鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻對(duì)低溫、強(qiáng)光的響應(yīng)論文.pdf

分類(lèi)號(hào) q943.2 u d c 633 學(xué)校代碼 10129 學(xué) 號(hào) 08100022 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻對(duì)低溫、強(qiáng)光的響應(yīng) the response to low temperature and high light of spirulina platensis in an alkali lake of erdos plateau 申 請(qǐng) 人：鞏東輝 學(xué)科門(mén)類(lèi): 理 學(xué) 學(xué)科專(zhuān)業(yè)：植物學(xué) 研究方向：植物生理 指導(dǎo)教師：張少英 教授 論文提交日期：二零一三年六月 摘 要 螺旋藻，作為最為重要的經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻，其代謝機(jī)理與環(huán)境因子變化的關(guān)系一直 是該藻的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。 目前國(guó)內(nèi)螺旋藻工廠化養(yǎng)殖所采用的藻種原產(chǎn)地屬于熱 帶地區(qū)， 屬于冷敏感植物， 因此我國(guó)螺旋藻養(yǎng)殖基地主要分布在南方和沿海地區(qū)， 嚴(yán)重制約了我國(guó)北方地區(qū)螺旋藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。 在鄂爾多斯地區(qū)螺旋藻溫室養(yǎng)殖 過(guò)程中，chad 湖鈍頂螺旋藻在初春和深秋產(chǎn)量與夏季相比有較大幅度的下降， 而鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻卻表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性。 本研究以?xún)?nèi)蒙古鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻和非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻為 實(shí)驗(yàn)材料，模擬初春、深秋的光溫條件（低溫和強(qiáng)光輻射） ，系統(tǒng)地研究了低溫、 強(qiáng)光脅迫下鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻在補(bǔ)償生長(zhǎng)、光合作用、抗氧化酶活性 等方面的應(yīng)答及與非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻的差異比較，并對(duì)鄂爾多斯高原堿湖 鈍頂螺旋藻規(guī)模化溫室養(yǎng)殖的產(chǎn)量與光溫的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如 下： 1、低溫、強(qiáng)光脅迫下螺旋藻的光抑制現(xiàn)象十分顯著，且隨處理溫度降低、 時(shí)間延長(zhǎng)，光合速率下降幅度加大，藍(lán)光的光合作用恢復(fù)效果最顯著，其次為紅 光、黃光、綠光，黑暗中的恢復(fù)效果最差；螺旋藻光合能力的恢復(fù)與蛋白質(zhì)的合 成有關(guān)。自然光下進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)，鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻恢復(fù)快于非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻，且恢復(fù)時(shí)間與處理溫度、時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。低溫、強(qiáng)光處理 后的藻絲體發(fā)生不同程度的斷裂，顏色由深變淺，發(fā)生光漂白，光漂白程度均為 非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻大于鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻。 2、螺旋藻葉綠素 a、可溶性糖、可溶性蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、類(lèi) 胡蘿卜素含量在低溫、強(qiáng)光脅迫條件下呈現(xiàn)出不同程度的下降。 3、螺旋藻在低溫、強(qiáng)光脅迫的耦合作用下，質(zhì)膜因發(fā)生光氧化作用而導(dǎo)致 結(jié)構(gòu)和功能被破壞。隨著處理溫度的降低和照光時(shí)間的延長(zhǎng)，螺旋藻表現(xiàn)為膜通 透性增加，相對(duì)電導(dǎo)率、mda 含量、游離脯氨酸含量上升；且隨脅迫條件的加 劇，非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻光氧化程度高于鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻。 4、低溫、強(qiáng)光脅迫下，鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻類(lèi)囊體膜的葉綠素 a、 蛋白含量、atp 酶活性相對(duì)穩(wěn)定，變化幅度小于非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻，類(lèi)囊 體膜 atp 酶在 5 30 范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。低溫、強(qiáng)光條件下可誘導(dǎo)鄂爾多斯 高原堿湖鈍頂螺旋藻生成一條 42.18kda 的新蛋白條帶。 5、低溫、強(qiáng)光下，螺旋藻 cat、sod 的酶活性與處理時(shí)間及處理溫度呈正 相關(guān)；cat、sod 酶活性為鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻大于非洲 chad 湖鈍頂 螺旋藻，pod 活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。cat、sod 是鄂爾多斯高原堿 湖鈍頂螺旋藻抗低溫、強(qiáng)光的生理基礎(chǔ)。 6、日均光照在 50 klux 以下，培養(yǎng)液日均溫度在 2224時(shí)，鄂爾多斯 高原堿湖鈍頂螺旋藻的產(chǎn)量較高。在溫度較低、光照充足的深秋，鄂爾多斯高原 堿湖鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)良好，月均產(chǎn)量可達(dá)到最高產(chǎn)量的 86.86%，因此，鄂爾多 斯高原堿湖鈍頂螺旋藻是一種適宜于我國(guó)北方地區(qū)養(yǎng)殖的耐強(qiáng)光的低溫型藻種。 