在我國(guó)，2 0 0 1 年住院感染 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌的檢出率高達(dá)3 7 4 和 3 3 8 f 3 6 j 。目前嚴(yán)重的耐藥情況除了應(yīng)該規(guī)范合理用藥以外，還應(yīng)加快新的抗生素研 發(fā)。由于全球化一體化進(jìn)程和城市化進(jìn)程，帶來人口流動(dòng)加劇，更容易導(dǎo)致感染性疾 病的全球蔓延。近來非典型性肺炎和h 5 n 1 流感病毒就是兩個(gè)典型的例子。由于近年 來從海洋微生物篩選出新的活性化合物的幾率相對(duì)較高，因此致力于研究海洋微生物 活性產(chǎn)物顯得意義重大。 3 海洋微生物活i | 生產(chǎn)物的研究方法 3 1 海洋微生物活性物質(zhì)分離篩選方法 3 1 1 高通量篩選法 從不同海域采集的大量生物和非生物樣品，必須經(jīng)過分離才能得到各種微生物菌 株，對(duì)這些微生物菌株需要進(jìn)行大通量的活性篩選以得到產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的活性菌 株。這需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力才有可能得到有價(jià)值的菌株，因此需要建立一套行 之有效的快速分離篩選方法，目前常用快速有效的自動(dòng)化高通量藥物篩選方法( h t s ) 或快速分子篩選方法進(jìn)行篩選。高通量篩選是目前藥物篩選的主流技術(shù)，它是以多孔 板為載體，用高密度、微量自動(dòng)化加樣的方法，快速和平行地測(cè)試標(biāo)靶對(duì)化合物的結(jié)合 能力或生物學(xué)活性將高通量篩選技術(shù)運(yùn)用于放線菌次生代謝產(chǎn)物的篩選，可極大地 4 提高篩選效率，加速發(fā)現(xiàn)新先導(dǎo)化合物的進(jìn)程所以可利用h t s 技術(shù)研究先導(dǎo)化合物 和衍生物的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、毒性和作用機(jī)理，很快確定治療藥物的候選物，提高藥物研制 和開發(fā)的效益【3 7 娜1 。h t s 常用篩選模型有抗氧化模型【3 9 】，乙酰膽堿脂酶( a c h e ) 抑制劑 模型j ，一氧化氮合酶( n o s ) 抑制劑實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀? 1 1 ，晚期糖基化終產(chǎn)物( a g e s ) 模型等。 3 1 2 宏基因組篩選新活性物質(zhì) 4 2 , 4 3 】 i 白d a v i e s 等所創(chuàng)導(dǎo)的宏基因組工程技術(shù)】，為h a n d e l s m a n 等【4 5 】系統(tǒng)歸納后，提出 了宏基因組( m e t a g e n o m e ) 的概念，泛指某一自然環(huán)境中全部微生物的基因組群。其研 究策略克服了絕大多數(shù)環(huán)境微生物難于通過一般實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的現(xiàn)實(shí)。宏基因組藥 物研究平臺(tái)，是將海洋某個(gè)小的生態(tài)系統(tǒng)中的全部基因組，通過基因工程的方法克隆 到可培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中，建立宏基因組文庫。文庫中包含該小生態(tài)系統(tǒng)中微生物( 可 培養(yǎng)的和非可培養(yǎng)的微生物) 全部基因，從而在該文庫中篩選活性物質(zhì)和以及相關(guān)基 因，克服了微生物培養(yǎng)的難題，擴(kuò)展了微生物資源的利用空間，增加了獲得新的生物活 性物質(zhì)的機(jī)會(huì)l 鍘。 3 1 3 其他篩選方法 隨著對(duì)研究的深入，不斷出現(xiàn)新的篩選方法。定向篩選可以篩選到高度選擇性的 低毒性的抗生素，克服病原菌的耐藥性。楊雋等人以脂磷壁酸為靶點(diǎn)的新抗篩選模型 篩選與糖肽類抗生素?zé)o交叉耐藥性的新抗生素【4 7 】，依此模型，從1 2 0 0 株放線菌中篩 選出2 株陽性菌株。還有以幾丁質(zhì)酶為靶標(biāo)篩選其抑制劑來篩選抗真菌藥物，以支原 體模型來篩選作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的抗生素。而化學(xué)篩選【4 8 】是基于這樣的一個(gè)假說：新 結(jié)構(gòu)的化合物必然有令人感興趣的生物活性。對(duì)大量化合物通過簿層色譜建立數(shù)據(jù) 庫，然后對(duì)未知的化合物的薄層色譜( t l c ) 輸入數(shù)據(jù)庫予以分析。 