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文檔簡介
1、分子生物學技術在醫(yī)學研究中的應用、(基因表達)、基因表達、基因表達是指基因組中的一個基因從細胞轉錄到mRNA并翻譯成蛋白質的過程?;虮磉_的變化預示著分子水平上細胞的變化。這往往是細胞形態(tài)功能改變之前的變化。影響基因表達的因素:1,遺傳因素個體差異,終身不變。2,環(huán)境因素激素,藥物,細胞因子,機械刺激,病原體感染,電刺激,細胞轉基因,基因表達研究手段,1,RT-PCR (RNA) 2,Northern blot (RNA根據(jù)PCR產(chǎn)品的數(shù)量判斷基因表達的強度。RT-PCR是半定量方法,實驗操作:1)RNA提?。喝蚬ぞ甙?。防止RNA分解,RNA提取成功與否是RT-PCR分析中最重要的階段。(2
2、)逆轉錄:RNA,緩沖液,dNTP,逆轉錄酶,引物(隨機引物,Oligo dT),3) PCR,特定引物,模板,Taq聚合酶。通過PCR將目標片段增加幾十-一百萬倍。在一定范圍及特定條件下,PCR的生成物量與模板量成正比。,模板量,4)一些注意事項:反應平臺內(nèi)部人參1,PCR效率差異,重復性2,內(nèi)部參數(shù)選擇3,共同放大4,放大片段長度5,mRNA豐富度,mRNA、100%、160%、a b c d、2.0 2.0、2.0 1.0、2.0 2.0、1.0 1.0、RT-PCR特性:優(yōu)點:靈敏度高、特異性高、操作方便。缺點:可信度低,沒有細胞位置。2,Northern blot,標記探針與膜固相R
3、NA雜交。根據(jù)雜交信號強弱判斷表達量,根據(jù)雜交信號位置判斷分子長度。雜交信號,實驗操作:1)RNA提取2)RNA電泳(分離不同長度的RNA)3)膜(固相RNA形成)4)探針標記(同位素/無同位素)5)預雜交,雜交可以確認未知基因的轉錄產(chǎn)物(mRNA)的長度。優(yōu)點:缺點:1,操作煩人2,同位素3,低靈敏度4,對RNA質量的高要求5,不能定位細胞,3,Western blot,標記抗體和膜固體蛋白質作用。根據(jù)信號強度判斷蛋白質表達強度。根據(jù)信號位置判斷蛋白質分子量。標準分子量蛋白質,特定反應帶,1)蛋白質提取2)蛋白質電泳(分離其他分子量蛋白質)3)轉移4)閉合5) 1段反應6)標記2段(HRP/
4、AP標記)作用7)著色,實驗操作:缺點:低靈敏度的一項準備難度高,購買價格高,容易發(fā)生交叉反應,無法確定細胞位置,4,免疫組織化,顯示抗體和組織細胞作用。根據(jù)信號強弱判斷表達強度,根據(jù)信號位置判斷表達細胞。eNOS表達,(對照),(實驗),實驗操作,1)組織切片(石蠟/凍結)2)閉合,內(nèi)源性過氧化物酶失活3)一元作用4)二項式(HRP標記)基因表達強度取決于混合信號強度?;蛐酒卣鳎簝?yōu)點:通過一次雜交,可以獲得大量的表達信息。透氣性好。缺點:成本高,需要特殊設備。人類基因組計劃表明,人類有3.4萬個基因,并已死亡多達10萬個基因?;虻耐瑫r空表達是細胞結構和功能的基礎。是組織、器官和系統(tǒng)發(fā)育分化
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