抗原與抗體的相互作用及免疫學(xué)檢測.ppt

第七章 抗原與抗體的相互作用及免疫學(xué)檢測,體液免疫的基礎(chǔ)是抗原和抗體分子的結(jié)合，這種結(jié)合可以是游離形式的，也可以結(jié)合在細(xì)胞表面。 通過抗原抗體的結(jié)合繼發(fā)出各種生理效應(yīng)，如：溶細(xì)胞效應(yīng)、促吞噬作用、凝集作用、沉淀作用、調(diào)節(jié)作用等，形成一整套機(jī)體體液免疫功能。 抗原決定簇與抗體結(jié)合部位的結(jié)合，要求分子結(jié)構(gòu)有互補(bǔ)性，也因此具有高度的特異性。,第一節(jié) 抗原與抗體反應(yīng)的特點(diǎn),一、特異性 抗原與抗體相互結(jié)合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原決定簇和抗體結(jié)合位點(diǎn)之間，且以親和力的作用方式結(jié)合在一起?？乖贵w的結(jié)合并沒有共價鍵形成，而是由這些特定部位之間的短程分子力相互作用的結(jié)果。這些吸引力只有在極短的距離內(nèi)才有效。因此抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)在空間上必須處于緊密接觸狀態(tài)，才能產(chǎn)生足夠的結(jié)合力。這種分子間的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)決定了抗原抗體結(jié)合的專一性。,抗原抗體分子間的作用力，即親和力包括以下幾種： 1、鹽鍵（離子鍵） 2、范德華力 3、疏水作用 4、氫鍵,二、抗原與抗體結(jié)合的可逆性 抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)是一個可逆的反應(yīng) Ab+Ag Ab:Ag 由于抗原抗體結(jié)合的可逆性，可利用親和層析法分離純化抗原或抗體；利用待測抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原與抗體的競爭結(jié)合，進(jìn)行抗原或抗體的定量測定，如放免檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法等,三、抗原與抗體反應(yīng)中量的關(guān)系 當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時，如果是顆?？乖?，則出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；如果是可溶性抗原，則產(chǎn)生沉淀作用。這些可見現(xiàn)象的出現(xiàn)是以抗原與抗體反應(yīng)特異性和親和力為基礎(chǔ)的，同時也是抗原抗體反應(yīng)的繼發(fā)過程。 當(dāng)抗原與同型抗體相遇時，在合適條件下，不論彼此量的多少，都立即發(fā)生特異性的結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這一過程通常只需要幾秒的時間便可完成，稱為反應(yīng)的一級階段。,在一級階段之后，繼發(fā)出現(xiàn)抗原與抗體間進(jìn)一步交聯(lián)而形成網(wǎng)絡(luò)狀凝集物，進(jìn)而出現(xiàn)可見的凝集和沉淀，稱為反應(yīng)的二級階段。這一階段是抗原抗體網(wǎng)格生長的階段，速率要慢的多，且在很大程度上依賴于溫度、離子強(qiáng)度等外界條件，但更重要的是需要合適的抗原抗體分子比例。只有當(dāng)二者的結(jié)合價彼此飽和時，才能連接成一個大網(wǎng)格樣凝集物，出現(xiàn)凝集或沉淀。,抗原抗體凝集（沉淀）反應(yīng)形成的特點(diǎn)：,1、抗原結(jié)合價必須在2價以上； 2、抗體結(jié)合價也必須是2價或2價以上； 3、抗原抗體能形成復(fù)合物但不一定能形成沉淀； 4、抗原抗體結(jié)合形成大分子凝集物的前提是要求其結(jié)合價彼此飽和； 5、當(dāng)抗原大大過量時，只有溶解狀態(tài)的抗原抗體復(fù)合物，而無沉淀出現(xiàn)，在免疫檢測中稱為前帶現(xiàn)象。,第二節(jié) 抗血清的制備和抗體的純化,抗體產(chǎn)生的特異免疫應(yīng)答是指機(jī)體受外源物質(zhì)刺激后，產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的過程。在這一免疫應(yīng)答過程中，除依賴于抗原物質(zhì)有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)外，還依賴于動物機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。機(jī)體免疫應(yīng)答能力又受遺傳因素的控制及機(jī)體的生理狀況、抗原物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的途徑和佐劑的使用等因素的影響。 