關(guān)鍵詞：鄂爾多斯堿湖鈍頂螺旋藻；非洲 chad 湖鈍頂螺旋藻；強(qiáng)光；低溫；生 理響應(yīng) the response of spirulina platensis to low temperature and high light in an alkali lake of the erdos plateau abstract as an economically important alga, spirulina platensiss metabolic response to environmental changes is the focus of many current researches. the breeding species used in the domestic factory was originated from tropical regions, thus is sensitive to cold; for this reason the spirulina cultivation factory were mostly located in southern china, and consequently the development of breeding industry in the north was seriously hampered. the output of spirulina culture in greenhouses at erdos in northern china is drastically dropped during the early spring and late autumn when the species from chad was used due to the poor fitness, while the spirulina platensis from an alkaline lake of erdos plateau showed good adaptability with the seasonal changes. this project using the species of spirulina platensis from the alkaline lake of erdos plateau and from the lake of chad africa as experimental subjects systematically characterized the growth, photosynthesis, autioxidant enzyme activities at the conditions simulating the stress of low temperature and high lights and compared the differences of stress responses between spirulina platensis from an alkaline lake of erdos plateau and species from chad. in addition, the correlation between output variation and changes in temperature and light intensity of spirulina platensis from an alkaline lake of erdos plateau in greenhouse culture was analysised. the results are summarized as following: 1. the photoinhibition of spirulina was significant under the stress of low temperatu- re and high light, the photosynthetic rate dropped drastically with lowering of temperature and longer treating time; the recovery rate for the treated samples varied with wavelengths, with the blue light showing the most remarkable, followed by red light, yellow light, and green light; after stressed by low temperature and high light , the recovery of physical indexes for samples from erdos plateau was faster than that of species from chad; the recovery time negatively correlated with the treating time and the treating temperature; protein biosynthesis involved in recovery of photosynthetic capacity of spirulina. 2. the chlorophyll a, soluble sugar, soluble protein, pc, apc, and carotenoid decreased under the stress of low temperature and high light; the algal filaments was found broken in various degrees after treated with low temperature and high light accompanied by the color change from dark to lighter, the degree of bleaching was higher for species from chad than that for samples from erdos plateau. 3. the structure and function of plasma membrane of spirulina was damaged caused by photo oxidation under the stress of low temperature and high light. the permeability of plasma membrane, the relative conductivity, the content of malondial-dehyde (mda), and free proline increased with lower temperature and longer irradiation; as the stress aggravated, the level of photo oxidation of spirulina platensis was deeper also, the level of photo oxidation of spirulina platensis from chad higher than samples from erdos plateau. 