（微生物學專業(yè)論文）水環(huán)境中微囊藻毒素的微生物降解研究.pdf

碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 摘要 水環(huán)境中微囊藻毒素( g y c r o c y s t i n s ，m c ) 的微生物降解是水環(huán)境m c 消 除的主要途徑之一。目前分離純化的m c 降解菌還較少，且都是好氧菌，對水 體底層和底泥中進行的m c 厭氧降解的過程和機理的了解還非常缺乏。因此本 研究通過優(yōu)化天然水華藍藻中m c 提取方法，獲得足夠的m c 進行實驗，重點 分析m c 在水體中的好氧和厭氧降解速率，并從中國不同富營養(yǎng)化水體和底泥 中分離主要降解菌特別是厭氧降解菌。 本研究首先對采自武漢東湖水華藍藻細胞中m c 的提取方法進行優(yōu)化。比 較了不同極性提取劑對m c 的提取效果，結果表明，5 乙酸溶液能最大限度地 從藻細胞中提取出m c ，而4 0 9 6 甲醇溶液相對與8 0 甲醇溶液和1 0 0 甲醇能夠 有效地從藻細胞中提取藻毒素異構體。本實驗采用連續(xù)抽提法( 先用5 乙酸溶 液，然后用4 0 甲醇溶液) 能最有效地從藻細胞中提取出藻毒素m c - r r 和m c l r ， 同時可省去調p h 法去除藻膽蛋白的步驟，使整個提取過程更加簡捷、快速。 從富營養(yǎng)化水體中分離得到多株優(yōu)勢菌，各種優(yōu)勢菌株對m c 都有一定的 降解能力，說明m c 降解菌是廣泛存在的。優(yōu)勢菌株w - 2 號菌在不同m c 濃 度下，降解效率是不同的：在低濃度下( m c2 m g l 1 ) 有較強的降解能力，七 天內可降解6 3 。5 ；當m c 濃度為1 0m g l - 1 時，降解效率降低，七天僅降解 3 0 左右；在更高濃度下基本表現(xiàn)無降解能力。結果表明，在相同條件下，不 同m c 濃度下w - 2 號菌的降解效率是不同的，且濃度越低，降解越快，較高濃 度的m c 可能對細菌的生長有一定的抑制作用，進一步降低其降解能力。實驗 過程發(fā)現(xiàn)底泥微生物菌群比表層水體中微生物菌群對m c 有更強的降解能力。 通過分析分析了厭氧條件下中國1 1 處湖泊底泥中的微生物對m c 的降解， h p l c 分析結果顯示降解途徑多樣化。底泥釋放到水中營養(yǎng)( t n 、t p 、c o d ) 與降 解能力成正相關。m c 的降解主要與厭氧降解菌有直接關系，菌的生長及微生 物種類、數(shù)量的不同都直接影響m c 的降解轉化。通過厭氧菌篩選實驗，我們 首次分離到一株具有較強降解能力的兼性厭氧細菌d 7 1 菌，經鑒定為腸桿菌 科，變形菌屬。 關鍵詞i 水華、微囊藻毒素、提取、好氧、厭氧、底泥、微生物降解 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t b i o d e g r a d a t i o no fm i c r o c y s t i n s ( m c ) b ym i c r o o r g a n i s m si so n eo ft h em a i n w a y so fm c r e m o v a li na q u a t i ce n v i r o n m e n t u pt on o w m c d e g r a d i n gb a c t e r i a i s o l a t e df r o ms u r f a c ew a t e ra r ea e r o b i c t h ep a t h w a y sa n dm a i n s p e c i e si n v o l v e di n t h ea n a e r o b i cd e g r a d a t i o no fm ca tb o t t o ma n ds e d i m e n t so fw a t e rb o d i e sa r es t i l l p o o r l yu n d e r s t o o d t h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d yi s t oo p t i m i z et h em ce x t r a c t i o n m e t h o df r o mn a t u r a lb l u e - g r e e na l g a lb l o o mt oo b t a i ns u f f i c i e n ta m o u n to fm cf o r t h e e x p e r i m e n t s , a n dt os t u d yt h eb i o d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y u n d e ra e r o b i ca n d a n a e r o b i cc o n d i t i o n s ，a n dt oi s o l a t et h em a i nd e g r a d a t i n gb a c t e r i a , e s p e c i a lt h e a n a e r o b i cb a c t e r i a , f r o me u t r o p h i c a t e dw a t e rs a m p l e sa n ds e d i m e