無菌、微生物檢查法方法學驗證實例.ppt

2019/7/11,1,無菌檢查、微生物 限度檢查 方法學 驗證實例,2019/7/11,2,虎杖苷注射液無菌檢查的方法驗證,樣品：虎杖苷注射液由深圳海王藥業(yè)有限公司 提供，批號20040305。 培養(yǎng)基：無菌檢查用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基， 批號040203；霉菌液體培養(yǎng)基，批號 040302； 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號 0403045；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號 040513；0.1%蛋白胨溶液，批號050217；虎紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號040202；由中檢所所培養(yǎng)基室提供。,2019/7/11,3,方法：中國藥典2005版無菌檢查中薄膜 過濾法方法驗證 驗證試驗用菌種：驗證試驗用菌種包括金黃色葡萄球菌（26003）、銅綠假單胞菌（10104）、枯草芽孢桿菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），來自中國醫(yī)學細菌保藏中心。,2019/7/11,4,菌液制備： 取經(jīng)34培養(yǎng)1824小時的金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至105107約為50100cfu/ml備用。 取經(jīng)24培養(yǎng)1824小時的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至105約為50100cfu/ml備用。,2019/7/11,5,取經(jīng)34培養(yǎng)1824小時的生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物1ml ，加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至107備用。 取經(jīng)培養(yǎng)一周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加0.9%氯化鈉溶液3ml，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，標準比濁管比濁后，取1ml加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至104約為50100cfu/ml備用。,2019/7/11,6,供試液制備：取樣品10瓶分別加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，過濾。 7. 活菌計數(shù) 活菌計數(shù)結(jié)果見表1。,2019/7/11,7,2019/7/11,8,方法驗證 直接接種法：取樣品12支，分別接種8支硫乙醇酸鹽和4支霉菌液體培養(yǎng)基2ml/支后，再按要求加入相應的陽性菌液（30-100個/ml），置規(guī)定溫度培養(yǎng)3-5天，逐日觀察結(jié)果。,2019/7/11,9,薄膜過濾法： 取樣品11支，將樣品過濾于封閉式濾器（3聯(lián)筒/套），用0.1%蛋白胨氯化鈉溶液沖洗 500ml后，再分別人工污染金黃色葡萄球菌、枯草桿菌50100個/筒即可，同時平行做稀釋劑的對照組。將稀釋劑對照濾筒和污染陽性菌的驗證濾筒置37培養(yǎng)35d，逐日觀察，結(jié)果見表2、3、4。,2019/7/11,10,2019/7/11,11,2019/7/11,12,2019/7/11,13,結(jié)論： 根據(jù)上述結(jié)果，由于采用直接接種 法進行虎杖苷注射液的無菌檢查，存在 對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌生長的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的無菌檢查應依據(jù)中國藥典無菌檢查方法中的薄膜過濾法進行，沖洗量規(guī)定為500ml。,2019/7/11,14,頭孢噻肟鈉無菌原料的無菌實驗方法驗證,樣品：頭孢噻肟鈉無菌原料，規(guī)格：0.5g/瓶；批號：40807001；生產(chǎn)單位：Aventis Pharma Deutschland GmbH 培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、普通斜面、真菌斜面、營養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂(均由中國藥品生物制品檢定所培養(yǎng)基室提供) -內(nèi)酰胺酶：2ml大于300單位/毫升（批號：20030630）,2019/7/11,15,驗證試驗用菌種： （1）金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003； (2) 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B) 63501； (3) 大腸埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B) 44102； (4) 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104； （5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64941； (6) 白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98001； (7) 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98003。,2019/7/11,16,儀器和濾器：HTY-2000A集菌儀，全封閉無菌試驗過濾培養(yǎng)器（批號20050105）北京牛?；蛴邢薰?。 方法：中國藥典2005年版無菌檢查的驗證實驗,2019/7/11,17,操作方法 菌液制備： 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中, 生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中, 32.52.5培養(yǎng)1824小時；,2019/7/11,18,取經(jīng)32.52.5培養(yǎng)1921h小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至約10-510-8之間。 取經(jīng)36培養(yǎng)1822h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，混勻備用。,2019/7/11,19,白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中見附錄1.3, 25.52.5培養(yǎng)2448小時。 取經(jīng)25.52.5培養(yǎng)72小時的白色念珠菌真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4ml洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，取1ml加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，取1.2ml加生理鹽水9ml，混勻備用。,2019/7/11,20,將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.52.5培養(yǎng)57d，使大量的孢子成熟。