實驗一紫外-可見分光光度計的性能檢驗.ppt

實驗一 紫外可見分光光度計 的性能檢驗,一、實驗?zāi)康?1、掌握紫外可見分光光度計性能的檢驗方法 2、學(xué)會UV1100型紫外可見分光光度計的使用方法 二、實驗原理 對分光光度計進(jìn)行性能檢查，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確。,三、儀器與試劑 UV1100型紫外可見分光光度儀 石英比色皿（一對） 擦鏡紙 蒸餾水 6mg/100ml K2Cr2O7溶液 0.002mol/mol KMnO4溶液,四、實驗內(nèi)容及操作步驟 1、比色皿的配對性,注入,蒸餾水,兩個比色皿,分別,440nm,以一個比色皿,為空白（T1100）,測定,另一個比色皿的T2,T=T1-T2,T0.5%,T0.5%,兩個比色皿配對,兩個比色不配對，應(yīng)進(jìn)行校正,2、波長精度的檢查,以蒸餾水為空白,測定,KMnO4溶液的吸收曲線,若測得的最大吸收波長在5251nm以內(nèi),說明,儀器波長精度符合使用要求,500,800,0.4,0.2,(nm),A,0,3、重復(fù)性的檢查,以0.02mol/L的H2SO4為空白,在257nm處,同一K2Cr2O7溶液的T，連續(xù)測定7次,測定,求出極差,若極差0.5%,儀器的重復(fù)性符合使用要求,4.吸收值準(zhǔn)確度的檢查,235nm、257nm,分別測定 K2Cr2O7溶液吸光度并計算吸收系數(shù),以0.02mol/L的H2SO4為空白 (T100%）,313nm、350nm,與下表規(guī)定的,吸收系數(shù)比較,若相對偏差在1%以內(nèi),說明,儀器符合使用要求,五、思考題 1、同種比色皿透光度的差異對測定有何影響？ 2、檢查分光光度計的重復(fù)性對測定有什么實際意義？,實驗二 吸收曲線的測繪及 吸收系數(shù)的測定,一、實驗?zāi)康?1、掌握測繪吸收曲線的方法 2、學(xué)會測定吸收系數(shù) 二、實驗原理 1、若溶劑固定不變，化合物吸收曲線所出現(xiàn)的max、min或(S)為一定值，且數(shù)目也一定，為鑒別化合物提供了有力的證據(jù)。 2、百分吸收系數(shù)是指當(dāng)溶液濃度為1%，液層厚度為1cm時的吸光度。 即,三、儀器與試劑 UV1100型紫外可見分光光度計 石英比色皿（一對） 95%乙醇（A.R） 0.005%丹皮酚對照品溶液,四、實驗內(nèi)容及操作步驟,丹皮酚對照品 10mg,95乙醇溶解,定容至10ml,搖勻,精密吸取5ml,置,100ml量瓶,95乙醇定容,作為母液備用,母液中丹皮酚的含量為0.005%,1、吸收曲線的測繪,精密吸取母液1ml,置,10ml量瓶,95乙醇定容,以95乙醇為空白，進(jìn)行光譜掃描，得到吸收曲線圖。,2、吸收曲線的測繪,利用上述溶液，在274nm波長處測定其吸光度并計算百分吸收系數(shù)。,實驗三 分光光度法測定槐花中總黃酮的含量,一、實驗?zāi)康?1、掌握用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定槐花中總黃酮含量的方法 2、鞏固紫外可見分光光度計的操作方法 二、實驗原理 黃酮類化合物分子中的羰基、羥基等結(jié)構(gòu)可與金屬鹽類試劑如鋁鹽、鉛鹽等生成有色配合物，可用于定量分析。,三、儀器與試劑 UV1100型紫外可見分光光度儀 石英比色皿（一對） 5% NaNO2溶液 10% Al(NO3)3溶液 NaOH試液 蘆丁對照品 槐花藥材 其余試劑均為分析純；,四、實驗內(nèi)容及操作步驟,1、對照品溶液的制備,加甲醇，水浴使溶解,蘆丁對照品 50mg,置,25ml量瓶中,放冷，加甲醇至刻度，搖勻,精密吸取 10ml,置,100ml量瓶中,加水至刻度，搖勻,即得（每1ml中含無水蘆丁0.2mg）,2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,精密量取對照品溶液0、1、2、3、4、5ml,分別置,25ml量瓶中,各加H2O,加,5% NaNO2 