生物技術(shù)藥物的免疫毒性和免疫原性.ppt

生物技術(shù)藥物的免疫毒性和免疫原性研究,Kaiyong LIU 華南農(nóng)業(yè)大學(xué),生物技術(shù)藥物,生物技術(shù)藥物 包括體內(nèi)診斷、治療與預(yù)防用途； 來源于細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 蛋白質(zhì)、多肽及其衍生物、核酸 如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、融合蛋白、酶、激素、單抗、載體等 特殊性 結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)工藝、保存條件、同源性、作用靶點(diǎn)明確等固有的特點(diǎn),免疫毒性/免疫原性,免疫毒性 是指受試品引起免疫抑制或增強(qiáng)、過敏反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，可能與藥理活性相關(guān)（如抗排斥藥物）或不相關(guān)（如部分抗腫瘤藥物）。 免疫原性 指藥物刺激機(jī)體形成特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。,研究意義,意義重大：如 免疫抑制，感染，腫瘤 免疫增強(qiáng)，放大自身免疫反應(yīng)或過敏反應(yīng)。 免疫原性，是藥物本身具有的性質(zhì)，有免疫原性不一定導(dǎo)致毒性，但可以影響對(duì)藥物毒性、毒代或藥效的客觀評(píng)價(jià)。 但在規(guī)范及指導(dǎo)原則方面，缺乏共識(shí)，實(shí)驗(yàn)方法也不統(tǒng)一,免疫毒性研究?jī)?nèi)容一,常規(guī)的免疫毒性指標(biāo)包括： 白細(xì)胞總數(shù)及其分類計(jì)數(shù) 球蛋白和白/球比值 補(bǔ)體水平 淋巴器官/組織的大體解剖 胸腺和脾臟的器官重量 免疫病理：胸腺、脾臟、引流淋巴組織,免疫毒性研究?jī)?nèi)容二,額外的免疫毒性試驗(yàn)（additional studies），如 (1) 常規(guī)免疫毒性檢測(cè)結(jié)果提示免疫毒性，感染 (2) 受試品的結(jié)構(gòu)，與已知免疫調(diào)節(jié)劑相似 (3) 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果:原型藥或代謝產(chǎn)物在免疫組織 蓄積 (4) 適應(yīng)癥:如用于抗HIV藥物 (5) 藥理作用：常對(duì)免疫系統(tǒng)有影響,常規(guī)的免疫毒性檢測(cè)結(jié)果 引流淋巴組織檢查,圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后回腸粘膜下集合淋巴小結(jié),：對(duì)照組，：高劑量組,常規(guī)的免疫毒性檢測(cè) 免疫抑制/增強(qiáng),全血細(xì)胞變化、白細(xì)胞變化或淋巴細(xì)胞變化等。 免疫器官重量改變或組織學(xué)檢查顯示相關(guān)器官或組織細(xì)胞密度變化 血清免疫球蛋白變化 用藥組感染發(fā)生率升高 用藥組腫瘤發(fā)生率增多(除遺傳毒性、激素效應(yīng)或肝酶誘導(dǎo)外),額外的免疫毒性試驗(yàn)內(nèi)容,免疫功能檢測(cè) 如T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)、NK細(xì)胞活性、CTL活性、細(xì)胞因子表達(dá)、巨噬細(xì)胞/中性粒細(xì)胞功能、皮膚超敏反應(yīng)、宿主抵抗力研究） 免疫表型檢測(cè) 依據(jù)免疫學(xué)理論和具體靶分子種類,額外的免疫毒性試驗(yàn)方案,增設(shè)衛(wèi)星組、增加免疫學(xué)指標(biāo)或改變給藥方案等。 發(fā)育免疫毒性：在成年動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)免疫抑制作用后，需要評(píng)價(jià)發(fā)育免疫毒性作用，如觀察母代暴露于藥物后仔代的淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、細(xì)胞因子等，兩種以上功能檢測(cè)等。不僅是免疫抑制！ 常規(guī)階梯或分層或標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合不一定合理，需個(gè)體化,額外的免疫毒性試驗(yàn)方法,免疫功能檢測(cè),額外的免疫毒性試驗(yàn)方法,免疫功能檢測(cè),注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72%,額外的免疫毒性試驗(yàn)方法,免疫表型檢測(cè) 常用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)表達(dá)水平和比例,免疫功能檢測(cè) 分泌IFN細(xì)胞,圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特異性的分泌IFN的淋巴細(xì)胞數(shù)量,免疫細(xì)胞表型檢測(cè) CD22陽(yáng)性比例,圖 