GB5009.224-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定2 0 1 6 - 0 8 - 3 1發(fā)布2 0 1 7 - 0 3 - 0 1實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā) 布G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T2 1 4 9 82 0 0 8 大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T2 1 4 9 82 0 0 8相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定” ; 刪除了原標(biāo)準(zhǔn)范圍中“ 胰蛋白酶抑制劑活性可以用來表示豆制品的烘烤程度” ; 修改了“ 原理” ; 修改了“ 試劑和材料” ; 刪除了“ 采樣” ; 修改了“ 試樣制備” ; 刪除了“ 測(cè)定次數(shù)” ; 修改了“ 結(jié)果計(jì)算” ; 修改了“ 精密度” ; 刪除了“ 檢驗(yàn)報(bào)告” ; 刪除了附錄B。G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性(T I A) 的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定。2 原理胰蛋白酶可與苯甲酰- L -精氨酸-對(duì)硝基苯胺(L - B A P A) 發(fā)生反應(yīng), 生成對(duì)硝基苯胺, 該物質(zhì)在4 1 0n m下有特征吸收。大豆制品中的胰蛋白酶抑制劑可抑制此反應(yīng), 使吸光度值下降, 其下降程度與胰蛋白酶抑制活性成正比。采用分光光度計(jì)在4 1 0n m處測(cè)定該反應(yīng)前后的吸光度值, 可定量分析胰蛋白酶抑制劑活性。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的三級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 鹽酸(HC l) 。3.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。3.1.3 氫氧化鈉(N a OH) 。3.1.4 氯化鈣(C a C l22 H2O) 。3.1.5 胰蛋白酶(T r y p s i n) :-2 0凍藏。3.1.6 苯甲酰- L -精氨酸-對(duì)硝基苯胺(L - B A P A) 。3.1.7 三羥甲基氨基甲烷NH2C(CH2OH)3,T r i s 。3.1.8 二甲亞砜(C2H6O S,DMO S) 。3.2 試劑配制3.2.1 鹽酸溶液(6m o l/L) : 取5 0m L鹽酸(3.1.1) 加入水中, 用水稀釋至1 0 0m L, 混勻。3.2.2 鹽酸溶液(1m o l/L) : 取8 3m L鹽酸(3.1.1) 加入水中, 用水稀釋至10 0 0m L, 混勻。3.2.3 鹽酸溶液(0.1m o l/L) : 取8.3m L鹽酸(3.1.1) 加入水中, 用水稀釋至10 0 0m L, 混勻。3.2.4 鹽酸溶液(0.0 0 1m o l/L) : 取1m L1m o l/L鹽酸溶液加入水中, 用水稀釋至10 0 0m L, 混勻。3.2.5 乙酸溶液(5.3m o l/L) : 取3 0m L冰乙酸(3.1.2) 加入水中, 用水稀釋至1 0 0m L, 混勻。3.2.6 氫氧化鈉溶液(0.0 1 m o l/L) : 稱取0.4 0g氫氧化鈉(3.1.3) , 溶于5 0 0 m L水中, 用水稀釋至10 0 0m L。3.2.7 氯化鈣鹽酸溶液: 稱取0.7 3 5g氯化鈣(3.1.4) 溶解于1L0.0 0 1m o l/L鹽酸溶液中, 用1m o l/L鹽酸溶液和0.1m o l/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)p H至3.00.1。