n t sf r o mc o l l e c t e d f r o md i f f e r e n tl o c a t i o n so fc h i n a t h ee x t r a c t i o nm e t h o do fm cf r o mb l u e g r e e na l g a lb l o o mw a s o p t i m i z e di n t h i ss t u d y b yc o m p a r i n gd i f f e r e n ts o l v e n t sa n de x t r a c t i u nt i m e 5 a c e t i ca c i dw a s f o u n dt ob ea no p t i m u ms o l v e n tf o re x t r a c t i n gm c r r ，t h ec o n t i n u o u se x t r a c t i o n m e t h o dc o u l do b t a i nm o r em c - r ra n dm c - l rf r o mc y a n o b a c t e r i a lc e l l st h a nt h e o t h e rm e t h o d s t h ep h y c o b i l i p r o t e i n si ne x 仃a c ts o l u t i o n ，w h i c hh a v i n gn e g a t i v e e f f e c t so no d s ( c l s ) c a r t r i d e g e s w a sr e m o v e db y5 a c e t i ca c i ds o l v e n t sd k e a l y , a n d b y t h i sm e t h o dt h e s t e p o f a d j u s t i n g t h e p ho f s o l v e n t st or e m o v e p h y c o b i l i p r o t e i n s c a nb eo m i t t e d d o m i n a n tb a c t e r i as e p a r a t e df r o me u t r o p h i c a t e dw a t e rs a m p l e ss h o w e dm c d e g r a d a t i o na b i l i t y t h i s i n d i c a t e st h a tm cd e g r a d a t i o ni s w i d e l yo c c u r r e di n a q u a t i ce n v i r o n m e n t d o m i n a n tb a c t e r i u mw - 2 w a si s o l a t e da n ds h o w e dd i f f e r e n t d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c i e su n d e rd i f f e r e n tm c c o n c e n 仃a t i o n s i nl o wc o n c e n t r a t i o n ( m c2 m g l 1 ) i ts h o w e dh i 【g h e rd e g r a d a t i o na b i l i t ya n dc o u l dd e g r a d e6 3 5 o f m ci n7d a y s ；w h e nm ci s1 0m g l 1 ，t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yd e c l i n e d ，a n di t o n l yd e g r a d e d3 0 o f m ci n7 d a y s ；a n dw h e nm c c o n c e n t r a t i o n sw a s h i g h e rt h a n 1 0m g - l 1 ，i ts h o w e d n o d e g r a d a t i o na b i l i t y t h er e s u l tm a y d u et ot h ei n h i b i t i o no f b a c t e r i ag r o w t ha th i 曲m cc o n c e n t r a t i o n s i tw a sf o u n dt h a tt h es e d i m e n tm i c r o b e s 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s h a v eh i g l l e rm c d e g r a d a t i o na b i l i t yt h a n t h a to ft h ew a t e rc o l u m n m c d e g r a d a t i o nu n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o no fs e d i m e n t sc o l l e c t e df r o me l e v e n l a k e so fc h i n aw a s i n v e s t i g a t e d h p l cc h r o m a t o g r a m ss h o w e d d i v e r s e p a t h w a y so f m c d e g r a d a t i o n 。