4. the chlorophyll a, protein content, and atp activity of thylakoid membrane of spirulina platensis from erdos plateau was found relatively to be more stable than that of samples from chad under stress, indicated by smaller variation ranges. the atp activity was stable with the temperature in the range of 5 30 . the sds-page showed that low temperature and high light stress induced a new protein band with a molecular weight of 42.18 kda. 5. the activity of cat and sod of the samples were positively correlated with treating time and temperature under high light; the enzymatic activity of spirulina platensis from erdos plateau was higher than that of samples from chad; the activity of pod decreased with treating time prolonged .cat、sod were the physiological basis of spirulina platensis from erdos plateau to low temperature and high light. 6. the output rate of s1 reached the highest when the average illumination per day was below 50 klux and temperature was in the range of 2224 . s1 grew well in the late autumn when the temperature became lower yet the light was sufficient with the output rate being 86.86% of the highest. thus, s1 is a suitable species for cultivation in northern china because its resistance to high light and low temperature. key words: spirulina platensis in the alkaline lake of erdos; spirulina platensis from chad lake of africa; high light;low temperature; physiological response directed by: prof. shaoying zhang applicant for doctor degree: gong donghui (botany) (college of agronomy, inner mongolia agricultural university, hohhot 010018, china) 目 錄 1 引言 . 1 1.1 研究的目的和意義 . 1 1.2 研究綜述 . 2 1.2.1 螺旋藻的發(fā)現(xiàn)及產(chǎn)業(yè)化概況 . 2 1.2.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 . 2 1.2.3 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展 . 4 1.2.4 鄂爾多斯地區(qū)螺旋藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展概況 . 6 1.2.5 植物抗性生理概述 . 7 2. 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻光合性能的影響 10 2.1 材料與方法 . 10 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 . 10 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 11 2.2 結(jié)果與分析 . 17 2.2.1 低溫、強(qiáng)光脅迫對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻光合速率的影響 . 17 2.2.2 低溫、強(qiáng)光脅迫對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻葉綠素a含量的影響 . 18 2.2.3 低溫、強(qiáng)光脅迫對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻類(lèi)胡蘿卜素含量的影響 21 2.2.4 低溫、強(qiáng)光脅迫對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白含量影響 23 2.2.5 低溫、強(qiáng)光脅迫處理對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻類(lèi)囊體膜蛋白的影響 25 2.2.6 低溫、強(qiáng)光脅迫處理對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻類(lèi)囊體膜 atp 酶活性的影響 29 2.2.7 低溫、強(qiáng)光條件下蛋白合成與鄂爾多斯鈍頂螺旋藻光合作用 32 2.2.8 低溫、強(qiáng)光下鄂爾多斯鈍頂螺旋藻總蛋白變化 35 2.3.1 討論 . 37 2.3.2 小結(jié) . 40 3. 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻細(xì)胞膜透性、游離脯氨酸含量的影響 41 3.1 材料與方法 . 41 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 . 41 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 41 3.1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法 . 42 3.2 結(jié)果與分析 . 42 3.2.1 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻細(xì)胞外滲液電導(dǎo)率的影響 42 3.2.2 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻丙二醛含量的影響 46 3.3 討論與小結(jié) . 52 3.3.1 討論 . 52 3.3.2 小結(jié) . 54 4. 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻 cat、sod、pod 酶活性的影響 54 4.1 材料與方法 . 54 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 54 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 54 4.