3 2 海洋微生物天然活性物質(zhì)走向產(chǎn)業(yè)化的難題【4 9 】 一種新化合物的發(fā)現(xiàn)需要付出大量的前期工作積累，而一種新化合物要從實(shí)驗(yàn) 室，走向產(chǎn)業(yè)化更需要付出幾年甚至幾十年的不懈努力。僅臨床前研究，實(shí)驗(yàn)室研究 階段就面臨著產(chǎn)活性新化合物的各種海洋微生物不易培養(yǎng)和有效成分含量偏低，活性 成分不易萃取分離純化等一系列的難題。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，目前可培養(yǎng)的海洋微生物僅 占全部海洋微生物的1 ，這些可培養(yǎng)的海洋微生物又面臨著菌種退化，基因突變等 一系列難題。在人工培養(yǎng)條件下，生物的生長(zhǎng)環(huán)境與海洋源生態(tài)環(huán)境差異巨大，經(jīng)過 若干代繼代培養(yǎng)或長(zhǎng)時(shí)間菌種保存，某些活性菌株可能不再產(chǎn)生的活性化合物。海洋 微生物次生代謝產(chǎn)物的含量偏低，這將不利于今后工業(yè)化生產(chǎn)。再者，微生物發(fā)酵產(chǎn) 物成分相當(dāng)復(fù)雜，如何從復(fù)雜體系中高效大批量的萃取、分離、純化目標(biāo)活性化合物 也是目前面臨的難題。這些都直接影響到新的活性化合物的應(yīng)用前景和工業(yè)化道路。 目前，可采用一系列生物技術(shù)和化學(xué)合成方法如基因工程、發(fā)酵工程，有機(jī)合成等來 解決新藥研發(fā)過程臨床前研究中所面臨的問題，從而縮短從實(shí)驗(yàn)室到產(chǎn)業(yè)化的過程。 4 海洋微生物活性產(chǎn)物的開發(fā)和應(yīng)用展望 隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人類在醫(yī)學(xué)方面的研究已經(jīng)深入到分子 領(lǐng)域，然而新的感染性疾病的發(fā)生及耐藥菌株的大量的出現(xiàn)，成為嚴(yán)重威脅人類健康 的殺手。人類目前的最后一道應(yīng)對(duì)嚴(yán)重感染新疾病的抗生素萬古霉素也受到了耐 藥菌株的挑戰(zhàn)。面臨此種境地，人類不得不尋求新的抗生素來以應(yīng)對(duì)不斷產(chǎn)生的耐藥 菌株。然而，傳統(tǒng)抗生素來源陸地土壤中的放線菌，已經(jīng)被人類利用殆盡。人類 不得不尋找新的藥物來源，2 0 世紀(jì)6 0 年代來自海洋的新發(fā)現(xiàn)，打開了尋找新的活性化 合物的大門，人們將目光著眼于廣袤的海洋，“下海 成為各國(guó)學(xué)者熱衷的研究議題。 雖然最近幾十年從海洋中發(fā)現(xiàn)了很多天然活性物質(zhì)，然而這僅僅是冰山一角。海洋中 存在著令人難以估量的生物資源和藥用資源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前可被培養(yǎng)的海洋微生物僅 占全部海洋微生物總數(shù)的1 ，絕大多數(shù)的海洋微生物仍然不被人們所了解。他們是 否產(chǎn)生新的活性物質(zhì)? 是否產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)人類疾病特別是目前醫(yī)學(xué)難題的 疾病存在著特效? 帶著這些疑問和美好憧憬，全球各國(guó)的研究人員正夜以繼日的研 究、開發(fā)和利用海洋微生物資源，以期獲得對(duì)人類進(jìn)步和健康事業(yè)具有深遠(yuǎn)影響的新 化合物。令人欣慰的是各國(guó)政府對(duì)海洋微生物資源的研究和開發(fā)經(jīng)費(fèi)支持正在逐年增 加，全球醫(yī)藥巨頭也“虎視眈眈”投入巨資進(jìn)行研發(fā)，加快新化合物的發(fā)現(xiàn)和新藥的 研發(fā)。海洋的獨(dú)特生態(tài)環(huán)境造就了許多結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物并包含了新的活性功能。 未來，研究的方向?qū)②呄蛴趯?duì)目前不可培養(yǎng)的微生物領(lǐng)域；人工條件下模擬海洋原生 態(tài)環(huán)境；活性產(chǎn)物的大通量篩選模型的建立和全天候自動(dòng)化的篩選等領(lǐng)域。形成多學(xué) 科相互滲透，聯(lián)合攻關(guān)，并促進(jìn)產(chǎn)學(xué)研一體化，使得海洋微生物天然產(chǎn)物的開發(fā)、應(yīng) 用進(jìn)入新天地。 6 1 引言 1 1 研究意義與理論依據(jù) 目前，許許多多的來自鏈霉菌的抗生素被發(fā)現(xiàn)，而且這些發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為僅僅是冰山 一角1 5 。