醫(yī)學教程 流式細胞技術

流式細胞技術與流式細胞儀

flowcytometry

&FlowCytometer(FCM)

主要內容基本原理基本結構主要性能指標臨床應用流式細胞儀的發(fā)展簡史1934年Moldavan

使懸浮的血紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細胞儀的最初模型。1947年，Gucker首次采用鞘流原理對氣體中的微粒進行計數。1953年，Crosland-Taylor利用同一原理，成功的設計了一種鞘流系統(tǒng)，配合光電技術對紅細胞進行計數。1969年VanDilla

和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設計的層流流動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細胞儀，成為目前各種流式細胞測量儀的基礎。1972年，數位研究者在斯坦佛大學研制了一臺熒光激活細胞分選儀，它標志著流式細胞儀商品化時代的真正到來。1974年，BD公司正式投產，商品名FACS-1TM.目前的主流生產商，美國的BD公司、Coulter公司。一、流式細胞儀的基本原理（一）流式細胞儀的分析原理單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內細胞因子蛋白質含量激素結合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。（二）流式細胞儀的分選原理細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電分選基本原理二、流式細胞儀的基本結構流動室及液流驅動系統(tǒng)激發(fā)光源及光束成形系統(tǒng)光學系統(tǒng)信號檢測和存儲系統(tǒng)顯示分析系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)（一）流動室是FCM的核心部件，由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為的長方形孔，供單個細胞通過，檢測區(qū)在該孔的中心或下方。流動室內充滿了鞘流，其作用是將樣品流環(huán)包。鞘流原理細胞懸液流過檢測光束，約30%的細胞在流動中明顯偏離軸心，有向流速較慢的區(qū)域聚焦的趨勢。阻塞管路聚焦的細胞直接影響測量結果由于細胞偏離軸心造成其移動時間延長，降低檢測速度。激光束無法對準照射在細胞中心鞘流原理流動的液體可分為穩(wěn)流(層流)和湍流兩種狀態(tài)層流原理：液體流動狀態(tài)有一個分界點，即雷諾數其定義為：在一個直徑為的管子內，液體的流速為v，密度為，黏滯系數為，當時，液流處于層流狀態(tài)；當時，液流處于湍流狀態(tài)。流式細胞儀中要求標本處于層流狀態(tài)。常把流速限制在10m/s以下。鞘流原理由此發(fā)展的鞘流技術，實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，標本位于軸心穩(wěn)定流動，外面包被有鞘液。鞘流處于湍流狀態(tài)，圍繞標本噴嘴高速流動，這樣就使得標本流與鞘流形成穩(wěn)定的同軸流動狀態(tài)。由于標本噴嘴處于流動室的中心，就使得標本流在鞘流包被下，恒定處于同軸流動的中心位置，其精度可以穩(wěn)定在幾個微米之內。標本流的位置的穩(wěn)定可通過調整它與鞘液流速的比例來實現(xiàn)，一般比例在1:50到1：幾百之間。鞘流原理Bernoulli定律：當液體流經截面不同的管道時，有，S和v分別是兩個管道的截面積和液體的流速。鞘液流動方向LowerpressureTheBernoulliEffectVelocityGradient液流驅動系統(tǒng)（二）激光光源流式細胞儀的激發(fā)光源通常采用激光，通常用的激光包括氬離子激光（488nm）、He-Ne激光（633nm）和半導體激光（635nm)。由于細胞快速流動，通過光照區(qū)的時間只有1微秒左右，且細胞所攜帶熒光物質被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激光光的強度有關，因此細胞必須達到足夠的光照強度。(二)激光光源激光光源的寬度大于被測細胞，為零分辨率信號。狹縫掃描技術：（三）光學系統(tǒng)主要元件為濾光片，分長通濾光片、短通濾光片、帶通濾光片。長波通雙色性反射鏡：大于特定波長的光通過而將小于特定波長的光反射光學系統(tǒng)示意圖

細胞通過激光照射區(qū)時，受激光激發(fā)，產生代表細胞內不同物質、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產生散色光和熒光信號。（四）信號檢測系統(tǒng)（四）信號檢測系統(tǒng)散射光檢測

前向光散射（FSC,ForwardScatter

）側向光散射（SSC,SideScatter

）散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(如染色)，因此被稱為細胞的物理參數或稱固有參數。以上兩種信號都是來自激光的原光束，其波長與激光的波長相同。熒光檢測(Fluoresencedetector)（1）前向散射光：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的信號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。FALSSensorLaser前向散射光示意圖（2）側向散射光：激光束照射細胞時，光以90°角散射的信號，側向散射光對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。

FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光示意圖 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

（3）熒光檢測熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數放大器FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料（1）熒光信號的面積和寬度所謂熒光信號的面積是采用對熒光光通量進行積分測量，一般對DNA含量測量時，均采用面積(FL2－A)來計算。這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準確反映DNA的含量。熒光信號的寬度(如FL2－W)常用來區(qū)分雙聯(lián)體細胞（2）熒光補償原理雙激光立體光路技術參數：FS,SS,FL數據顯示方式（單參數直方圖、雙參數散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數散點圖）設門分析技術（五）數據的顯示與分析FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少一、參數單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置二、數據顯示方式

Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。

設門分析技術

由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（一）單參數直方圖單參數直方圖細胞相對數量信道(channel)雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（二）雙參數直方圖1.雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度雙參數直方圖點圖2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數愈多。等高線越密集則表示細胞數變化率越大。二維等高圖3.假三維等高圖（三）三參數直方圖多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數分析（六）細胞分選器細胞分選器由水滴形成、分選邏輯電路、水滴充電和偏轉電路組成。1.小水滴的形成：液流從噴孔出來后，需要經過一段距離才形成水滴。這段距離大概是10~20個波長噴嘴的振動頻率即每秒鐘產生水滴的數目。2.邏輯電路：為了分選細胞，需要細胞在經過測量區(qū)時，F(xiàn)CM判斷出哪個細胞滿足分選條件，并產生一個邏輯信號；此信號驅動充電脈沖發(fā)生器，使之產生充電脈沖，當滿足分選條件的細胞形成水滴時，充電脈沖正好對它進行充電。3.水滴的充電與偏轉：當水滴從流束上將要斷開時，給含有這個水滴的流束充電，則水滴從流束上斷開后變帶有同極性的多余表面電荷。下落的液滴通過一個由平行板電極形成的靜電場，水滴在電場中發(fā)生偏轉，偏轉電壓一般為2000~6000v，對于高速分選偏轉電壓可達8000v。分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。分選的技術要求三、主要性能指標靈敏度：衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標，以能檢測到的單個微球上最少標有FITC或PE熒光分子的數目表示。目前FCM<100.分辨率：用變異系數來表示，一般FCM在最佳狀態(tài)時，CV值<2%.前向散射光檢測靈敏度：可檢測直徑為0.2~0.5um的生物顆粒。分析速度：3000~6000個/秒CV值約小，曲線分布約窄約集中，測量誤差就約一般的FCM在最佳狀態(tài)時CV值小于2％。FACSCalibur四、流式細胞儀應用的技術要求制備單細胞懸液是進行流式細胞分析的第一步熒光染料的選擇和標記細胞的方法是保證熒光信號產生的關鍵技術