t h ed e g r a d a t i o n o fm cs h o w e d p o s i t i v er e l a t i o n s h i pw i t ht n ，t p , a n dc o do ft h es e d i m e n t s t h ed i f f e r e n c e so fg r o w t h ，s p e c i e sa n dc e l ld e n s i t yo f b a c t e r i ad i r e c t l yc o r r e l a t e dw i t ht h ed e g r a d m i o na n dt r a n s f o r m a t i o no fm c i nt h i s s t u d y t h ef i r s ta n a e r o b i cm c d e g r a d i n gb a c t e r i u m ( d 7 - 1 ) w a si s o l a t e da n d p u r i f i e d ， a n dw h i c hw a si d e n t i f i e da sp r o t e u s s p fe n t e r o b a c e r i a c e a e ) k e y w o r d s ：b l o o m ，m i c r o c y s t i n s ，e x t r a c t ， a e r o b i c , a n a e r o b i c ，s e d i m e n t ， b i o d e g r a d a t i o n 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 華中師范大學學位論文原創(chuàng)性聲明和使用授權說明 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所 取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不含任何其他個人或集體已經發(fā)表 或撰寫過的作品或成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確 方式標明。本聲明的法律結果由本人承擔。 論文作者簽名 孝枷 日期：口d 年g 月? 日 學位論文版權使用授權說明 本人完全了解華中師范大學關于收集、保存、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權 保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本 人授權華中師范大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可 以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。 保密論文在解密后遵守此規(guī)定。 論文作者繇考杉 日期：凇年月；日 導師簽名： 日期：諺 日 本人已經認真閱讀“c a l i s 高校學位論文全文數(shù)據(jù)庫發(fā)布章程”，同意將本人的學 位論文提交“c a l i s 高校學位論文全文數(shù)據(jù)庫”中全文發(fā)布，并可按“章程”中規(guī)定享 受相關權益。旦壺i 盒毫理塞巨澄廈：旦圭生i 旦= 生i 旦三生苤杰 論文作者簽名： 日期：年月 日 導師簽名： 日期：年月 日 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 第一章文獻綜述 1 微囊藻毒素的基本特性和毒性機理 1 1 藍藻水華及其毒素的危害 水環(huán)境與人類生活有著非常緊密的聯(lián)系，人們很早就對藻類水華有了初步 的認識。在1 2 世紀末，g i r a l d u sc a m b r e n s i s 就描述了英國威爾士附近l l a n g o r s 湖水變?yōu)樯罹G色的現(xiàn)象。后來，在北愛爾蘭、北美等地又陸續(xù)有類似的報道。 這些早期記錄中指出了水華發(fā)生時水體的顏色變化、氣味難聞等方面的影響。 但直到1 8 7 8 年f r a n c i s 首次報道了澳大利亞南部動物由于飲用含藍藻的水而死 亡的事件【i 惦，它們的危害才被真正認識到。此后，由于水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象目 益加劇，藍藻水華的發(fā)生越來越頻繁，世界各地藍藻毒素引起各種動物甚至人 類中毒的事件也隨之增多。研究表明世界各地2 5 7 0 的藍藻水華可產生毒素， 而在某些種類的藍藻引起的水華中，藻類產毒比例甚至更高。 藍藻毒素使各種哺乳動物、魚類、鳥類中毒甚至死亡，對畜牧業(yè)和水產養(yǎng) 殖業(yè)造成很大的經濟損失，更嚴重的是，它熊夠通過多種方式影響人類自身的 健康。如皮膚接觸含藻毒素水體可引起敏感部位( 如眼睛) 和皮膚過敏；少量 喝入可引起急性腸胃炎；長期飲用則可能引發(fā)肝癌。