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 . 56 4.2 結(jié)果與分析 . 57 4.2.1 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻 cat 酶活性的影響 . 57 4.2.2 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻 sod 酶活性的影響 59 4.2.3 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻 pod 酶活性的影響 60 4.3 討論與小結(jié) . 61 4.3.1 討論 . 61 4.3.2 小結(jié) . 62 5 低溫、強(qiáng)光對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻補(bǔ)償生長(zhǎng)的影響 62 5.1 材料與方法 . 62 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 . 62 5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 63 5.2 結(jié)果與分析 . 64 5.2.1 低溫、強(qiáng)光處理后鄂爾多斯鈍頂螺旋藻生長(zhǎng)的恢復(fù) 64 5.2.2 低溫、強(qiáng)光處理后鄂爾多斯鈍頂螺旋藻葉綠素 a 含量的恢復(fù) 66 5.2.3 低溫、強(qiáng)光處理后鄂爾多斯鈍頂螺旋藻可溶性蛋白的恢復(fù) 68 5.2.4 低溫、強(qiáng)光處理后鄂爾多斯鈍頂螺旋藻可溶性糖的恢復(fù) 69 5.3 討論與小結(jié) . 70 5.3.1 討論 . 70 5.3.2 小結(jié) . 71 6. 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻中試養(yǎng)殖產(chǎn)量與光溫關(guān)聯(lián)分析 71 6.1 材料與方法 . 72 6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 72 6.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 72 6.2 結(jié)果與分析 . 72 6.2.1 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻日產(chǎn)量與氣溫關(guān)聯(lián)分析 . 72 6.2.2 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻日產(chǎn)量與光照、溫度關(guān)聯(lián)分析 . 73 6.2.3 產(chǎn)量與不同光照、溫度區(qū)間關(guān)聯(lián)分析 . 74 6.3 討論與小結(jié) . 75 6.3.1 討論 . 75 6.3.2 小結(jié) . 76 7 結(jié)論 . 76 8 研究展望 . 77 致 謝 . 82 參 考 文 獻(xiàn) . 83 作 者 簡(jiǎn) 介 . 93 插圖和附表清單 1. 圖 1.1 鄂爾多斯沙區(qū)堿湖四種螺旋藻的光鏡照片 . 4 2. 圖 2.1 強(qiáng)光下不同溫度對(duì) s1光合速率的影響 . 17 3. 圖 2.2 s1的凈光合放氧速率與起始值的百分比 . 17 4. 圖 2.3 強(qiáng)光下不同溫度對(duì) s2光合速率的影響 . 18 5. 圖 2.4 s2的凈光合放氧速率與起始值的百分比 . 18 6. 圖 2.5 25 oc 下螺旋藻細(xì)胞 chla 含量的變化 19 7. 圖 2.6 20 oc 下螺旋藻細(xì)胞 chla 含量的變化 19 8. 圖 2.7 10 oc 下螺旋藻細(xì)胞 chla 含量的變化 20 9. 圖 2.8 5 oc 下螺旋藻細(xì)胞 chla 含量的變化 . 20 10. 圖 2.9 10 oc 下螺旋藻細(xì)胞類(lèi)胡蘿卜素含量的變化 . 21 11. 圖 2.10 15 oc 下螺旋藻細(xì)胞類(lèi)胡蘿卜素含量的變化 21 12. 圖 2.11 20 oc 下螺旋藻細(xì)胞類(lèi)胡蘿卜素含量的變化 22 13. 圖 2.12 25 oc 下螺旋藻細(xì)胞類(lèi)胡蘿卜素含量的變化 22 14. 圖 2.13-圖 2.15 處理 30、60、120 min 不同溫度下 s1、s2類(lèi)胡蘿卜素含量的變化 . 23 15. 圖 2.16 10 oc 下螺旋藻細(xì)胞藻藍(lán)蛋白含量的變化 23 16. 圖 2.17 15 oc 下螺旋藻細(xì)胞藻藍(lán)蛋白含量的變化 23 17. 圖 2.18 20 oc 下螺旋藻細(xì)胞藻藍(lán)蛋白含量的變化 24 18. 圖 2.19 25 oc 下螺旋藻細(xì)胞藻藍(lán)蛋白含量的變化 24 19. 圖 2.20 10 oc 下螺旋藻細(xì)胞別藻藍(lán)蛋白含量的變化 25 20. 圖 2.21 15 oc 下螺旋藻細(xì)胞藻藍(lán)蛋白含量的變化 25 21. 圖 2.22 20 oc 下螺旋藻細(xì)胞別藻藍(lán)蛋白含量的變化 25 22. 圖 2.23 25 oc 下螺旋藻細(xì)胞別藻藍(lán)蛋白含量的變化 25 23. 圖 2.24 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜蛋白含量的變化 26 24. 圖 2.25 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜蛋白含量的變化 26 25. 圖 2.26 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜蛋白含量的變化 27 26. 圖 2.27 強(qiáng)光下螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜蛋白含量隨溫度、時(shí)間的變化 28 27. 圖 2.28 不同低溫處理，s1和 s2類(lèi)囊體膜蛋白 sds-page 圖譜 . 28 28. 圖 2.29 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜 atp 酶活性的變化 29 29. 圖 2.30 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜 atp 酶活性的變化 30 30. 圖 2.31 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜 atp 酶活性的變化 30 31. 圖 2.32 強(qiáng)光下螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜 atp 酶活性隨溫度、時(shí)間的變化 31 32. 圖 2.33 螺旋藻細(xì)胞類(lèi)囊體膜 atp 酶活性 arrhenius 圖 31 33. 圖 2.34 鏈霉素對(duì) s1光合放氧的影響 32 34. 圖 2.35 圖 2.35 鏈霉素對(duì) s2光合放氧的影響 32 35. 圖 2.36 鏈霉素對(duì) s1光合恢復(fù)的影響 34 36. 圖 2.37 鏈霉素對(duì) s2光合恢復(fù)的影響 34 37. 