食蟹猴靜脈注射SM03嵌合抗體后CD22標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞率的變化,CD22陽(yáng)性細(xì)胞比例（%）,免疫細(xì)胞表型檢測(cè) CD4/CD8比例,CD4/CD8比例,圖 獼猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例,免疫毒性試驗(yàn)結(jié)果分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物學(xué)意義（尤其單一指標(biāo)） 變化程度 與劑量/暴露關(guān)系 與擬用臨床劑量的關(guān)系 療程關(guān)系 涉及動(dòng)物種屬數(shù)量和受影響的終點(diǎn) 可能繼發(fā)于其他因素 (e.g., stress,） 可能的細(xì)胞靶點(diǎn)和（或）作用機(jī)制 引起這些變化的劑量與產(chǎn)生其他毒性的劑量關(guān)系 可逆性,免疫毒性靶器官的分析線索,靶分子在免疫器官或組織的分布 受試品或其代謝產(chǎn)物的分布 相關(guān)指標(biāo)的變化 常規(guī)免疫指標(biāo)、細(xì)胞因子變化等。,免疫毒性機(jī)制推測(cè),受體或藥靶直接引起的毒性反應(yīng)（on-target) 如干擾素引起骨髓抑制 受體或藥靶介導(dǎo)的間接毒性反應(yīng) 如rhIL-12能誘導(dǎo)干擾素的分泌 非特異機(jī)制 如rhTNK-tPA引起肝細(xì)胞劑量依賴性的脂肪變性。,免疫原性研究?jī)?nèi)容,免疫原性(immunogenicity) 指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen）。產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞能力。 影響因素 分子大小，10 000，5 00010 000，1000 5000 分子結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)多糖核酸類脂 宿主因素、免疫方式,免疫原性研究意義,免疫原性影響重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布 （neutralize drug activity and alter drug clearance, plasma half-life, and tissue distribution） 建立免疫分析方法，供臨床試驗(yàn)應(yīng)用,免疫原性研究?jī)?nèi)容,抗體檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證 免疫反應(yīng)檢測(cè) 抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化、抗體的中和活性、。 抗體與藥代/藥效和安全關(guān)系的評(píng)價(jià) 同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應(yīng)的變化、補(bǔ)體激活與否、免疫復(fù)合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等,抗體檢測(cè)方法,ELISA-橋法 包被藥物，用標(biāo)記的藥物檢測(cè)。 ELISA-直接法 包被藥物，用標(biāo)記抗體檢測(cè)。 （缺點(diǎn)：包被時(shí)可能會(huì)掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測(cè)單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌時(shí)丟失低親和力抗體，參考品與樣本之間試劑可能不同）,抗體檢測(cè)方法,間接法 包被單抗或生物素，再加藥物。 放射免疫沉淀法（RIP） 液相法，中等或高通量水平 表面等離子體共振 液相法，不需結(jié)合物（酶標(biāo)記抗體），能檢測(cè)到不同親和力的抗體和各亞型抗體 電化學(xué)發(fā)光法 液相法，可檢測(cè)各種抗體亞型,抗體檢測(cè)方法考察,方法學(xué)考察 靈敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出 受試物干擾：如有文獻(xiàn)報(bào)道，如血清中受試物濃度大于0.15g/ml，則難以檢測(cè)到抗受試物抗體。一般從1：10開始稀釋或?qū)悠愤M(jìn)行處理。長(zhǎng)效? 