流行病學調查表明，我國 江蘇海門、啟東和廣西扶綏地區(qū)的原發(fā)肝癌發(fā)病率高與當?shù)鼐用耖L期飲用含微 量微囊藻毒素的淺塘水和河流水有關【2 】o1 9 9 6 年巴西一個血液透析中心由于使 用被藍藻毒素污染的水造成1 2 6 人中毒，其中六十人死亡的事件，更是引起舉 世矚目【3 】o 另外，雖然某些浮游動物和魚類對藍藻毒素有較大的耐受性，但毒 素?？稍谄潴w內存留和富集，因此，通過生態(tài)系統(tǒng)和食物鏈以間接方式給人類 帶來潛在威脅也不容忽視。 多種藍藻能產生有毒物質，在它的5 0 多個屬中，至少有2 0 個屬的5 0 多 個種可以產生毒素，其中研究較多的主要有微囊藻屬( m 2 c r o c y s t i s ) 、魚腥藻 屬( a n a b a e n a ) 、顫藻屬( o s c i l l a t o r i a ) 、念珠藻屬( n o s t o c ) 、鞘絲藻屬 ( l y n g b y a ) 和束絲藻屬( a p h a n i z o m e n o n ) 等。藍藻產生的毒素，多為次生代 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 謝物，分為四種1 4 j ：神經毒素( n e u r o t o x i n s ) 、肝毒素( h e p a t o t o x f n s ) 、脂多 糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s ，l p s ) 和非專性毒素( n o n - s p e c i f i ct o x i n s ) 。其 中肝毒素在淡水藍藻中最常見，可由微囊藻、魚腥藻、節(jié)球藻、念珠藻、顫藻 等產生，主要有微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n ，m e ) 、節(jié)球藻毒素( n o d u l a r i n ) 和簡胞藻素( c y l i n d r o s p e r m o p s i n ) 三種。其中，微囊藻毒素分布最廣，對人 類危害也最大，因此是所有藍藻毒素中研究得最為詳細的。 在已發(fā)現(xiàn)的各種藻毒素中，m c 是一類在藍藻水華中出現(xiàn)頻率最高、產生 量最大和造成危害最嚴重的藻毒素。m c 是藻細胞內毒索，當藻細胞衰老、死 亡后，毒素被釋放到水體中。大面積嚴重的藻類水華發(fā)生會使水體中的毒素濃 度達到m g l - 1 水平1 5 ，部分毒素還隨藻細胞和懸浮物沉淀進入沉積物中，有 報道指出底泥中的毒素可達1 3 2 紅g l - 1 1 6 。同時，環(huán)境中的m c 對魚類、水 鳥、家禽及牲畜也具有明顯的毒性效應。因此，m c 對人和動物的飲用水安全、 以及水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定均已構成嚴重的威脅。我國近年的調查顯示：除了“三 湖”( 滇池、太湖、巢湖) 已出現(xiàn)嚴重污染，長江、黃河中下游許多水庫、湖 泊以及養(yǎng)殖水體也檢測出m c ，因此水體m c 污染已成為我國以及許多其它國 家水環(huán)境的突出問題之一p ，8 j 。 1 2 m c 的理化性質 m c 是一組七肽單環(huán)肝毒素，相對分子質量都在1 0 0 0 左右i l 川，其一般結 構( 見圖1 ) 為環(huán)( - d a l a x - d m a s p z - a d d a d g u m d h a 一) ，其中m a s p 為d - 赤一 1 3 甲基天冬氨酸，a d d a 為( 2 s ，3 s ，8 s ，9 s ) 3 一氨基b 甲氧基一2 ，6 ，8 一三甲基一1 0 一苯 十基一4 ，6 一二烯酸，m d h a 為n 脫氫丙氨酸，r 1 、r 3 為兩種可變的l 氨基酸。 由于r 1 、r 3 的2 個i ，氨基酸的不同及m a s p 和m d h a 的甲基化去甲基化產生 的差異( 如圖r 2 、r 4 的變化) ，可以形成多種不同的異構體，到目前為止已 發(fā)現(xiàn)6 0 多種m c 1 1 1 。其中含量較多，存在較普遍，毒性較大的是l r 、r r 和 y r ，其中l(wèi) 、r 、y 分別代表l e u ( 亮氨酸) 、a r g ( 精氨酸) 和t y r ( 酪氨酸) ( 如圖1 1 。銅綠微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) 、魚腥藻( a n a b a e n a ) 和顫藻 ( o s c i l l a t o r i a ) 等是產生m c 的主要藻類。研究發(fā)現(xiàn)特殊氨基酸m d h a 甲基化 后形成m d h b ，其m d h b ，m c 與m d h a m c 的毒性相似，說明m d h a 對m c 的活 性沒有大的影響【1 0 】。而有人發(fā)現(xiàn)a d d a 的c 一4 和c 一6 為e 型對m c 的毒性是必 2 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 需的，當它們變?yōu)閦 型時，其抑制蛋白磷酸酶的活性比原來低1 0 5 倍，即a d d a 結構改變則毒性喪失，證明a d d a 對m c 的活性是必需的f 8 , 1 3 。 