圖 2.38 低溫、強(qiáng)光處理后 s1光合速率在不同波長(zhǎng)的光下隨處理時(shí)間的變化 35 38. 圖 2.39 使用 tablet 直觀檢測(cè)新一代測(cè)序數(shù)據(jù) . 35 39. 圖 2.40 低溫、強(qiáng)光處理后 s1總蛋白 sds-page 圖譜 . 36 40. 圖 3.1 25 oc 下螺旋藻細(xì)胞外滲液相對(duì)電導(dǎo)率的變化 . 43 41. 圖 3.2 15 oc 下螺旋藻細(xì)胞外滲液相對(duì)電導(dǎo)率的變化 . 43 42. 圖 3.3 10 oc 下螺旋藻細(xì)胞外滲液相對(duì)電導(dǎo)率的變化 . 44 43. 圖 3.4 5 oc 下螺旋藻細(xì)胞外滲液相對(duì)電導(dǎo)率的變化 44 44. 圖 3.5-圖 3.6 螺旋藻細(xì)胞外滲液相對(duì)電導(dǎo)率的變化 . 45 45. 圖 3.7-圖 3.8 螺旋藻細(xì)胞外滲液相對(duì)電導(dǎo)率的變化 . 46 46. 圖 3.9 25 oc 下螺旋藻細(xì)胞 mda 含量的變化 47 47. 圖 3.10 20 oc 下螺旋藻細(xì)胞 mda 含量的變化 47 48. 圖 3.11 10 oc 下螺旋藻細(xì)胞 mda 含量的變化 48 49. 圖 3.12 5 oc 下螺旋藻細(xì)胞 mda 含量的變化 . 48 50. 圖 3.13-圖 3.16 螺旋藻細(xì)胞 mda 含量的變化 . 49 51. 圖 3.17-圖 3.18 螺旋藻細(xì)胞游離脯氨酸含量的變化 50 52. 圖 3.19-圖 3.20 螺旋藻細(xì)胞游離脯氨酸含量的變化 . 51 53. 圖 3.21-圖 3.23 處理 30、60、120 min 不同溫度下 s1、s2游離脯氨酸含量的變化 . 52 54. 圖 4.1 螺旋藻細(xì)胞 cat 酶活性的變化 . 58 55. 圖 4.2-圖 4.3 螺旋藻細(xì)胞 cat 酶活性的變化 . 58 56. 圖 4.4-圖 4.5 螺旋藻細(xì)胞 sod 酶活性的變化 . 59 57. 圖 4.6 螺旋藻細(xì)胞 sod 酶活性的變化 . 60 58. 圖 4.7-圖 4.9 螺旋藻細(xì)胞 pod 酶活性的變化 . 61 59. 圖 5.1 螺旋藻恢復(fù)生長(zhǎng)曲線(10處理 30min) 64 60. 圖 5.2 螺旋藻恢復(fù)生長(zhǎng)曲線(20處理 30min) 64 61. 圖 5.3 螺旋藻恢復(fù)生長(zhǎng)曲線(10處理 60min) 65 62. 圖 5.4 螺旋藻恢復(fù)生長(zhǎng)曲線(20處理 60min) 65 63. 圖 5.5 螺旋藻恢復(fù)生長(zhǎng)曲線(10處理 180min) . 65 64. 圖 5.6 螺旋藻恢復(fù)生長(zhǎng)曲線(20處理 180min) . 65 65. 圖 5.7 葉綠素 a 含量隨時(shí)間的變化(10處理 30min) 66 66. 圖 5.8 葉綠素 a 含量隨時(shí)間的變化(20處理 30min) . 66 67. 圖 5.9 葉綠素 a 含量隨時(shí)間的變化(10處理 60min) . 67 68. 圖 5.10 葉綠素 a 含量隨時(shí)間的變化(20處理 60min) . 67 69. 圖 5.11 葉綠素 a 含量隨時(shí)間的變化(10處理 180min) 67 70. 圖 5.12 葉綠素 a 含量隨時(shí)間的變化(20處理 180min) 67 71. 圖 5.13 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(10處理 30min) . 68 72. 圖 5.14 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(20處理 30min) . 68 73. 圖 5.15 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(10處理 180min) 69 74. 圖 5.16 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(20處理 30min) . 69 75. 圖 5.17 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(10處理 30min) . 69 76. 圖 5.18 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(20處理 30min) . 69 77. 圖 5.19 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(10處理 180min) 70 78. 圖 5.20 可溶性蛋白含量隨時(shí)間的變化(20處理 180min) 70 79. 圖 6.1 產(chǎn)量與溫度變化曲線（6-10 月） . 73 80. 圖 6.2 產(chǎn)量、溫度、光照日變化曲線（8-10 月，2011） . 73 81. 圖 6.3 不同光照區(qū)間平均日產(chǎn)量變化曲線 . 74 82. 圖 6.4 不同溫度區(qū)間平均日產(chǎn)量變化曲線 . 74 83. 圖 9.1 鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻水華 . 79 84. 圖 9.2 作者在鄂爾多斯高原堿湖考察和標(biāo)本采集 . 79 85. 圖 9.3 鄂爾多斯高原堿湖現(xiàn)場(chǎng)拍攝的鈍頂螺旋藻顯微照片 . 80 86. 圖 9.4 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻中試跑道養(yǎng)殖池（左）及收藻（右）照片 . 80 87. 圖 9.5 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻形態(tài)顯微照片 . 81 88. 圖 9.6 非洲乍得湖鈍頂螺旋藻形態(tài)顯微照片 . 81 89. 表 1.1 鄂爾多斯沙區(qū)堿湖四種螺旋藻的形態(tài)特征 5 90. 表 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及來(lái)源 . 11 91. 表 2.2 膠體成分 . 15 92. 表 2.3 強(qiáng)光下、不同處理溫度時(shí)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻葉綠素 a 含量 . 20 93. 表 6.1 多重比較結(jié)果 . 75 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 1 1 引言 1.1 研究的目的和意義 螺旋藻是一種屬于藍(lán)藻門(mén)、藍(lán)藻綱、段殖體目、顫藻科的原始藻類(lèi) 1。其營(yíng)養(yǎng)成 分和生理活性物質(zhì)含量極為豐富，具有抗衰老、抗輻射、提高機(jī)體免疫功能、抗癌和 防癌等作用。因此，螺旋藻被認(rèn)為是可開(kāi)發(fā)利用的最有前途的的一種新型的微藻，并 被世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織譽(yù)為21 世紀(jì)人類(lèi)最佳保健品和最理想的食 品 2,3。 