分子生物學(xué)考試資料

第一題：1) Replicon復(fù)制子是DNA復(fù)制是從一個DNA復(fù)制起點開始，最終由這個起點起始的復(fù)制叉完成的片段。DNA中發(fā)生復(fù)制的獨立單位稱為復(fù)制子。2) leadingstrand前導(dǎo)鏈：與復(fù)制叉移動的方向一致，通過連續(xù)的5′-3′聚合合成的新的DNA鏈。3) transposableelement轉(zhuǎn)座因子：又叫可移動因子，它是指一段特定的DNA序列，可從原來的位置上單獨復(fù)制或自動脫落下來，經(jīng)環(huán)化后再插入到染色體其他位置，并對插入位置的附近基因產(chǎn)生各種遺傳學(xué)效應(yīng)。4) proteome蛋白質(zhì)組：蛋白質(zhì)組是指組織或細胞中所有的蛋白質(zhì)的集合。5) interruptedgene間隔基因或斷裂基因（splittinggene）即真核生物的結(jié)構(gòu)基因是由若干個外顯子和內(nèi)含子序列相間隔排列組成的間隔基因。6) trans-acting反式作用：DNA通過其產(chǎn)物(mRNA或蛋白質(zhì))間接調(diào)節(jié)基因的表達。Transcription轉(zhuǎn)錄，epigenetics表觀遺傳學(xué)，transcriptome轉(zhuǎn)錄組，metabolome代謝組,allele等位基因，cistron順反子，muton突變子，recon重組子，lactoseoperon乳糖操縱子，insertionsequence(IS)插入序列，RNApolymeraseRNA聚合酶,retro-transposon反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，genome基因組，semiconservativereplication半保留復(fù)制,semi-discontinuousreplication半不保留復(fù)制,translation翻譯,laggingstrand后隨鏈,replisome復(fù)制體,telomerase端粒酶,sensestrand正義鏈,isoacceptingtRNA同工tRNA,antisensestrand反義鏈,promoter啟動子,terminator終止子,intron內(nèi)含子，exon外顯子.1) genome基因組：基因組應(yīng)該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。2) proteome蛋白質(zhì)組，同上3) interruptedgene間斷基因：真核生物結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)被非編碼區(qū)所間隔（同上）4) intron內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。5) exon外顯子：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列6) transposon轉(zhuǎn)座子：直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的反式作用因子transcription轉(zhuǎn)錄,epigenetics表觀遺傳學(xué)，transcriptome轉(zhuǎn)錄組，metabolome代謝組,cistron順反子，mutant突變子，recon重組子，lactoseoperon乳糖操縱子，insertionsequence(IS)插入序列，pseudogene假基因，RNApolymeraseRNA聚合酶,cis-acting反式作用，replicon復(fù)制子，semiconservativereplication半保留復(fù)制,semi-discontinuousreplication半不保留復(fù)制,leadingstrand先導(dǎo)鏈,laggingstrand后隨鏈,replisome復(fù)制體,telomerase端粒酶,CvalueC值,sensestrand正義鏈,antisensestrand反義鏈,promoter啟動子,terminator終止子,transcriptionalunit轉(zhuǎn)錄單元第二題，談?wù)勗诖竽c桿菌中如何高效表達一個真核生物的基因？一個好的大腸桿菌系統(tǒng)應(yīng)該滿足：1.盡可能低的誘導(dǎo)表達；具有快速簡便的誘導(dǎo)方式；能夠高表達多種基因；易于進行克隆操作；能直接進行點突變和DNA序列分析而不要壓克隆。表達載體應(yīng)該能夠獨立復(fù)制，具有多個復(fù)制位點，便于進行篩選，具有很強的啟動子和終止子。同時必須將真核基因編碼區(qū)連接在大腸桿菌RNA聚合酶能夠識別的強啟動子控制之下。有核糖體結(jié)合位點，所產(chǎn)生的mRNA必須有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列。

