食品中氨基酸的測(cè)定

食品中氨基酸的測(cè)定食品中氨基酸的測(cè)定依據(jù)GB5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用氨基酸分析儀(茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀)測(cè)定食品中氨基酸的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中酸水解氨基酸的測(cè)定,包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸共16種氨基酸。1.原理食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)可見(jiàn)光分光光度檢測(cè)器測(cè)定氨基酸含量。2.儀器氨基酸分析儀：茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀。3.試劑（1）檸檬酸鈉緩沖溶液［c（Na+）=0.2mol/L］：稱取19.6g檸檬酸鈉加入500mL水溶解，加入16.5mL鹽酸，用水稀釋至1000mL，混勻，用6mol/L鹽酸溶液或500g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至2.2。（2）混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1μmol/mL）：分別準(zhǔn)確稱取單個(gè)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.00001g）于同一50mL燒杯中，用8.3mL6mol/L鹽酸溶液溶解，精確轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，混勻。（3）混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（100nmol/mL）：準(zhǔn)確吸取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0mL于10mL容量瓶中，加pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液定容至刻度，混勻，為標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)液。4.分析步驟（1）試樣準(zhǔn)備固體或半固體試樣使用組織粉碎機(jī)或研磨機(jī)粉碎，液體試樣用勻漿機(jī)打成勻漿密封冷凍保存，分析用時(shí)將其解凍后使用。（2）試樣稱量均勻性好的樣品，如奶粉等，準(zhǔn)確稱取一定量試樣（精確至0.0001g），使試樣中蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi)。對(duì)于蛋白質(zhì)含量未知的樣品，可先測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。將稱量好的樣品置于水解管中。很難獲得高均勻性的試樣，如鮮肉等，為減少誤差可適當(dāng)增大稱樣量，測(cè)定前再做稀釋。對(duì)于蛋白質(zhì)含量低的樣品，如蔬菜、水果、飲料和淀粉類食品等，固體或半固體試樣稱樣量不大于2g，液體試樣稱樣量不大于5g。（3）試樣水解根據(jù)試樣的蛋白質(zhì)含量，在水解管內(nèi)加10～15mL6mol/L鹽酸溶液。對(duì)于含水量高、蛋白質(zhì)含量低的試樣，如飲料、水果、蔬菜等，可先加入約相同體積的鹽酸混勻后，再用6mol/L鹽酸溶液補(bǔ)充至大約10mL。繼續(xù)向水解管內(nèi)加入苯酚3～4滴。將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5min，接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0Pa），然后充入氮?dú)?，重?fù)抽真空-充入氮?dú)?次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口或擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管放在110℃±1℃的電熱鼓風(fēng)恒溫箱或水解爐內(nèi)，水解22h后，取出，冷卻至室溫。打開(kāi)水解管，將水解液過(guò)濾至50mL容量瓶?jī)?nèi)，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一50mL容量瓶?jī)?nèi)，最后用水定容至刻度，振蕩混勻。準(zhǔn)確吸取1.0mL濾液移入到15mL或25mL試管內(nèi)，用試管濃縮儀或平行蒸發(fā)儀在40～50℃加熱環(huán)境下減壓干燥，干燥后殘留物用1～2mL水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。用1.0～2.0mLpH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液加入到干燥后試管內(nèi)溶解，振蕩混勻后，吸取溶液通過(guò)0.22μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至儀器進(jìn)樣瓶，為樣品測(cè)定液，供儀器測(cè)定用。5.測(cè)定（1）儀器條件：使用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液注入氨基酸自動(dòng)分析儀，參照J(rèn)JG1064—2011氨基酸分析儀檢定規(guī)程及儀器說(shuō)明書(shū)，適當(dāng)調(diào)整儀器操作程序及參數(shù)和洗脫用緩沖溶液試劑配比，確認(rèn)儀器操作條件。（2）色譜參考條件①色譜柱：磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂；②檢測(cè)波長(zhǎng)：570nm和440nm。（3）試樣的測(cè)定混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品測(cè)定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀，以外標(biāo)法通過(guò)峰面積計(jì)算樣品測(cè)定液中氨基酸的濃度。6.計(jì)算（1）混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各氨基酸濃度的計(jì)算混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各氨基酸的含量按下式計(jì)算：式中cj——混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中氨基酸j的濃度，μmol/mL；mj——稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品j的質(zhì)量，mg；Mj——氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品j的分子量；250——定容體積，mL；1000——換算系數(shù)。結(jié)果保留四位有效數(shù)字。（2）樣品中氨基酸含量的計(jì)算樣品測(cè)定液氨基酸的含量按下式計(jì)算 式中ci——樣品測(cè)定液氨基酸i的含量，nmol/mL；Ai——試樣測(cè)定液氨基酸i的峰面積；As——氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液氨基酸s的峰面積；cs——氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液氨基酸s的含量，nmol/mL。試樣中各氨基酸的含量按下式計(jì)算：式中Xi——試樣中氨基酸i的含量，g/100g；ci——試樣測(cè)定液中氨基酸i的含量，