m c y s t - y r ；r 一t y r 也* g h r ，= 田；r 4 = c m c y s t - l r ；r 1 = l e u 嘞i c h a ；r ，t 帕：r = c ：h 3 m c y s t r r ；r 1 t 叼。c h i ；心- 喁r 一g h = 3 ( m w - 1 0 4 4 ) f m w = 9 9 4 ) ( m w 一1 0 3 7 l 圖1m c 的分子結構及三種主要m c 的異構體組成 f i g 1 m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f m i e r o c y s t i n sa n dv a r i a n t sc o m p o s i t i o no ft h r e ek i n d so fm c s 從m c 的分子結構可看出，由于環(huán)狀結構和間隔雙鍵，所以m c 具有較強 的穩(wěn)定性。m c 易溶解于水，在水中的溶解度達l g l - 1 以上。由于m c 分子 結構含有羧基、氨基和酰氨基，所以在不同p h 下，m c 有不同的離子化傾向。 m c u t 的正辛醇水分配系數(shù)( 1 0 9 ko w ) 從p h 為1 的2 1 8 降到p h 為1 0 時的 1 7 6 ，因此在爆發(fā)水華時的高p h ( 8 ) 條件下，m c 的生物富集較小【9 ，1 。 1 3m c 的病理與毒理學效應 早期就有報道m(xù) c 具有高毒性，其作用的主要靶器官是肝臟，m c 可從血 液中轉移到肝臟。主要表現(xiàn)為使肝臟充血腫大，嚴重時可導致肝出血和壞死。 其致毒機理是通過與蛋白磷酸酶中的絲氨酸蘇氨酸亞基結合，抑制其活性， 從而誘發(fā)細胞角蛋白高度磷酸化，使哺乳動物肝細胞微絲分解、破裂和出血， 使肝充血腫大，動物失血休克死亡。另外，由于蛋白磷酸酶的活性受到抑制， 這樣就相對增加了蛋白激酶的活力，打破了磷酸化和脫磷酸化的平衡，從而促 進t q 瘤的發(fā)生 1 5 , 1 6 。m c l r 對小臼鼠的半致死量l d 5 0 在3 6 到1 2 2u g k 9 1 之間。 m c 的中毒表現(xiàn)隨動物的大小、種類和毒索的劑量不同而有差異。牛和羊 中毒后可能表現(xiàn)出疲憊、反應遲鈍、呼吸加快、發(fā)熱、心動過速、臨死時發(fā)自 m 雅a s t 雛e r s 黻t h e s 。 等癥狀。而鳥類則表現(xiàn)出不安、眼球閃爍、通便、陣發(fā)性痙攣等。在實驗室中， 小白鼠或兔子的中毒癥狀主要是厭食、腹瀉、嘔吐、顫抖、虛弱直至死亡【1 4 16 1 。 肝臟是m c 主要的靶器官。它極易從血液中轉移到肝臟，在肝臟中依賴膽 酸轉運系統(tǒng)才能進入細胞，因而它的毒性有高度的肝特異性。解剖觀察發(fā)現(xiàn)肝 內出血，使肝重明顯增加至原來的二到三倍，肝臟顏色通常呈深紅色。電鏡觀 察顯示細胞超微結構已明顯改變：線粒體膨脹，有囊泡形成，粗面內質網伸展， 并發(fā)生卷曲，竇狀結構減少，橋粒連接絲消失，整個細胞骨架發(fā)生變化【1 7 - ”】。 1 9 9 0 年，m a c k i n t o s h 等人首次發(fā)現(xiàn)m c 能特異性地與蛋白磷酸酶p p l 和 p p 2 a 的絲氨酸，蘇氨酸亞基結合，從而抑制它們的活性。它可能通過抑制蛋 白磷酸酶的活性，使細胞內的中間絲和微絲因過量磷酸化而解聚，導致肝細胞 收縮分離，竇狀隙結構喪失，大量血液進入肝組織，肝充血腫大，動物失血休 克死亡。另外，由于p p l 和p p 2 a 活性受到抑制，相對增加了蛋白激酶c 的活 力，打破了磷酸化與脫磷酸化的平衡，從而引發(fā)細胞一系列生理病理變化。某 些蛋白的磷酸化可解除對細胞增殖的正常抑制作用，促進腫瘤的生長。這可能 是m c 促癌或致癌的途徑。除了對蛋白磷酸酶p p l 和種2 a 的抑制作用外，有 人認為m c 的肝毒性還通過以下兩種作用表現(xiàn)：激活肝細胞內核酸內切酶而 損害d n a ，引起d n a 鏈的無規(guī)律斷裂；脂質過氧化引起的氧化損傷作用 1 2 1 2 2 。 m c 對魚類的影響因魚的種類和研究方法的不同而有很大差異。在實驗室 中，對魚類進行腹腔注射或強迫灌流都可使魚肝臟細胞大量壞死，并引起死亡。 b a g a n z 等考察毒素對斑馬魚的影響指出，長期暴露在微囊藻毒素中會對魚的習 性和繁殖造成不利影響【馴。很多研究者都曾在實驗室用藍藻提取液或純微囊藻 毒素做實驗，觀察它們對浮游動物的作用，其中水蚤是研究得最多的。大多數(shù) 結果表明，微囊藻毒素對它有一定的毒害作用，如不懷卵、降低攝食率，甚至 死亡【2 4 , 2 5 】。但m a t v e e v 用產毒的銅綠微囊藻喂食水蚤卻沒有觀察到毒害影響 【2 6 】。 由于m c 對蛋白磷酸酶有強烈的抑制作用，它對高等植物的生長生理有明 顯的影響，如抑制幼芽的生長，影響根系的發(fā)展等【2 7 】。k u r k i h e l a s m o 研究了 對芥菜的研究表明，在芥菜種子的發(fā)育過程中，培養(yǎng)基中5 oug m l l 的m c r r 4 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 即可造成其發(fā)育畸形，i c 5 0 為0 8 a g m l 11 2 剮。另外，m c 對某些高等植物的光 合作用也有抑制作用【2 9 】。 1 4m c 的監(jiān)測及其安全性控制 當藍藻細胞死亡或破裂時，其中的毒素就會釋放出來。