1ml,搖勻,放置6min,10% Al(NO3)3 1ml,搖勻,放置6min,加,加,NaOH試液 10ml,加水至刻度,搖勻，放置15min,至5ml,=500nm,以相應(yīng)試劑為空白,測定吸光度（A）,以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光度,濃度（mg/ml）,3、供試品溶液的制備,槐花粗粉1g 精密稱定,置,索氏提取器中,加,乙醚,加熱回流至,提取液無色,放冷,棄乙醚液,加,甲醇90ml,加熱回流至,提取液無色,移至,100ml量瓶中,甲醇少量多次洗滌容器,洗液并入量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,精密吸取 10ml,置,100ml量瓶中,加水至刻度，搖勻,即得,4、樣品的測定,精密吸取供試品溶液3ml,置,25ml量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法,自“加水至5ml”起,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出供試品溶液中蘆丁的重量，即得,依法測定吸光度,槐花中含總黃酮以無水蘆?。–27H30O16）計， 不得少于8.0%。,五、注意事項 1、對照品和樣品應(yīng)同時顯色 2、顯色劑加入的順序、加入量和顯色時間要正確 六、思考題 1.分光光度法有哪些影響因素？ 2.試述標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點。,實驗四、薄層板的制備,一、實驗?zāi)康?掌握薄層板的制板方法。,二、儀器與試劑,天平（0.1g） 研缽 玻璃板 10 cm20cm CMC-Na水溶液 （3） 蒸餾水 薄層層析用硅膠GF254（青島海洋化工廠）,三、實驗內(nèi)容及操作步驟,1. 洗板 選取板面平整的玻璃板，洗凈后放置在干凈、平整的臺面上，陰干備用。,2勻漿 將吸附劑1份（3.0g）和水3份在研缽中向同一方向研磨混合均勻。,3鋪制 將已調(diào)制好的吸附劑勻漿倒至玻璃板的一端，用研棒將勻漿引到玻板的各個邊緣，輕輕震動，使吸附劑均勻鋪開成一薄層。置水平臺上陰干。,4活化 將陰干的薄層板至于110烘箱中活化30分鐘，置于有干燥器中備用。,四、思考題,1薄層板的鋪制過程中應(yīng)注意哪些問題？,實驗五 薄層色譜定性分析 （五味子的定性鑒別）,一、實驗?zāi)康?1. 掌握薄層色譜的定性分析方法。 2. 熟悉薄層板的點樣方法。,二、實驗原理,中藥五味子中，五味子甲素為其主要有效成分之一，為了更好的進(jìn)行定性鑒別，選用五味子甲素對照品和五味子對照藥材進(jìn)行對照，根據(jù)相同的組分在相同的條件下，應(yīng)該有相同的顏色和比移值來作為定性鑒別的依據(jù)。,五味子植株,五味子藥材,三、儀器與試劑,定量毛細(xì)管 已制備好的薄層板（硅膠GF254 ） 展開缸 所用試劑均為分析純 五味子粉末,定量毛細(xì)管,雙槽展開缸,對 照 品,四、實驗內(nèi)容及操作步驟,1.供試品液的制備：取五味子粉末1g，加三氯甲烷20ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1ml使溶解，作為供試品液。 2.對照藥材溶液的制備：取五味子對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。 3.對照品溶液的制備：取五味子甲素對照品，加三氯甲烷制成每ml含1mg的對照品溶液。,4. 吸取上述三種溶液各2l，點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（3060）甲酸乙酯甲酸（1551）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。,五、思考題,1如何克服薄層展開過程中的邊緣效應(yīng)？