由于動物的遺傳性不同，同一抗原對不同種動物、同種不同品系甚至不同個體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的。因此，在進(jìn)行動物免疫時，必須選擇對該抗原敏感的動物，而且必須是年輕的、健康的。常用的動物有馬、羊、兔、鼠和豚鼠。,當(dāng)抗原初次進(jìn)入具有應(yīng)答能力的動物體內(nèi)后，經(jīng)過一段較長的潛伏期才出現(xiàn)抗體，又經(jīng)過一段高峰期后，抗體量逐漸下降直至消失。這段時間總的抗體量是較低的，主要成分是IgM，此為機(jī)體對抗原的初次反應(yīng)。但當(dāng)抗原再次進(jìn)入該機(jī)體時，血清中抗體很快出現(xiàn)，含量也遠(yuǎn)高于初次反應(yīng)，其抗體成分主要是IgG，此為再次反應(yīng)。,佐劑在抗血清制備中的作用： 由于佐劑有吸附和包埋抗原的“儲藏所”作用，延長了抗原在體內(nèi)的存留時間，便于抗原較長時間的、不間斷的刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使初次反應(yīng)與再次反應(yīng)結(jié)合在一起，其免疫效果更為理想。另外，在佐劑中含有激活巨噬細(xì)胞等生理功能的卡介苗類物質(zhì)，可提高抗原的免疫原性，因此要獲得高效價的抗血清，常使用各種類型的佐劑。,動物個體的不同組織部位對抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴結(jié)、脾臟、足掌、眼瞼結(jié)膜等是反應(yīng)敏感部位，也是免疫動物的常用部位。,一、動物的免疫,1、抗原用量：0.5mg/kg 2、佐劑：弗氏佐劑 弗氏佐劑的成分和使用 3、免疫方法：淋巴結(jié)注射、腹部皮下注射、四足掌皮內(nèi)注射。 4、免疫次數(shù)：每隔7-10天免疫一次，共需3-4次。第二次免疫后開始測效價。,二、抗血清制備和抗體效價測定,1、采血方法：兔頸動脈放血、兔心臟取血、兔耳緣靜脈放血、鼠心臟取血、剪尾采血、眼窩采血。 2、抗血清制備：血液室溫放置1-2h或冰箱內(nèi)4度過夜，血清便可充分析出，用滴管吸出或離心分離取得。分離好的血清加入0.02%疊氮化鈉，在4度冰箱內(nèi)保存可長達(dá)半年。 3、效價測定：用免疫動物時的抗原濃度作抗體效價測定的抗原濃度。以出現(xiàn)沉淀反應(yīng)的抗血清的最大稀釋倍數(shù)來表示抗血清的效價。,三、免疫球蛋白的純化,由于抗原抗體的結(jié)合具有高度的特異性，在免疫檢測中常常直接運(yùn)用抗血清進(jìn)行，而無需對抗體進(jìn)行純化。 隨著免疫檢測技術(shù)的發(fā)展，如用鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記抗體作免疫電鏡觀測，用熒光素、酶、同位素標(biāo)記抗體作組織細(xì)胞染色，或?qū)乖M(jìn)行定量測定，就必須對抗體進(jìn)行純化，但這類的純化多數(shù)是類別的純化。,抗體純化的方法： 1、硫銨鹽析法：簡便、蛋白質(zhì)變性較少，33%飽和度的硫銨可以沉淀所有各類免疫球蛋白；缺點(diǎn)是分離的純度較差，對IgA類抗體來說，濃鹽可使其形成二聚體，不宜采用。,2、Cohn冷酒精沉淀法：,IgA相對分子量160000，IgM相對分子量1000000，故可通過分子篩將兩者分開而得到純品。,3、硫銨鹽析和DEAE-纖維素柱層析法純化IgG 在pH7.5的溶液中IgG帶正電，其他血清蛋白帶負(fù)電，因此陰離子交換劑DEAE-纖維素可以一次將IgG提純到很高的純度,4、IgM的純化方法：18%飽和度硫銨沉淀+DEAE-纖維素柱層析法。,第三節(jié) 抗原與抗體反應(yīng)-免疫檢測法,抗原與抗體結(jié)合后，只有出現(xiàn)可見的反應(yīng)，如凝集、溶血、沉淀實(shí)驗(yàn)等，或用熒光素、酶、放射性同位素等標(biāo)記方法提高可測性，才便于在免疫檢測中運(yùn)用?？梢娦苑磻?yīng)的出現(xiàn)，對抗原抗體分子合適比例的要求遠(yuǎn)比對彼此絕對量方面要高得多。這就是說，一方面在進(jìn)行免疫檢測時要注意抗原抗體的用量；另一方面只要提高可見度或可測性，便可大大提高免疫檢測方法的靈敏度。,一、凝集反應(yīng),凝集反應(yīng)是指顆粒抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆粒抗原如完整的細(xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。,二、沉淀反應(yīng),當(dāng)抗原是可溶性分子時，與抗體結(jié)合則形成沉淀。 1、絮狀沉淀反應(yīng) 一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的蛋白質(zhì)沉淀?？