m c 的環(huán)形短肽結 構非常穩(wěn)定，而且特殊的氨基酸成分也使它不易被分解。多項實驗證明，無論 是在藻細胞中，還是在水中，它都能存留相當長的時間，常規(guī)的飲水消毒處理 也不能完全消除其中的毒素【3 0 l 。在天然的水體中，某些細菌有降解肝毒素的能 力，釋放到水中的毒素兩星期后被這些細菌降解，但一個月后仍有小部分殘留 在水中【3 ”。經自來水廠滅菌處理后，水中細菌數(shù)量減少，微囊藻毒素的滯留時 間可能會更長。 由于完全消除m c 尚有一定困難，各國對它的監(jiān)測和管理就更加重視了。 目前的工作主要分為以下兩個方面： 第一，對水體的監(jiān)測。這一監(jiān)測主要針對飲用水和娛樂用水f 如：游泳、 劃船等) ，運用下文所提到的檢測及分析方法，對水體中所含m c 的類型、性 質、濃度和毒力等進行測試。另外，將這一監(jiān)測與水體中各種理化及生態(tài)因子 的分析檢測相結合，還有助于找到藍藻產毒和毒素的釋放、降解等方面的規(guī)律， 以便更有效地對m c 加以控制。 第二，對人群的監(jiān)測。m c 對人體的毒害作用目前還未完全明了，因此， 對接觸有毒水體的人群進行健康狀況的監(jiān)測是極為必要的，它有助于對毒素的 危害性做出更全面的評估。此監(jiān)測分為兩種：短期監(jiān)測和長期監(jiān)測。監(jiān)測時， 必須注意排除其他因素的干擾，提高診斷的可信度。 短期監(jiān)測通常在夏季藍藻水華爆發(fā)時進行，主要是監(jiān)測人群的急性癥狀。 現(xiàn)有的數(shù)據(jù)雖然不多，但足以肯定m c 對人體健康產生了影響，如：血液中谷 氨酰轉移酶升高、腸胃不適、皮炎、喉瘡和紅眼病等。短期監(jiān)測需要醫(yī)護人員、 生物學家、流行病學家等多方面的協(xié)調配合。 現(xiàn)在，全球開始加強對藍藻的監(jiān)測與管理。1 9 9 2 年，澳大利亞新南威爾士 藍藻工作機構( n e ws o u t h w a l e sb l u e g r e e na l g e at a s kf o r c e ) 以水體中藍藻細胞數(shù)為標準，建立了三層次監(jiān)測警報系統(tǒng)：層次i ， 5 0 0 2 0 0 0 c e l l s m l l 為警告量，此時要加強監(jiān)測，注意藍藻的變化趨勢；層次 砒m a s t e r s t h 文e s 。 】i ，2 0 0 0 1 5 0 0 0c e l l s m l 1 ，此時水樣需進行毒性測試，自來水廠也要采取適當 的預防措施i 層次，超過1 5 0 0 0c e l l s m l - 1 ，該水域成為“危險區(qū)”，已不適 宜使用。人類與有藍藻的水體接觸的建議域值為1 5 0 0 0c e l l s m l l 3 2 1 。1 9 9 9 年， 世界衛(wèi)生組織( w h o ) 對飲用水質制定的標準是，如果體重為6 0 公斤的人一 天喝2 升水，則允許的m c l r 最大攝入濃度為1 g l 1f 3 3 。這是針對成人制定 的標準，而且只考慮了m c 的毒性，若考慮到其促腫瘤作用，則m c l r 的最 高允許含量為o 耘g l 1 。我國飲用水水質規(guī)范中，于2 0 0 t 年9 月1 日已將m c 作為非常規(guī)檢測指標，參考標準為m c l r 不超過1 咄g l 1 水。 2 m c 的提純與檢測分析方法 2 1m c 的提純 b o t e 等f 卅首先進行了m c 的提取提純研究，確定出了多種不同的m c 提取 純化方法。比較典型的方法是以藍藻細胞為對象，經過提取、濃縮和分離等過 程，獲得微囊藻毒素純品。但是由于研究者的不同需要，m c 提純的步驟和方 法相差很大，至今也沒有一種公認的簡便有效的提純方法。在此對微囊藻毒索 的提取和純化方法現(xiàn)狀和最新進展進行了詳細的介紹，并總結評價m c 各種提 純的方法。 2 ，1 fm c 的提取 2 1 1 ，1 提取物質的選擇 用于m c 的提取物質主要有兩種，野外采集的原材料和實驗室生長的藻類。 兩種原材料都有其優(yōu)缺點。野外采樣可以得到很大的量，特別是當水華很濃密 時，即不需要花時間大量培養(yǎng)藻，而且所獲得的量通常比實驗室培養(yǎng)得到的量 大的多。但缺點是從其樣品所提取的毒素成分比實驗培養(yǎng)得到的更復雜，且重 復性差。對比而言，實驗室培養(yǎng)的藻類重現(xiàn)性好，單種藍藻產毒類型少，提 取相對也簡單些，而且純化也較容易，其主要缺點是室內大量培養(yǎng)藻較困難， 很難得到大量的m c 。 2 1 1 2 萃取溶劑選擇 提純m c 的萃取溶劑差別很大，至今也沒有公認最臺適的溶劑，主要是因 m a s t e r 讎 s t h 文e s 。 為微囊藻毒素的變體很多，且不同毒素異構體的性質亦不統(tǒng)一，所以使用的提 取液種類很多。為了能評價藻體中的微囊藻毒素總量，很有必要建立一套可靠 的方法來提取樣品中所有的微囊藻毒素。由于使用過的溶劑很多，但是提取效 率各不相同，為了方便以后的研究，這里討論并比較幾種常用、效果較好的方 法( 如表1 ) 。 表1 不同溶劑萃取體系的比較 t a b lc o m p a r i s o no ft h ed i f f e r e n ts o l v e n t se x t r a c t i o n 部分縮寫字母含義：k 亮氨酸；r - - 精氨酸；w = 色氨酸；f - - 苯丙氨酸；y = 酪氨酸 2 ，1 1 3 物理參數(shù)的影晌 在提取樣品時需要周密考慮，提取包括初始樣品的混合，隨后的攪拌和振 蕩，還有些需要考慮的因子如每一步操作時間的長短和用來提取的溶劑的 量。