引起邊緣效應(yīng)的因素有哪些？,實驗六、高效液相色譜儀的使用,一、實驗?zāi)康?掌握高效液相色譜儀的使用方法 了解高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu),高效液相流程圖,1 溶劑貯器,2 泵,3 流量與速度檢測裝置, 4 進(jìn)樣閥,5 預(yù)柱(保護(hù)柱),6 分離柱(色譜柱), 7 檢測器,8 數(shù)據(jù)記錄及處理系統(tǒng),9 廢液瓶,二、儀器與試劑,L-2000液相色譜儀（L-2400紫外檢測器） C18反相鍵合色譜柱（250 mm4.6 mm） 微量進(jìn)樣器（25l） 過濾器（0.45m）及脫氣裝置 苯、甲苯、萘 甲醇（色譜純） 重蒸餾水,三、實驗內(nèi)容與步驟,（一）流動相的預(yù)處理 1過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。 2對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。 （二）安裝色譜柱 按色譜柱標(biāo)示意流液方向安裝好色譜柱。 （三）液相色譜儀的使用方法 1.啟動液相色譜儀,2.排除管道內(nèi)空氣 3.泵流速的設(shè)定 4.檢測器波長的設(shè)定 5.打開T2000P色譜工作站 6.色譜柱預(yù)平衡 7進(jìn)樣,8.數(shù)據(jù)采集完畢后，點擊停止進(jìn)樣 9.點擊“再處理”和“報告”圖標(biāo)對圖譜進(jìn)行再處理，出報告圖 10.實驗完畢后沖洗色譜柱 11.關(guān)閉工作站，關(guān)閉輸液泵電源，關(guān)閉檢測器電源、關(guān)閉儀器電源,練習(xí)液相色譜儀使用的色譜條件、樣品溶液和進(jìn)樣量 色譜條件 流動相為甲醇水（8020）； 固定相:C18反相鍵合色譜柱； 檢測波長為254nm； 流速：1ml/min。 樣品溶液 含苯、甲苯、萘濃度分別為1g/ml的甲醇溶液。 進(jìn)樣量 ：10l。,四、思考題,流動相在洗脫前為何要進(jìn)行脫氣？,一、實驗?zāi)康?1.掌握利用高效液相色譜法進(jìn)行定性 及定量分析。 2.鞏固高效液相色譜儀的使用方法。,實驗七、高效液相色譜定性及定量分析中藥赤芍中芍藥苷的定性鑒別和含量測定,二、實驗原理,1.采用與已知化合物對照,對組分進(jìn)行定 性分析。 2.采用外標(biāo)一點法進(jìn)行含量測定。,三、儀器與試劑 L-2000液相色譜儀（L-2400紫外檢測器） C18反相鍵合色譜柱（250 mm4.6 mm） 微量進(jìn)樣器（25l） 芍藥苷對照品；赤芍藥材 其余試劑均為分析純,四、實驗內(nèi)容及操作步驟 色譜條件 C18反相鍵合色譜柱； 流動相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（4065）； 檢測波長為230nm。 對照品溶液的制備 精密稱取五氧化二磷干燥36小時的芍藥苷對照品適量，加甲醇配制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。,供試品溶液的制備 取本品粗粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，浸泡4小時，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。 測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.8%。,五、思考題,1外標(biāo)一點法的主要誤差來源是什么？ 2紫外檢測器的優(yōu)缺點是什么？,實驗八、氣相色譜儀的使用,一、實驗?zāi)康?1. 掌握氣相色譜儀的使用方法 2. 了解氣相色譜儀的結(jié)構(gòu),二、實驗原理,氣相色譜法是采用氣體作流動相（載氣）流經(jīng)色譜柱進(jìn)行分離分析的方法。主要由