國(guó)內(nèi)螺旋藻養(yǎng)殖廠生產(chǎn)所采用的產(chǎn)業(yè)化藻種原產(chǎn)地均為國(guó)外， 分別是來(lái)源于非洲 chad 湖的鈍頂螺旋藻（spirulina platensis）和中美洲墨西哥 sosa texcoco 湖的極大螺 旋藻（s. maxima） 4。植物自然地理分布受很多條件的制約，但光照和溫度是最主要 的決定性因素，這兩個(gè)藻種的原產(chǎn)地屬于熱帶地區(qū)，均在北緯十幾度，因此這兩個(gè)物 種喜高溫，對(duì)低溫敏感，帶有明顯低緯度植物的烙印。正因?yàn)闅夂驐l件的限制，非洲 chad 湖的鈍頂螺旋藻和墨西哥 sosa texcoco 湖的極大螺旋藻引入中國(guó)后，其養(yǎng)殖工 廠主要分布在云南、廣西、福建等南方和沿海氣候較熱的地區(qū)，盡管引進(jìn)藻種隨著時(shí) 間的推移有所馴化，一些北方地區(qū)也開(kāi)始螺旋藻的養(yǎng)殖，但主要養(yǎng)殖基地仍分布于北 緯 37 以南。 1996 年，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教授喬辰、李博生的螺旋藻課題組在鄂爾多斯高原堿 湖發(fā)現(xiàn)了四種螺旋藻，其中一種被藻類(lèi)學(xué)家鑒定為鈍頂螺旋藻 57。鄂爾多斯高原成 為了世界上目前發(fā)現(xiàn)有鈍頂螺旋藻分布的第三個(gè)地區(qū)，且其分布屬高緯度地區(qū)（39 23n） 。后來(lái)的研究表明：鄂爾多斯鈍頂螺旋藻可在-20 45 的溫度范圍內(nèi)生存， 適于生長(zhǎng)的溫度范圍為在 6 40 之間，最適生長(zhǎng)的光照強(qiáng)度為 1030 klux，最 適生長(zhǎng)溫度在 24 左右，營(yíng)養(yǎng)成分分析發(fā)現(xiàn)其含有腦黃金（二十二碳六烯酸，學(xué) 名 dha） ，是一個(gè)具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的天然耐低溫、溫度適應(yīng)范圍廣、耐強(qiáng)光的藻種 6。 鄂爾多斯高原毛烏素沙地屬于典型溫帶大陸性干旱、半干旱氣候區(qū)。氣溫日、季 節(jié)變化大，極端最低氣溫為-31 ，極端最高氣溫為 37 ，年平均氣溫為 6.4 7， 無(wú)霜期 130165d；全年日照時(shí)間長(zhǎng)，太陽(yáng)輻射能高。初春和深秋是該地區(qū)日照最為 充足的時(shí)期，平均輻射量達(dá) 55 104 kj/m2，平均溫度 510 7。在螺旋藻溫室養(yǎng)殖 過(guò)程中， 初春和深秋的產(chǎn)量與夏季相比有較大幅度的下降， 一般認(rèn)為是由于低溫所致， 作者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在初春和深秋 11:0014:00 時(shí)螺旋藻的凈光合速率下降近 90%， 出 現(xiàn)午睡現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象的出現(xiàn)是與低溫和強(qiáng)光輻射的耦合作用有關(guān)，但其對(duì)低溫 和強(qiáng)光輻射的反應(yīng)如何？其組成、 生理功能等方面如何適應(yīng)低溫和強(qiáng)光輻射？機(jī)理如 何？其在大規(guī)模溫室養(yǎng)殖中培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、藻體變異等如何控制，藻粉產(chǎn)量 與氣候條件之間存在怎樣的相關(guān)性等等，有必要對(duì)這一系列問(wèn)題進(jìn)行深入、系統(tǒng)地研 究。本研究以?xún)?nèi)蒙古鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻和非洲 chad 湖的鈍頂螺旋藻為 實(shí)驗(yàn)材料，系統(tǒng)地研究了低溫和強(qiáng)光輻射脅迫下內(nèi)蒙古鄂爾多斯鈍頂螺旋藻在生長(zhǎng)、 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻對(duì)低溫、強(qiáng)光的響應(yīng) 2 光合作用、 生理功能、 蛋白表達(dá)等方面的應(yīng)答及與非洲 chad 鈍頂螺旋藻的差異比較； 并對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻規(guī)?；瘻厥茵B(yǎng)殖的產(chǎn)量與光溫的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。 以期揭示 該藻對(duì)低溫和強(qiáng)光的適應(yīng)性及抗逆機(jī)理； 豐富和完善內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原毛烏素沙地 堿湖鈍頂螺旋藻生理、生態(tài)和抗性生理學(xué)的理論； 為螺旋藻養(yǎng)殖在初春和深秋提高產(chǎn) 量、延長(zhǎng)養(yǎng)殖時(shí)間提供科學(xué)依據(jù)，為該藻的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模推廣奠定理論基礎(chǔ)。 1.2 研究綜述 1.2.1 螺旋藻的發(fā)現(xiàn)及產(chǎn)業(yè)化概況 1940 年，法國(guó)藥物學(xué)家 creach 博士在非洲考察時(shí)發(fā)現(xiàn) chad 湖面上有藍(lán)綠色的 水華，當(dāng)?shù)氐耐林藫迫∵@些漂浮物，拌佐料食用，或者曬干后制成類(lèi)似于餅干的食 物，當(dāng)?shù)仉m蔬菜、肉蛋等食物供給極其缺乏，但土著人身體卻十分健壯。藻類(lèi)學(xué)家 dangeard 對(duì) creach 采集的藍(lán)綠色漂浮物進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果是 creach 采集到的藍(lán) 綠色水華是藍(lán)藻門(mén)的螺旋藻所形成的。法國(guó)探險(xiǎn)隊(duì)在 1965 年又來(lái)到非洲，且在 chad 湖及其鄰近湖泊再次發(fā)現(xiàn)藍(lán)綠色的漂浮物，經(jīng)分類(lèi)學(xué)家 compere p. 鑒定其所采集到 的標(biāo)本為鈍頂螺旋藻(spirulina platensis) 8。關(guān)于極大螺旋藻，早在 1521 年西班牙人 就發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厝耸秤迷摵锏穆菪澹?并在市場(chǎng)上出售由其加工的食品 （tecuitlatl 餅干） 2 。 sosa texcoco 公司于 1973 年在墨西哥城東北郊的 sosa texcoco 湖興建了世界上 第一個(gè)螺旋藻工廠，利用該湖富含蘇打成分的湖水進(jìn)行半天然的螺旋藻養(yǎng)殖。1978 年，日本大墨水化學(xué)公司（dic）在泰國(guó)曼谷開(kāi)始螺旋藻的養(yǎng)殖生產(chǎn)，這也是采用人 工培養(yǎng)池進(jìn)行螺旋藻商品化生產(chǎn)的起點(diǎn)。 