報道的許多方法多為用同一種溶劑反復提取多次，然后將提取物收集在一 起。最常見的是提取三次，抽提三次，可以有效的提取細胞內的m c 。 細胞質量與抽提溶劑的體積的比也會影響提取的效果，常見比例為 1 0 9 2 0 0 m l ，一般在1 0 9 1 0 0 m l 1 0 1 0 0 0 m l 之間【4 z “。用于提取的細胞總質 量也會影響m c 的檢測和純化，因為如果生物量足夠大，檢測和純化m c 就容 7 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 易的多。 不同方法的提取時間變化較大，從數(shù)分鐘到1 5 h 1 4 4 1 。在相關文獻中，對于 最適提取時間的研究報道不多，有一個文獻中比較了3 r a i n 、5 m i n 、3 0 r a i n 、6 0 m i n 的提取效果，發(fā)現(xiàn)1 h 的提取時間是最適宜的，過長的提取是不必要的。抽提 時間將很大程度上影響整個純化過程所需的時間，而且延長抽提時間會影響 m c 的穩(wěn)定性，或者可能加劇m c 的變異。如果在5 醋酸中，超時提取會伴 隨l r 的釋放。 提取溫度一般從大約4 到室溫| 4 “，不需要冷凍，藻毒素在提純過程還是 比較穩(wěn)定的。而超時的提取( 例如在晚上) ，建議維持一個較低的溫度條件。近 來，有一些雜志高度評價升溫的作用，m e t c a l f 和c o d d f 蛔首次將沸水浴應用于 微囊藻毒素的提取和分析中，實驗得到的m c 與甲醇抽提的結果接近，由于其 價廉，預示這種方法可能有更好的應用前景。 2 1 2 樣品濃縮 藻細胞最初的提取產物：一般為大量溶劑中含有少量稀釋的m e ，該初提 產物在純化檢測前需要濃縮。常用的濃縮方法是蒸發(fā)和固相萃取。通常使用4 0 旋轉蒸發(fā)器，將樣品完全干燥，再用一種合適的溶劑將其重新溶解，離心或 過濾除去微粒，再進行分離。空氣和氮氣通常也可用來干燥或減少抽提物的體 積，其原理與旋轉蒸發(fā)儀相似。 固相萃取( s p e ) 的基本原理是樣品在兩相之間的分配：即在固相( 吸附劑) 和液相f 溶劑) 之間的分配。近年來，固相萃取成為藻毒素提取的重要方法，基 本上采用反相c 1 8 填料作為固體萃取相，甲醇作為洗脫液【4 7 。5 2 l ，也有采用含 o 1 - - 氟乙酸( t f a ) 的9 0 甲醇溶液將藻毒素洗脫【4 9 】。固相微萃取( s p m e ) 技術 應用于研究含微囊藻毒素水華樣本的m c 特性開始于最近2 年。香港大學的 h o n w a i ll a m 教授研究了三個主要的m c 變異體，即m c l r 、m c y r 和 m c r r ，在樣品溶解之后，用5 0 u m c w t p r 和6 5 一u m p d m s d v b 涂層的萃取 頭萃取，通過s p m e 與高效液相色譜聯(lián)用研究m c 的特性 5 2 】。s p m e h p l c 聯(lián) 用技術作為一種集試樣預處理與分析檢測于一體的分析方法，由于其自身具有 的分析速度快、溶劑消耗少、方法重現(xiàn)性好和易于自動化操作等優(yōu)點而受到人 們的關注。麗隨著性能更好的萃取頭涂層材料的出現(xiàn)，如選擇性更高的印記分 碩士學位論文 m a s t e r st - i e s l s 子固定相、對有機溶劑有更高穩(wěn)定性的聚合物涂層材料等，此方法在藻毒素檢 測的應用范圍必然能得到更大的擴展，分析功能也會更強大。 2 1 3 分離純化 直到1 9 8 2 年，通過透析、溶劑萃取及d e a e s e p h a d e x a 2 5 柱層析結合 的方法，才分離純化出m c ，并用于結構分析。之后，各種色譜技術才開始被 廣泛用來提純大量的微囊藻毒素及微囊藻毒素變體，色譜分析步驟可能有2 個 或7 個，在提純過程中，有些步驟被反復使用。分離技術的選擇依據(jù)于實際情 況。如下介紹了幾種色譜分離技術( 如表2 ) 。 表2 色譜分離技術在微囊藻毒索分離中的應用 t a b 2c h r o m a t o g r a p h y a p p h e di nm c s e p a r a t i o n 9 碩士學位論文 m a s t e r l st t t e s i s 次被提取； 從水華物中提取毫克數(shù)量的7 甲基化 【6 3 】 m c r r ，能獲得毫克數(shù)量的微囊藻毒素 近年來，隨著分析儀器的不斷革新，藻毒索的分離方法有了更廣泛的選擇 空間，使得許多其他技術如超濾技術【4 3 】等均可運用到藻毒素的分離。 2 2m c 的檢測和分析方法 m c 的檢測可以分為四個層次【4 9 1 ：篩選、純化、鑒別和定量。所用的方法 通常歸為以下幾類：生物測試，組織培養(yǎng)細胞毒性測試，色譜分析法， 如t l c 、g c 、h p l c 等，質譜分析法，如f a b m s 、l s i m s 等，酶聯(lián)免疫 法，酶抑制試驗等。這些方法的檢測側重點有所不同，靈敏度差異很大，對 儀器及操作技能的要求也各不相同。因此，檢測毒素時，要依據(jù)樣品來源、數(shù) 量和實驗的目的，選擇適當?shù)姆椒ǎ部蓪⒍喾N方法聯(lián)合運用，以互相驗證和 補充。 