G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 62 3.2.8 胰蛋白酶儲(chǔ)備液(0.2 7 0m g/m L) : 將胰蛋白酶(3.1.5) 放置至室溫, 稱取胰蛋白酶2 7.0m g于小燒杯中, 用氯化鈣鹽酸溶液(3.2.7) 溶解, 轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 以氯化鈣鹽酸溶液(3.2.7) 定容至刻度。保存于04冰箱中, 最多可使用5d。3.2.9 胰蛋白酶使用液(0.0 1 35m g/m L) : 用移液管量取5.0m L胰蛋白酶儲(chǔ)備液(3.2.8) 于1 0 0m L容量瓶中, 用氯化鈣鹽酸溶液(3.2.7) 定容至刻度。3.2.1 0 三羥甲基氨基甲烷-氯化鈣緩沖液: 稱取6.0 5g三羥甲基氨基甲烷(3.1.7) 和0.7 3 5g氯化鈣(3.1.4) 溶于預(yù)先加入9 0 0m L水的帶有刻度的10 0 0m L燒杯中, 用1m o l/L鹽酸溶液和0.1m o l/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)p H值至8.20.1, 加水至10 0 0m L。3.2.1 1 L - B A P A溶液: 稱取6 0m gL - B A P A(3.1.6) 用1m L二甲亞砜(3.1.8) 溶解, 用三羥甲基氨基甲烷-氯化鈣緩沖溶液(3.2.1 0) 轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 稀釋至刻度。用時(shí)現(xiàn)配。4 儀器和設(shè)備4.1 可見分光光度計(jì)。4.2 分析天平: 感量分別為0.0 1g、0.0 0 1g、0.0 0 01g。4.3 酸度計(jì): 精度為0.0 5。4.4 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。4.5 渦旋振蕩器。4.6 恒溫水浴鍋: 精度為0.1。5 分析步驟5.1 試樣制備對(duì)于粉末狀樣品, 取有代表性的樣品至少2 0 0g, 充分混勻后備用。對(duì)于塊狀或顆粒狀樣品, 取有代表性的樣品至少2 0 0g, 粉碎至4 2 5m以下, 充分混勻備用。粉碎過程中避免樣品過熱。5.2 樣品提取稱取1g 1 0g( 精確至0.0 0 1g) 制備好的試樣(5.1) 于1 0 0m L錐形瓶中, 加入5 0m L0.0 1m o l/L氫氧化鈉溶液, 搖勻。用1m o l/L鹽酸溶液和0.1m o l/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)p H至9.50.1, 置于0 4冰箱中靜置1 5h2 4h。將樣品提取液取出放置至室溫, 轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 用水定容至刻度, 搖勻。經(jīng)過1 5m i n的沉淀后, 根據(jù)需要對(duì)樣品提取液進(jìn)行稀釋。稀釋度取決于預(yù)期的樣品T I A值。將提取液保存于04冰箱中, 可保存1d。5.3 樣品提取液稀釋參照附錄A中表A.1的稀釋方案, 將樣品提取液稀釋三個(gè)不同稀釋濃度, 確保在三個(gè)抑制百分率中至少有一個(gè)T I A值的測(cè)定結(jié)果在4 0%6 0%之間。如果三個(gè)測(cè)定結(jié)果均沒有在此范圍內(nèi), 則需要改變稀釋度重新測(cè)定。5.4 胰蛋白酶使用液活性測(cè)定依據(jù)表1吸取一定量的溶液分別加入至兩個(gè)1 0m L離心管中。G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 63 表1 胰蛋白酶使用液活性測(cè)定時(shí)各溶液加入量單位為毫升加入物標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)L - B A P A溶液(3.2.1 1)55水33乙酸溶液(3.2.5)10 用渦旋振蕩器(4.5) 混勻離心管中的溶液, 置于3 7恒溫水浴鍋(4.6) 中, 保溫1 0m i n。在空白管中和標(biāo)準(zhǔn)管中各加入1m L胰蛋白酶使用液(3.2.9) , 用渦旋振蕩器(4.5) 將試管內(nèi)溶液混勻。將離心管放回到恒溫水浴鍋(4.6) 中。在3 7水浴中保溫1 0m i n 5s后。在標(biāo)準(zhǔn)管中加入1m L乙酸溶液(3.2.5) , 用渦旋振蕩器(4.5) 混勻。