1981 年 dic 公司和美國(guó) proteus 公司合作在 美國(guó)加州南部的 calipatria 建立了 earthrise farms 公司，并于 1983 年投產(chǎn)，現(xiàn)在已經(jīng) 有包括中國(guó)在內(nèi)的十幾個(gè)國(guó)家生產(chǎn)螺旋藻。相對(duì)于國(guó)外，我國(guó)對(duì)螺旋藻的研究起步較 晚，但發(fā)展很快。1986 年螺旋藻研究列入國(guó)家七五科技攻關(guān)項(xiàng)目 4，我國(guó)第一座螺 旋藻養(yǎng)殖中試基地是胡鴻鈞教授于 1989 年在云南程海湖建立的 9。上世紀(jì) 90 年代， 螺旋藻的研究和開(kāi)發(fā)利用步入快速發(fā)展期，截止到 1995 年，我國(guó)螺旋藻干粉年產(chǎn)量 約達(dá) 800 噸，占世界產(chǎn)量的 1/4，全國(guó)有近 80 多家螺旋藻生產(chǎn)工廠 10。2003 年后， 內(nèi)蒙古螺旋藻養(yǎng)殖異軍突起，依托當(dāng)?shù)鬲?dú)有的資源優(yōu)勢(shì)，螺旋藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速崛起， 目前鄂爾多斯市鄂托克旗的螺旋藻產(chǎn)量已經(jīng)占全國(guó)總產(chǎn)量的 40%左右， 已成為全國(guó)乃 至全世界最重要的螺旋藻養(yǎng)殖地區(qū)。 1.2.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 自從螺旋藻被發(fā)現(xiàn)后，各國(guó)學(xué)者就開(kāi)始了對(duì)于螺旋藻基礎(chǔ)及應(yīng)用等方面的研究 4。人們從螺旋藻的生理、生態(tài)、形態(tài)解剖、分子、營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成等方面開(kāi)展了一系列系 統(tǒng)的研究。例如：分類(lèi)：gomont（1892） ，geitler（1932） ，desikachary（1959）和 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 3 n. jeeji bai（1999）等分別對(duì)螺旋藻分類(lèi)進(jìn)行了研究 4,11,12,13；vonshak 在其 1997 年 的專(zhuān)著中對(duì)螺旋藻的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)組成、生理代謝、規(guī)模養(yǎng)殖等方面進(jìn)行了全面的介紹 14；分子遺傳學(xué)和育種：riccardi 等（1981）對(duì)編碼鈍頂螺旋藻的 rubpcase（1， 5二磷酸核酮糖羧化酶）的大小亞基的基因成功分離，并在 e.coli 中得以表達(dá) 15； tragut（1995）從鈍頂螺旋藻獲得了 4 種限制性?xún)?nèi)切酶，即 spa、spa、spa和 spa ，它們分別是 tthiii、pvu、pvu和 hind r 的同裂酶，這 4 種酶的限制 位點(diǎn)已確定，使人們了解了螺旋藻的 dna 的限制-修飾系統(tǒng)生物學(xué)特征 16。培養(yǎng)條 件：1966 年 c. zarrouk 在巴斯德研究所發(fā)表螺旋藻培養(yǎng)研究的博士論文 17，第一次 使用人工培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)出螺旋藻，使工廠化養(yǎng)殖螺旋藻成為了可能，其所 研制的 z 氏培養(yǎng)液配方至今仍廣泛應(yīng)用于螺旋藻的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及工廠化生產(chǎn)中 18； ogawa （1970）和 tredici 等（1986）對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的研究 19,20； kebede （1996 和 1997） 研究了鹽分對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)的影響及培養(yǎng)的最適條件 21,22； 生理、 生化和生態(tài)： melack （1979）和 vonshak（1996）等對(duì)螺旋藻光合作用的研究 23,24；martel（1992）對(duì)糖苷 酶的研究 25；iltis（1980）對(duì)其生態(tài)的研究26等等。 此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)螺旋藻的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究也不斷深入。例如：分類(lèi)學(xué)研究： 胡鴻鈞（1999）對(duì)螺旋藻的分類(lèi)進(jìn)行了較詳細(xì)的探討和研究 27；形態(tài)學(xué)研究：聶明 （2005）使用原子力顯微鏡對(duì)鈍頂螺旋藻表面微觀形態(tài)的觀察研究 28；培養(yǎng)條件： 張愛(ài)琴等（1989）對(duì)不同光質(zhì)對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)及放氫的影響進(jìn)行了研究 29；殷春濤等 （1997） 研究了不同培養(yǎng)條件對(duì)螺旋藻脂肪酸組成和含量的影響 30； 王巍杰等 （2005） 使用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化 31；生理、生化和生態(tài)：林惠 民（1991）對(duì)鹽澤螺旋藻光合作用的研究 32；邱麗氚等（1998）對(duì)大螺旋藻的色素、 吸收光譜、pod 同工酶的研究 33；李庭古（2006）等對(duì)不同鹽度條件下螺旋藻的生 長(zhǎng)和生化成分的變化進(jìn)行了研究 34； 原生質(zhì)球： 彭國(guó)宏等 （1996） 和郭厚良等 （2000） 對(duì)螺旋藻原生質(zhì)球的制備 35,36；生物活性物質(zhì)：曾昭琪（1994） 、于平等（2008）對(duì) 螺旋藻多糖的研究 37,38；張成武（1996） 、張少斌等（2007）對(duì)藻膽蛋白的研究39,40； 基因工程：秦松等（1993）在螺旋藻中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 41；秦松等（1998）從鈍頂螺旋藻 中分離別藻藍(lán)蛋白基因，并分析了其核苷酸序列 42；鄭俊枝（1997）將質(zhì)粒 pbr325 導(dǎo)入螺旋藻細(xì)胞內(nèi)并得以表達(dá) 43；張海生等（2008）對(duì) gfp 基因在鈍頂螺旋藻中的表 達(dá)進(jìn)行了研究，已初步證明該基因可以在藻株中穩(wěn)定表達(dá) 44。種質(zhì)的遺傳改良，優(yōu) 良藻種的選育：胡天賜等（1990）用 -射線誘變螺旋藻 45；張學(xué)成等（1990）用甲基 磺酸乙酯誘變螺旋藻 46；龔小敏等（1996）使用 co- 射線研究了螺旋藻的的變異情 況 47。但總的來(lái)看，其基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后。 關(guān)于溫度及光強(qiáng)對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)影響的研究，國(guó)內(nèi)外有一些報(bào)道。