DNA的生物合成課件

DNA的生物合成(複製)DNABiosynthesis，Replication

CentralDogma描述遺傳資訊流動(dòng)的方向1958年F.crick逆轉(zhuǎn)錄酶1970年對(duì)中心法則進(jìn)行了補(bǔ)充

複製(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為範(fàn)本合成子鏈DNA的過(guò)程。複製親代DNA子代DNA第一節(jié)複製的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication

一、半保留複製的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義子鏈繼承母鏈遺傳資訊的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式密度梯度實(shí)驗(yàn)DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為範(fàn)本(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與範(fàn)本互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種複製方式稱為半保留複製。半保留複製的概念按半保留複製方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳資訊，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留複製的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。原核生物複製時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的複製叉，稱為雙向複製。二、雙向複製複製中的放射自顯影圖象A.環(huán)狀雙鏈DNA及複製起始點(diǎn)B.複製中的兩個(gè)複製叉C.複製接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多複製子的複製。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)複製子(replicon)。複製子是獨(dú)立完成複製的功能單位。真核生物5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’複製子3’三、複製的半不連續(xù)性3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)順著解鏈方向生成的子鏈，複製是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)檠}製的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)複製的鏈稱為隨從鏈。複製中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)複製而隨從鏈不連續(xù)複製，就是複製的半不連續(xù)性。

DNA複製的酶學(xué)TheEnzymologyofDNAReplication第二節(jié)參與DNA複製的物質(zhì)底物(substrate):

dNTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol範(fàn)本(template):

解開成單鏈的DNA母鏈(ssDNA）引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因數(shù)一、複製的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和範(fàn)本；新鏈的延長(zhǎng)只可沿5→3

方向進(jìn)行。二、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5′

AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，並將其水解。

核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-pol

Ⅲ功能：對(duì)複製中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)複製和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ（109kD）複製產(chǎn)生短片斷的DNA323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

功能是原核生物複製延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)複製產(chǎn)生長(zhǎng)片斷的DNA（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的複製。在複製過(guò)程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA複製中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

三、複製保真性的酶學(xué)依據(jù)複製按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳資訊能準(zhǔn)確傳代的基本原理。複製保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀

（二）複製的保真性和堿基選擇（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；並用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。（二）複製的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。?

嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處?kù)斗词綐?gòu)型。1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2.聚合酶在複製延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；3.複製出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA複製的保真性至少要依賴三種機(jī)制

四、複製中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起範(fàn)本作用。

（一）解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白

解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用於氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——複製起始時(shí)催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在複製中維持範(fàn)本處?kù)秵捂湢顟B(tài)並保護(hù)單鏈的完整108

局部解鏈（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)轶牫跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋鬆弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制

五、DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶在複製中起最後接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能（一）複製的起始需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.DNA解開成單鏈，提供範(fàn)本。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

E.coli複製起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重複序列

反向重複序列5

3

5

3

1.DNA解鏈1）複製起始點(diǎn)的識(shí)別2）解螺旋酶解開雙鏈4）SSB參與維持DNA的單鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定3）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(可能主要是II型酶的作用)，在將要打結(jié)或已打結(jié)處作切口。

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB3

5

3

5

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引發(fā)體的形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA複製起始區(qū)域的複合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引物酶複製是在一段RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，催化引物合成的是一種RNA聚合酶，它不同於催化轉(zhuǎn)錄過(guò)程的RNA聚合酶，因此稱為引物酶。

DDRP

——DNAdependentRNApolymerase由於DDDP不可以催化兩個(gè)單dNTP之間的反應(yīng)，DDRP可以催化兩個(gè)NTP起始合成小的RNA片斷引物酶合成的小的RNA片斷稱為“引物”，為DNA的合成提供3’－OH3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶

複製開始後由於DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行複製，在電子顯微鏡下均看到伸展成叉狀的複製現(xiàn)象，稱為複製叉。在DNA聚合酶III的作用下，新鏈第一個(gè)去氧核苷酸就加到引物的3’-OH末端上，形成磷酸二酯鍵。複製開始。（二）複製的延長(zhǎng)複製的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol

領(lǐng)頭鏈的合成：DDDP沿著範(fàn)本3’5’滑動(dòng)，第一個(gè)進(jìn)入配對(duì)的dNTP與RNA引物上的3’－OH形成3’,5’－磷酸二酯鍵，留下3’－OH繼續(xù)合成隨從鏈的合成——岡崎片段的形成

兩條鏈?zhǔn)窃谕粋€(gè)DNA-polⅢ的催化下進(jìn)行延長(zhǎng)的過(guò)程階段一階段二階段三階段四原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向複製的複製片段在複製的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriterE.coli8232ori

terSV40500（三）複製的終止5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接複製過(guò)程簡(jiǎn)圖哺乳動(dòng)物的細(xì)胞週期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

?

細(xì)胞能否分裂，決定於進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。?

蛋白激酶通過(guò)磷酸化啟動(dòng)或抑制各種複製因數(shù)而實(shí)施調(diào)控作用。?

真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多複製子複製。複製有時(shí)序性，即複製子以分組方式啟動(dòng)而不是同步起動(dòng)。?

複製的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负脱}製因數(shù)(replicationfactor,RF)。?

增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在複製起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。（一）複製的起始3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體（二）複製的延長(zhǎng)染色體DNA呈線狀，複製在末端停止。複製中岡崎片段的連接，複製子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最後複製的RNA引物，去除後留下空隙。（三）複製的終止5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?

由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?

末端DNA序列是多次重複的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…功能?

維持染色體的穩(wěn)定性?

維持DNA複製的完整性端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成端粒酶的催化延長(zhǎng)作用爬行模型DNA聚合酶複製子鏈進(jìn)一步加工

端粒維持著染色體的穩(wěn)定。端粒因細(xì)胞分裂而變短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)死亡。端粒破損會(huì)導(dǎo)致DNA變得脆弱、容易發(fā)生變異，可能導(dǎo)致一些與衰老有關(guān)的疾病，如動(dòng)脈硬化和某些癌癥。

逆轉(zhuǎn)錄和其他複製方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA範(fàn)本逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶有三種酶的活性：RNA或DNA作範(fàn)本的dNTP聚合酶活性和RNase活性

逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為範(fàn)本，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。

試管內(nèi)合成cDNAcDNA

complementaryDNARNA範(fàn)本逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA整合宿主DNARNA病毒在細(xì)胞內(nèi)複製成雙鏈的DNA，稱為前病毒，前病毒可以獨(dú)立繁殖在某些條件下，前病毒的基因組通過(guò)基因重組，參加到細(xì)胞基因組內(nèi)，並且隨著宿主的基因一起複製和表達(dá)——整合前病毒獨(dú)立繁殖或者整合，都可成為致病的原因反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的複製二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳資訊傳代與表達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

滾環(huán)複製(rollingcirclereplication)三、滾環(huán)複製和D環(huán)複製

是某些低等生物的複製形式，如X174和M13噬菌體等。3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)複製5'

5

3

3

5

dNTPDNA-pol

γ

D環(huán)複製(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的複製形式。

DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳資訊改變，均可稱為突變。在複製過(guò)程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水準(zhǔn)來(lái)看，突變就是DNA分子上堿基的改變。一、突變的意義（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)

二、引發(fā)突變的因素物理因素:紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV紫外線照射可引起核酸鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧啶形成二聚體TT（胸腺二聚體）。化學(xué)因素三、突變的分子改變類型錯(cuò)配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯(cuò)配鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

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·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DN