精確度：利用陽(yáng)性對(duì)照品重復(fù)測(cè)量 陰性對(duì)照血清一般需從15只動(dòng)物或50人中抽取,免疫復(fù)合物在肝腎的沉積,：溶劑對(duì)照組猴腎組織,：重組葡激酶大劑量組腎組織,圖 獼猴iv重組葡激酶周后腎組織的免疫組織化學(xué)染色,抗體檢測(cè)結(jié)果描述,抗體滴度結(jié)果表示 數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對(duì)數(shù)后達(dá)正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示 抗體檢測(cè)結(jié)果 抗體的出現(xiàn)時(shí)間、出現(xiàn)抗體的動(dòng)物數(shù)、劑量關(guān)系、抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化,抗體中和活性檢測(cè),常用依賴細(xì)胞株 抗病毒致細(xì)胞病變（CPE） 克隆細(xì)胞株 靶基因檢測(cè)等。 游離或與抗體結(jié)合的受試品對(duì)中和活檢測(cè)的干擾（偶聯(lián)抗體的瓊脂糖凝膠珠吸附）,抗體中和活性的檢測(cè) CPE法,圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后血清對(duì) HIV-1 HN 024的中和活性,抗體中和活性檢測(cè)方法 靶基因表達(dá),抗體產(chǎn)生對(duì)藥效相關(guān)指標(biāo)的影響,圖 注射表達(dá)EPO基因裸質(zhì)粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測(cè),抗體產(chǎn)生對(duì)藥代的影響,臨床上連續(xù)應(yīng)用重組水蛭素5以上可使74%的患者產(chǎn)生抗水蛭素抗體（AHAb）。,抗體產(chǎn)生對(duì)藥代的影響,0,4,8,13,17,21,0.01,0.1,1,10,TPO ( ng / mL）,-,),時(shí)間 (天 ),圖 猴皮下連續(xù)注射rhTPO 2 g.kg-1.d-120 d后血清rhTPO濃度(實(shí)測(cè)值和抗體滴度(, 血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)）,抗體產(chǎn)生對(duì)毒性反應(yīng)的影響,圖 食蟹猴sc 2周和4周PEG-IFN后白細(xì)胞計(jì)數(shù)、抗體滴度和血清中和活性,*,*,*,*,*,*,*,*,中和抗體產(chǎn)生對(duì)給藥方案的意義,中和抗體影響了大多數(shù)動(dòng)物的藥理和（或）毒性反應(yīng)，則可以考慮終止給藥。 中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達(dá)到的血藥濃度的作用時(shí)，可以考慮終止給藥。需結(jié)合藥動(dòng)學(xué)資料。,總 結(jié),生物技術(shù)藥物免疫毒性評(píng)價(jià) 重視，個(gè)體化原則，采用新方法 生物技術(shù)藥物免疫原性評(píng)價(jià) 強(qiáng)調(diào)規(guī)范，分析與毒性反應(yīng)等關(guān)系,CD28激動(dòng)劑TGN1412的期臨床試驗(yàn)事件,德國(guó)公司研制的抗CD28超級(jí)激動(dòng)劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗(yàn)中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)（多器官衰竭）。,CD28激動(dòng)劑TGN1412的期臨床試驗(yàn)事件,研究發(fā)現(xiàn)注射受試品后很快導(dǎo)致前炎癥因子釋放（細(xì)胞因子風(fēng)暴），心肺功能衰竭。 猴長(zhǎng)毒：CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞一過性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但沒有出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征。,CD28激動(dòng)劑TGN1412的期臨床試驗(yàn)事件的教訓(xùn),期臨床試驗(yàn)方案的教訓(xùn)：僅10min間隔 免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評(píng)價(jià)和分析的重要性（Toxicol in Vitr）。 猴并非一定是相關(guān)動(dòng)物，動(dòng)物記憶T細(xì)胞少。,主要參考文獻(xiàn),EMEA. Guideline on Comparability of Medicinal Products Containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substance: Nonclinical and Clinical Issues ICH. preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals s6 ICH. immunotoxicity studies for human pharmaceuticals s8 FDA.Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs 呂秋軍等.