早在 1967 年法 國(guó)研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明鈍頂螺旋藻最適生長(zhǎng)溫度為 3035 ，是屬于喜高溫的藻 種 8；在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，螺旋藻最適生長(zhǎng)溫度的范圍在 3537 之間，在室外培養(yǎng)， 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻對(duì)低溫、強(qiáng)光的響應(yīng) 4 培養(yǎng)液溫度達(dá)到 39 時(shí)，持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，其光合作用的變化不明顯，也未見(jiàn)明顯的 傷害，白天培養(yǎng)溫度低于 15 時(shí)螺旋藻的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制 48；最適生長(zhǎng)溫度為 35 38 ， 其忍受的最高溫度是 60 49； 螺旋藻最適生長(zhǎng)溫度為 2835 ， 40和 15 為其最高和最低生長(zhǎng)溫度 50。zarrouk 在 1966 年測(cè)得極大螺旋藻（s. maxima）的光飽 和區(qū)間為 2530 klux 17；vonshak a.在其 1997 年出版的螺旋藻生理、細(xì)胞和生物技 術(shù)一書(shū)中提到螺旋藻生長(zhǎng)的最適光照為 150200 mol/m2s 50；鞏東輝（2007）報(bào)道 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻的光飽和點(diǎn)為 180360 mol/m2s 51； 但這些僅僅是零星的報(bào)道， 且局限于螺旋藻培養(yǎng)溫度和光照的研究，缺乏系統(tǒng)、深入的工作，特別是未見(jiàn)到對(duì)螺 旋藻因低溫和高光強(qiáng)導(dǎo)致的午睡反應(yīng)及鄂爾多斯鈍頂螺旋藻抗寒、 抗強(qiáng)光機(jī)理的研 究。 1.2.3 鄂爾多斯高原堿湖鈍頂螺旋藻的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展 鄂爾多斯高原地區(qū)堿湖分布密集，但每個(gè)堿湖的面積相對(duì)較小，該地區(qū)有 61 個(gè) 大于 1 km2的堿湖，占總湖泊面積的 56.1%，堿湖的總面積約為 189 km2，占總湖泊 數(shù)量的 65.8%。從 19952001 年，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)螺旋藻課題組相繼對(duì)鄂爾多斯高 原沙區(qū)的堿湖進(jìn)行了調(diào)研， 在烏審旗的巴彥淖爾湖和查干淖爾湖以及鄂托克旗的白音 淖爾湖和查汗淖爾湖中發(fā)現(xiàn)了 4 種螺旋藻，經(jīng)藻類(lèi)學(xué)專(zhuān)家鑒定為 2 個(gè)新種： 鄂爾多斯 螺旋藻（spirulina erdosensis）和巴彥淖爾螺旋藻（spirulina bayanmurensis）及 2 個(gè) 新記錄種：鈍頂螺旋藻（spirulina platensis）和方胞螺旋藻（spirulina jengr） ，其形態(tài) 特征見(jiàn)下圖及下表 6。 圖 1.1 鄂爾多斯沙區(qū)堿湖四種螺旋藻的光鏡照片(喬辰，李博生。2001) fig.1.1 light micrographs of spirulina in erdos sandy alkaline 1.鄂爾多斯螺旋藻 s. erdosensis 2.巴彥淖爾螺旋藻 s. bayannurensis 3. 鈍頂螺旋藻 s. platensis 4. 方胞螺旋藻 s. jenngr 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 5 表 1.1 鄂爾多斯沙區(qū)堿湖四種螺旋藻的形態(tài)特征 tab. 1.1 morphology of spirulina in the alkaline lakes 物種 鄂爾多斯螺旋藻 s. erdosensis 巴彥淖爾螺旋藻 s. bayannurensis 鈍頂螺旋藻 s. platensis 方胞螺旋藻 s. jenngr 細(xì)胞寬度（m） 912 1.01.2 7.39.0 57 細(xì)胞長(zhǎng)度（m） 2.53.7 4.56.3 23 螺寬（m） 2850 3.04.0 3245 912 螺距（m） 3065 1.62.2 2760 32.037.5 橫璧 有（lm-sem-tem） 有（tem） 有 （lm-sem-tem） 有（lm-sem-tem） 橫璧處顆粒 有 - 有 有 橫璧處縊縮 有 - 有 有 末段形態(tài) 半球型或略變細(xì)或略膨大 鈍圓錐型 鈍圓或略膨大 半球型 顏色 鮮艷藍(lán)綠色 藍(lán)綠色 暗藍(lán)綠色 鮮艷藍(lán)綠色 浮水型（p）/沉 水型（b） b b p b 注：lm：光學(xué)顯微鏡；sem：掃描電鏡；tem：透射電鏡 分布有螺旋藻的堿湖位于海拔高度為 13001400 m 的鄂爾多斯高原毛烏素沙 地，該地區(qū)從氣候區(qū)劃分應(yīng)屬于較典型的溫帶大陸性干旱半干旱區(qū)，全年降水較少， 四季分明，冬季漫長(zhǎng)且溫度較低，夏季短暫但最高溫度可達(dá) 37 ，氣溫日變化劇烈， 晝夜溫差較大， 最低溫度-30 左右， 年均氣溫在 6.4 左右。 年日照時(shí)數(shù) 29573076 h， 年均太陽(yáng)輻射總量 57305930 mj/m2。 分布有螺旋藻的堿湖湖水 ph 為 9.310.5， 夏秋季螺旋藻爆發(fā)時(shí)會(huì)形成藍(lán)綠色水華，堿湖中除螺旋藻外，還發(fā)現(xiàn)有顫藻、綠藻、 輪蟲(chóng)等浮游生物 7。 鄂爾多斯堿湖螺旋藻的發(fā)現(xiàn)具有重要的意義， 一是使我國(guó)的螺旋藻種質(zhì)資源進(jìn)一 步豐富，為螺旋藻優(yōu)良藻種的選育提供了新的材料；二是將螺旋藻的分布從低緯度的 熱帶地區(qū)向北推進(jìn)到處于溫帶的北緯 39o。鄂爾多斯鈍頂螺旋藻是我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)可用 于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的唯一的低溫藻種，改變由于氣溫原因而使我國(guó)在高海拔、高緯度的北 方地區(qū)進(jìn)行螺旋藻養(yǎng)殖受限的局面，并可大大延長(zhǎng)中部地區(qū)螺旋藻養(yǎng)殖的有效時(shí)數(shù)。 自 1996 年鄂爾多斯鈍頂螺旋藻發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究人員就開(kāi)始對(duì)其從生理、生化、分子 生物學(xué)等方面進(jìn)行了相關(guān)基礎(chǔ)研究。高凌巖（2003）對(duì)鄂爾多斯鈍頂螺旋藻生態(tài)適應(yīng) 性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：該藻在 24 和連續(xù)