將離心管置于離心機(jī)(4.4) 中, 以40 0 0r/m i n的速度離心1 0m i n。采用可見分光光度計(jì)(4.1) , 于4 1 0n m波長(zhǎng), 用1 0mm比色皿, 以水調(diào)零, 測(cè)定上清液的吸光度。該溶液應(yīng)在2h內(nèi)保持穩(wěn)定, 胰蛋白酶使用液的吸光度和空白液的吸光度之間的差值(Ar-Ab r) 為0.3 8 00.0 5 0時(shí), 可以使用。否則, 需重新配制胰蛋白酶使用液。必要時(shí), 取用一瓶新鮮的胰蛋白酶。5.5 胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定按表2分別吸取一定量的四種溶液分別加入至四個(gè)1 0m L離心管中。每一樣品的試樣稀釋液(5.3) 均需準(zhǔn)備相應(yīng)的空白溶液。樣品提取液和相應(yīng)的空白溶液在測(cè)定過程中應(yīng)同時(shí)進(jìn)行操作( 包括離心步驟) 。表2 胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定時(shí)各溶液加入量單位為毫升加入物標(biāo)準(zhǔn)空白標(biāo)準(zhǔn)樣品空白樣品L - B A P A溶液(3.2.1 1)5555試樣稀釋液(5.3)0011水3322乙酸溶液(3.2.5)1010 用渦旋振蕩器(4.5) 混勻離心管中的溶液, 并置于3 7恒溫水浴鍋(4.6) 中, 保溫1 0m i n。在四個(gè)離心管中各加入1m L胰蛋白酶使用液(3.2.9) 。用渦旋振蕩器將管內(nèi)溶液混勻后, 將試管放回到恒溫水浴鍋(4.6) 中。在3 7水浴中保溫1 0m i n 5s后, 在標(biāo)準(zhǔn)試管中和樣品管中加入1m L乙酸溶液(3.2.5) , 混勻。將離心管置于離心機(jī)(4.4) 中, 以40 0 0r/m i n速度離心1 0m i n。采用可見分光光度計(jì)(4.1) , 于4 1 0n m波長(zhǎng), 用1 0mm比色皿, 以水調(diào)零, 測(cè)定上清液的吸光度。該溶液可在2h內(nèi)保持穩(wěn)定。6 分析結(jié)果的表述6.1 樣品提取液的抑制率樣品提取液的抑制率按式(1) 計(jì)算:i=(Ar-Ab r)-(As-Ab s)(Ar-Ab r)1 0 0%(1)G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 64 式中:i 抑制率;Ar 標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度;Ab r 標(biāo)準(zhǔn)空白溶液的吸光度;As 樣品溶液的吸光度;Ab s 樣品空白溶液的吸光度;1 0 0% 換算系數(shù)。6.2 胰蛋白酶抑制劑活性胰蛋白酶抑制劑活性按式(2) 計(jì)算, 以每克樣品抑制胰蛋白酶毫克數(shù)(m g/g) 表示:T I A=i1 0 0%fmF(2) 式中:T I A 胰蛋白酶抑制劑活性, 單位為毫克每克(m g/g) ;i 抑制百分率;1 0 0% 換算系數(shù); 胰蛋白酶使用液的質(zhì)量濃度, 單位為毫克每毫升(m g/m L) ;f 5.61 03, 該數(shù)值是滿足本實(shí)驗(yàn)胰蛋白酶活性條件下(5.4) 的胰蛋白酶純度折算系數(shù);m 試樣的質(zhì)量, 單位為克(g) ;F 樣品提取液的稀釋度( 表A.1所示理論稀釋度,m L/1 0 0m L) 。計(jì)算結(jié)果精確至0.1m g/g。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。8 其他本方法的檢出限為0.5m g/g。G B5 0 0 9.2 2 42 0 1 65 附 錄 A樣品提取液稀釋方案 樣品提取液的稀釋方案見表A.1。表A.1 樣品提取液的稀釋表預(yù)計(jì)的T I Am g/g不同抑制百分率的理論稀釋度(F)m L/1 0 0m L4 0%5 0%6 0%0.56 17 69 11.03 03 84 51.52 02 53 02.01 51 92 32.51 21 51 83.01 01 31 53.58.61 11 34.07.69.51 14.56.78.41 05.06.07.69.165.06.37.674.35.46.5