2 2 1 生物測試 生物測試通常采用小白鼠的腹腔注射法，選用體重約2 0 2 5 9 的小白鼠， 每只注射量不超過l m l 。將凍融的藻漿作系列稀釋，每稀釋度注射3 - 4 只小白 鼠，觀察3 4 h 后，將死亡的小自鼠進行解剖，鑒定是否為肝毒素中毒。根據(jù) 藻樣的千重，將半致死濃度換算成半致死劑量( l d 5 0 ) ，以g 千藻k g 。鼠體重 為單位。一般l d 5 0 5 0 0 9 k g - 1 鼠體重時，毒性較低；若太于1 0 0 0 9 噸d 鼠體重， 可視為無毒1 4 。 生物測試法是最早采用的常規(guī)方法。它快速直觀，但需消耗較多毒素，靈 敏度和專一性不高，無法準確地定量測定，也不能辨認微囊藻毒索異構體的種 類。當樣品中同時含有神經毒素時，肝毒素的毒性還會被掩蓋。 另外，鹽蝦、水蚤、蝗蟲等無脊椎動物也都被用來進行微囊藻毒素的生物 檢測，并有一些生物學家對細菌檢測法也進行了嘗試f 6 5 舯】。 2 2 2h p l c 檢測及提純 高效液相色譜( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是檢測 1 0 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s m c 常用的手段之一，它準確靈敏，檢測下限低，可達n g l 級，結果的重現(xiàn)性 好。在定量檢測的同時，可標出不同的m c 異構體，分離和純化毒素。但h p l c 法利用保留時間來定性，檢測時必須依賴標準毒素樣品。目前市場所能獲得的 標樣主要是m c r r 、一y r 、l r 三種，因此，h p l c 法只能檢測出這三種異構 體，而無法辨認其他有毒異構體。最近的研究還表明某些塑料添加劑可干擾 h p l c 對m c 的檢測i 6 ”。 經典的i - i p l c 檢測m c 使用反相c 1 8 柱，流動相使用甲醇和o 0 5m 磷酸 緩沖液的混合液( v v = 6 0 ：4 0 ) ，最近，張維吳等人以甲醇水配制流動相，以 三氟乙酸調節(jié)p h 并進行等度洗脫分析微囊藻毒素，得到了較好的結果，該方 法不僅降低了成本，簡化了操作，而且實驗后色譜柱易于清洗維護f 5 0 1 。 另外，檢測器的不同也會影響到靈敏度。 2 。2 3 酶聯(lián)免疫吸附法( e lj s a 法) 1 6 9 j e l i s a 法是一種固相測定法，它利用抗原、待測抗體和酶標二抗之間的特 異性反應，生成抗原一抗體酶標抗體結合物。加底物顯色后，用酶標儀檢測 消光值的大小，根據(jù)標準曲線算出待測抗體的濃度。 e l i s a 法可能是目前快速分析m c 時最常用的方法。它的最大優(yōu)點是需要 的樣品量少，簡便、快速。e u s a 法靈敏度極高，定量檢測水中總毒素，檢測 限可達到0 0 5 p g - l 1 ，所需的酶標儀也不算昂貴。e l i s a 法現(xiàn)已發(fā)展出多種單 克隆和多克隆抗體【7 0 , 7 1 】，并有商品試劑盒提供。然而，因所用的抗體是針對 m c l r 設計，雖與其他異構體有一定交叉反應，但不能用于毒素的種類鑒定。 另外，e l i s a 法受多種干擾的影響，容易產生假陽性結果。 2 2 ，4 蛋白磷酸酶抑制試驗 蛋白磷酸酶抑制試驗原來多采用放射性同位素標記的方法，較復雜。1 9 9 4 年j a n 和w w c a r m i c h a e l 采用顯色蛋白磷酸酶抑锘4 試驗的方法，則更為方便 和安全。此試驗利用螢火蟲的生物發(fā)光體系來檢測蛋白磷酸酶p p 2 a 的抑制劑， 原理是p p 2 a 可催化水解蟲熒光素磷酸鹽為蟲熒光素和無機磷酸鹽【7 2 j 。 2 2 5 質譜分析法( m a s ss p e c t r o m e tr y ，m a s s 法) 質譜分析法是分析有機大分子的分子量、分子式及其結構等的重要化學手 段，其靈敏度可達p g 級。用于分離和鑒定的質譜方法主要有f a b m s ( 快速原 碩士學位論文 m a s t e r st h e s i s 子轟擊質譜法) 和l s i m s ( 液相次級離子質譜法) 等。通常質譜法與色譜技術 結合運用，可以形成g c ( g a sc h r o m a t o g r a p h y ) m s 、l c m s 和f r i t f a bl c m s 等多種分析法。質譜分析法靈敏、準確，但實驗花費大。 2 2 6 其他檢測方法 除了以上敘述的較常用方法，還有一些方法用于m c 的檢測，如血球凝集 法、薄層層析法等，也有方法通過檢測m c 的氧化產物2 甲基3 甲氧基4 一苯 丁酸( m m p b ) 來鑒定【”】。免疫學方法中，新近發(fā)展了以時間決定的熒光免疫 分析法( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ，t r f i a ) 【_ “】。另外，較先進的毛細 管電泳( c e ) 、微液相色譜( m i c r o l c ) 、膠束電動色譜( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c h r o m a t o g r a p h y , m e k c ) 以及核磁共振( n m r ) 等技術也都已被用于m c 的檢 測和分析1 7 5 ”j 。 近幾年，運用基因工程方法已證實m c 是由多肽合成酶復合體通過巰基一 模板合成機制合成的，且發(fā)現(xiàn)微囊藻的多肽合成酶基因簇的一部分m c yb 模 數(shù)和其產毒性有直接相