捎糜趯ふ铱乖贵w反應(yīng)的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。 2、環(huán)狀沉淀反應(yīng) 在試管中加入抗體后，小心加入相應(yīng)抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀。不能用于定量測定。,3、雙向擴(kuò)散：又稱瓊脂擴(kuò)散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。 瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴(kuò)散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀。可觀測到沉淀弧。 沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體存在多種體系時，會出現(xiàn)多條沉淀弧。,雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。,抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。,4、單向免疫擴(kuò)散：又稱單向瓊脂擴(kuò)散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴(kuò)散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內(nèi)加入未知量的相應(yīng)抗原。在37度保溫過程中，孔內(nèi)的抗原向周圍擴(kuò)散，與抗體形成沉淀圈。根據(jù)沉淀圈的大小確定抗原的含量,另外還有其他眾多的免疫檢測技術(shù)和手段，其機(jī)理都利用了抗原抗體的沉淀反應(yīng)。例如微量免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。只不過其檢測的對象和檢測的目的各有不同。,三、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),當(dāng)抗體與細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒抗原結(jié)合并形成抗原抗體復(fù)合物后，可結(jié)合補(bǔ)體引起溶菌、溶血效應(yīng)。用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)既可以測知患者血清中補(bǔ)體的總量，也可以檢測未知抗原或抗體的量。 測定人血清補(bǔ)體總量的方法是以綿羊紅血球的溶血為指示。當(dāng)綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結(jié)合后，加患者血清，觀測溶血程度。,用于測定未知抗原/抗體時，采用兩套系統(tǒng)，一套是待測的抗原抗體系統(tǒng)，稱為檢測系統(tǒng)，一套是包括綿羊紅血球和抗綿羊紅血球抗體的指示系統(tǒng)。待測系統(tǒng)中有無待測得抗原/抗體是利用指示系統(tǒng)中是否出現(xiàn)溶血來判斷。 反應(yīng)的過程是首先加待測得抗原/抗體，反應(yīng)一段時間后加入補(bǔ)體，在反應(yīng)一段時間后加指示系統(tǒng)。有待測抗原抗體結(jié)合時，必然結(jié)合補(bǔ)體，不會出現(xiàn)溶血，沒有待測物質(zhì)時出現(xiàn)溶血。,四、熒光抗體技術(shù),免疫熒光法是將熒光素與特異性血清抗體以化學(xué)方式結(jié)合起來，然后將此熒光標(biāo)記了的抗體作為一種試劑在特定條件下浸染標(biāo)本，使與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，再在熒光顯微鏡下，以紫外光為光源進(jìn)行觀察。當(dāng)出現(xiàn)熒光時，表明標(biāo)記抗體存在，相應(yīng)的抗原也存在。 免疫熒光法有直接法和間接法兩種。,第四節(jié) 免疫親和層析,生物高分子具有能和某種相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，例如酶的活性中心或別構(gòu)中心能和專一的底物、抑制劑、輔助因子效應(yīng)劑通過某些次級鍵相結(jié)合，并在一定條件下又可以解離?？贵w與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補(bǔ)的脫氧核糖核酸等體系，都具有類似的特性。這種高分子和配基之間形成專一的可解離的復(fù)合物的能力稱為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物分子間可逆的結(jié)合和解離的原理發(fā)展起來的層析就稱為親和層析。,親和層析法的基本過程：