這說明在今后需要繼續(xù)進(jìn)行深入研究。對(duì)于抗生素的研究，最重要的是探索 可能發(fā)現(xiàn)潛在有用生物新領(lǐng)域【5 1 1 。在發(fā)展中國(guó)家，感染性疾病仍然是導(dǎo)致高發(fā)病率和 死亡率的健康問題【5 z ，釘j 。放線菌，尤其是鏈霉菌屬被廣泛報(bào)道產(chǎn)生這些用于治療的抗 生素 5 4 - 5 6 1 。約有7 0 的已知藥品來源于放線菌，這其中約有7 5 和6 0 分別用于醫(yī)藥 和農(nóng)業(yè)。從陸地上發(fā)現(xiàn)放線菌產(chǎn)生的新化合物幾率逐漸減小，而已知化合物的重復(fù)發(fā) 現(xiàn)率在逐漸增加【5 7 j 。因此，把來源于原始棲息地新的放線菌群體作為探索新穎具有生 物活性次生代謝產(chǎn)物的來源變的至關(guān)重要。從2 0 世紀(jì)6 0 年代開始，人們的視線逐漸從 陸地轉(zhuǎn)向海洋。 海洋微生物已經(jīng)為研究天然產(chǎn)物新的專題。由于海洋環(huán)境條件與陸地環(huán)境極不相 同，加之海洋環(huán)境的極端性特點(diǎn)。因而，可能會(huì)產(chǎn)生不同類型生物活性化合物。海洋 放線菌成為日益受到重視的新生物活性次生代謝產(chǎn)物的潛在來源。近年來不斷有新的 海洋菌種及其產(chǎn)生新的抗菌物質(zhì)的報(bào)道【5 8 , 5 9 , 6 0 。海洋生物資源正在成為一個(gè)正在開發(fā) 的重要資源【6 。僅在過去1 0 年間，就有近5 0 0 0 種新的海洋天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，而大多數(shù) 都分離白海洋微生物。美國(guó)、俄羅斯、日本、中國(guó)及歐洲等國(guó)家均致力于海洋資源的 開發(fā)，并發(fā)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)新穎、抗菌效果顯著的抗菌物質(zhì)。在此背景下，本研究主要探 討作為新型抗生素可持續(xù)來源的海洋放線菌的分離純化，鑒定，培養(yǎng)條件優(yōu)化，抗菌 物質(zhì)的分離純化和鑒定。 1 2 本研究擬解決的問題 采用稀釋平板離法對(duì)從廈門海域采集的各種生物及非生物樣品進(jìn)行分離、純化和 保藏各種海洋微生物。對(duì)分離出的海洋微生物進(jìn)行抗菌活性篩選，并對(duì)各類樣品中分 離出的活性菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析不同樣品( 不同生態(tài)位點(diǎn)) 的活性菌株分布特點(diǎn)。為 今后進(jìn)一步研究和開發(fā)利用海洋微生物資源提供第一手資料。 對(duì)篩選出的一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌進(jìn)行菌種鑒定，優(yōu)化培養(yǎng)基組分 和發(fā)酵條件，并對(duì)其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行研究，通過發(fā)酵培養(yǎng)，提取、分離、 純化、鑒定其抗菌活性物質(zhì)的成分。 7 2 材料與方法 2 1 材料 2 1 1 儀器設(shè)備與試劑 ( 1 ) 儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái) t d l 4 z a 臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) t d l l s s o s i i 立式壓力蒸汽滅菌器 數(shù)顯培養(yǎng)箱 分析天平 渦旋儀 p h s 3 c 型p h 計(jì) p c r 擴(kuò)增儀 電泳儀 凝膠成像系統(tǒng) 紫外分析儀 r e 5 2 c 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 n a s 1 2 氮吹儀 q p 5 0 5 0 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 n i e o l e t8 7 0 0 傅里葉紅外光譜儀 上海智城分析儀器制造有限公司 上海安亭科學(xué)儀器廠 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 上海智城分析儀器制造有限公司 德國(guó)賽多利斯s a r t o r i u s 林其貝爾 上海雷磁儀器廠 a b i 北京六一儀器廠 上海山富科學(xué)儀器 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