取經(jīng)25培養(yǎng)7d的黑曲霉真菌斜面培養(yǎng)物，加入生理鹽水4ml洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，稀釋至10-4，取0.5ml加生理鹽水10ml混勻備用。,2019/7/11,21,菌液計數(shù)：分別取上述5種細菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入營養(yǎng)瓊脂約18ml。3035培養(yǎng)（生孢梭菌置厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）。分別取上述2種真菌菌液1ml加入培養(yǎng)皿，每種菌液做平行2皿。注入虎紅瓊脂約18ml。2328培養(yǎng)。,2019/7/11,22,供試液制備：每2支以100ml生理鹽水溶解，混勻備用。 薄膜過濾：將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，每次50ml，在最后一次的沖洗液中逐一加入試驗菌少于100CFU。按規(guī)定將培養(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。每天觀察并記錄結(jié)果。,2019/7/11,23,陽性對照：另取濾筒，不過濾供試品，其它操作同上，作為陽性對照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗菌及相應的培養(yǎng)基逐一進行驗證。取未加樣品的濾器分別加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基5桶及真菌培養(yǎng)基2桶，100ml/桶。 陰性對照：兩個濾器桶內(nèi)各過濾生理鹽水200ml，然后分別加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各100ml，不加對照菌液，分別于30-35及23-28培養(yǎng)。,2019/7/11,24,培養(yǎng)：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基桶30-35培養(yǎng)；真菌培養(yǎng)基桶23-28培養(yǎng)。觀察結(jié)果。 結(jié)果 細菌和真菌數(shù)計數(shù)結(jié)果分別見表1和表2。,2019/7/11,25,表1 細菌數(shù)計數(shù) 表2 真菌數(shù)計數(shù)結(jié)果,2019/7/11,26,實驗結(jié)果見表3和表4 表3 細菌實驗結(jié)果 (20小時觀察),2019/7/11,27,表4 36小時觀察真菌結(jié)果,2019/7/11,28,大腸埃希菌菌液制備：取經(jīng)35培養(yǎng)1920h 的大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物1ml，加9ml生理鹽水，10倍稀釋至10-6，取0.4ml加鹽水10ml混勻，做活菌計數(shù)備用。 取12支樣品，每2支以100ml生理鹽水溶解，沖洗100ml每次，做沖300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml和-內(nèi)酰胺酶2支。分別加入大腸桿菌菌液（肉湯培養(yǎng)物10倍稀釋至10-7）1ml。結(jié)果見表5。,2019/7/11,29,表5 實驗結(jié)果（大腸埃希菌菌數(shù)54CFU）,2019/7/11,30,結(jié)論： 頭孢噻肟鈉無菌原料無菌檢查法:,取樣量3.0克，采用薄膜過濾法（封閉濾器為北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司生產(chǎn)）。沖洗液為0.9的氯化鈉溶液，沖洗量800ml，加酶量2支（大于300單位/ml）以大腸埃希菌為陽性對照菌。,2019/7/11,31,復方磷酸可待因（歐博士止咳露）溶液微生物限度檢查法驗證實驗,樣品：復方磷酸可待因（歐博士止咳露），批號309315 、402021，生產(chǎn)廠家為香港歐化藥業(yè)有限公司。 驗證用菌種： 枯草桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。 方法： 中國藥典有關(guān)微生物限度檢查法方法驗證試驗。,2019/7/11,32,具體操作方法 菌液制備： 取經(jīng)37培養(yǎng)1824h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至10-5 10-7，細菌數(shù)約為50100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。 (2) 取經(jīng)25 培養(yǎng)1824小時的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 10-7，細菌數(shù)約為50100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。,2019/7/11,33,取經(jīng)25 培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加35ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標準比濁管比濁，然后取1 ml +9 ml鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，細菌數(shù)約為50100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。 供試液制備： 吸取樣品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液90ml濃度均為1：10供試液，分別人工污染上述5種代表試驗菌株。,2019/7/11,34,回收率測定： 試驗組: 分別取不同品種的1：10供試液1 ml、50100個/ ml 試驗菌株同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時觀察結(jié)果。薄膜過濾法以最后一次的沖洗液加入試驗菌. (2) 活菌組 測定每一菌株的試驗菌數(shù) (3) 供試液對照 測定供試品本底菌數(shù) (4) 稀釋劑對照組,2019/7/11,35,結(jié)果 菌落計數(shù)結(jié)果、常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法在復方磷酸可待因微生物限度檢查法的驗證結(jié)果見表1、2和表3。,2019/7/11,36,表1 菌落計數(shù)（cfu/ml）,2019/7/11,37,表2 復方磷酸可待因微生物限度檢查方法驗證 （常規(guī)法）,2019/7/11,38,從表2結(jié)果可以看出: （1）采用常規(guī)方法檢驗復方磷酸可待因溶液供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%，可采用常規(guī)方法檢驗。 （2）復方磷酸可待因?qū)瘘S色葡萄球菌、枯草桿菌有不同程度的抗菌活性，供試品回收率為0.0229.2%，均低于70%。,2019/7/11,39,培養(yǎng)基稀釋法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供試液，再加1520 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2448小時觀察結(jié)果細菌計數(shù)，測定回收率。 常規(guī)法為1ml供試液加1520ml菌落計數(shù)用培養(yǎng)基；培養(yǎng)基稀釋法則為0.5ml供試液加1520ml菌落計數(shù)用培養(yǎng)基為2倍稀釋，0.2ml供試液加1520ml菌落計數(shù)用培養(yǎng)基為5倍稀釋。,2019/7/11,4