腺病毒載體構(gòu)建[11頁]

1、重組腺病毒的構(gòu)建,腺病毒 Adenovirus 最初由人類腺樣增殖體組織培養(yǎng)中分離得到的，此病毒名稱也由此而來。質(zhì)粒是直徑約70毫微米的正二十面體，各頂點(diǎn)具有突起。結(jié)構(gòu)亞基總數(shù)為252個。核酸是雙鏈DNA，分子量2025106。無包膜。在被感染的細(xì)胞核中增殖，病毒蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，再輸送到細(xì)胞核。 腺病毒可見于人、雞、牛、狗、鼠、豬和猴中，并各自具有嚴(yán)格的寄主特異性，不感染他種動物。對人類可引起感冒癥狀、呼吸系統(tǒng)不適等。,腺病毒,腺病毒 是一種大分子線性雙鏈無包膜DNA病毒。它通過 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中.,I

2、TR E1a/E1b E2 E3 E4 ITR,腺病毒的基因及其功能,腺病毒基因組編碼數(shù)十個腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，分為早期表達(dá)和晚期表達(dá)。 早期表達(dá)的蛋白是功能蛋白，晚期表達(dá)的有功能蛋白也有結(jié)構(gòu)蛋白，并且早期的功能蛋白能夠調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。 早期表達(dá)的E1區(qū)蛋白（甚至包括E2區(qū)蛋白）是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必須的，但其對細(xì)胞毒性也是很強(qiáng)的。 E2蛋白涉及AdDNA復(fù)制 E3蛋白對抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng) E4蛋白調(diào)節(jié)有效的晚期基因轉(zhuǎn)錄,腺病毒分類,第一代腺病毒載體：一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體成為一代 載體。此類型載體在未純化時(shí)可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較 強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和

3、免疫反應(yīng)，純化后可安全使用， 體內(nèi)表達(dá)周期可達(dá)4周。（科研、臨床應(yīng)用最廣泛 ，一般常用Ad5型腺病毒） 第二代腺病毒載體：一般將E2A或E4基因缺失的腺病毒載體成為二代 載體。產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較弱，其安全性和載體容 量有所改進(jìn)，但病毒包裝難度和出毒滴度下降厲 害，應(yīng)用局限。 第三代腺病毒載體：缺失了全部的（無病毒載體等）或大部分腺病毒 基因，僅保留ITR和包裝信號序列。這一載體系 統(tǒng)需要一個腺病毒突變體作為輔助病毒。,腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ),重組系統(tǒng)由2種質(zhì)粒構(gòu)成：一、包含全部（或右側(cè)大部分）腺病毒基因組DNA的大質(zhì)粒，即骨架質(zhì)粒,二、小的穿梭質(zhì)粒，其帶有目的基因的表達(dá)盒以及表達(dá)盒兩側(cè)的與大質(zhì)粒上的目的基因擬插入部位同源序列（左右臂）,AdEas