將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核體系中；采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達載體的目的基因，這樣就解決了原核生物沒有RNA剪接功能的問題；構(gòu)建載體時，將真核基因插在幾個原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識別和降解，最后可以將多肽切除。第三題：簡述原核生物RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)以及每個亞基的功能。答：原核生物RNA聚合酶由五個亞基組成的分子量五聚體蛋白質(zhì)。五個亞基分別為兩條α鏈，一條β鏈、一條β'鏈和一條σ因子鏈。其中前四個亞基組成核心酶，核心酶加上σ因子稱為全酶。α鏈：決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性β鏈：與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān)β'鏈：結(jié)合DNA模板σ因子：辨認起始位點第四題，結(jié)合你的課題談?wù)勀銓碚n題研究中會用到哪些分子生物學(xué)技術(shù)手段，并談?wù)劽糠N技術(shù)方法的原理（至少談4種方法）答：在將來的研究中我可能會用到以下技術(shù)（大家自己選四種就好了）：PCR技術(shù)，根據(jù)DNA分子在高溫時會發(fā)生變性，兩條雙鏈分開；溫度下降后會發(fā)生退火，兩條雙鏈重新結(jié)合這個原理。首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補鏈。因為DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動（“引導(dǎo)”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點由寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點所決定。整個PCR反應(yīng)的全過程，即DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA相結(jié)合（退火）、DNA合成（鏈的延伸）三步，可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Westernblotting），原理：用電泳的方法來分離蛋白質(zhì)，是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,凝膠機械強度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點而受到廣泛的應(yīng)用。SDS是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。步驟：1、蛋白提??；2、等蛋白濃度的配制；3、SDS過程；4、轉(zhuǎn)膜；5、封閉與雜交；6、發(fā)光顯色克隆基因分離技術(shù)中：應(yīng)用核酸探針克隆目的基因。原理：把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進行菌落或噬菌斑雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆，這個過程叫作克隆基因的分離或篩選核酸凝膠電泳技術(shù)：自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。因為核酸帶負電性，所以把所加的樣品加到電源負極，使其順著正極移動。限制性核酸內(nèi)切酶技術(shù)：是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。因其能夠定位在外源DNA片段上，并在特定的DNA位點進行剪切。所以可以用來剪切我們所需要的目的基因片段。細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，細菌轉(zhuǎn)化是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。第五題，談?wù)勅绾慰寺∫还δ芤阎蛄形粗脑松锘蛘哒婧松锏幕?答：選擇含有目的基因的組織或細胞，分離其mRNA，以分離的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,然后利用cDNA第一鏈末端（3’端）的發(fā)夾結(jié)構(gòu)為引物合成第二鏈cDNA并與第一鏈形成雙鏈cDNA,隨后將合成的cDNA重組到質(zhì)粒或噬菌體載體上，構(gòu)建cDNA文庫，對于λ噬菌體構(gòu)建的cDNA文庫，把體外包裝的噬菌體顆粒感染瓊脂平板上的菌苔；若用構(gòu)建的cDNA文庫則把轉(zhuǎn)化的細菌涂布在瓊脂平板上，對于得到的每個噬菌斑或菌落中都含有一個被克隆的cDNA片段，再用硝酸纖維素膜或尼龍膜進行拷貝或復(fù)制，即把每個噬菌斑或菌落中的一部分核酸精確的從主平板印染到濾膜上。然后再進行篩選，完成該基因的克隆。其中在篩選目的cDNA時由于該基因功能已知，所以應(yīng)該用功能結(jié)合法篩選。功能結(jié)合法篩選又分為噬菌體顯示法，酵母雙雜交法和酵母單雜交法。其中酵母雙雜交法的原理如下：將編碼某一蛋白X（誘餌bait）的DNA序列與DNA結(jié)合域（BD）的編碼序列連接使其表達融合蛋白（BD-X），然后將待檢基因（Y）的cDNA與DNA激活域（AD）的編碼序列連接，使其表達融合蛋白（AD-Y），將兩個融合基因所在載體共同轉(zhuǎn)化酵母細胞（含報告基因上游激活序列USA）。若X與Y不能相互作用，則不表達報告基因，若X與Y相互作用，則使BD與AD靠近形成有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，因此，可通過報告基因的表達與否，篩選可與誘導(dǎo)餌X結(jié)合的目的基因Y。當然cDNA法克隆僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因。第六題，一個真核生物的基因在大腸桿菌中不能得到高效表達，可能的原因有哪些？答：表達載體不夠優(yōu)化，稀有密碼子表達不夠高，真核生物外源基因的mRNA不夠穩(wěn)定，大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，蛋白水解酶的活性可能會增加，將表達產(chǎn)物降解，發(fā)酵條件不夠優(yōu)化，外源基因表達產(chǎn)物的總量取決于外源基因表達水平和菌體濃度。在保持單個細胞基因表達水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質(zhì)合成的總量。第七題，原核生物RNA聚合酶是如何找到啟動子的？真核生物RNA聚合酶與之相比有何異同？

答：大腸桿菌RNA聚合酶在σ亞基引導(dǎo)下識別并結(jié)合到啟動子上。單獨的核心酶也能與DNA結(jié)合，σ因子的存在對核心酶的構(gòu)象有較大影響，極大降低了RNA聚合酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)和停留時間。RNA聚合酶可通過擴散與DNA任意部位結(jié)合，這種結(jié)合是松散的，并且是可逆的。全酶不斷變化與DNA結(jié)合部位，直到遇上啟動子序列，隨即有疏松結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)槔喂探Y(jié)合，并且DNA雙鏈被局部解開。真核生物基因組遠大于原核生物，它們的RNA聚合酶也更為復(fù)雜。真核生物RNA聚合酶主要有三類：RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄45SrRNA前體，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所有的mRNA前體和大多數(shù)SnRNA。RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄所tRNA，5SrRNA等小分子轉(zhuǎn)錄物。真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程大體于細菌相似，所不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能識別和結(jié)合到啟動子上，而需要在啟動子上有轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶裝配成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能起始轉(zhuǎn)錄。第八題，如何設(shè)計實驗克隆原核生物的復(fù)制起點？答：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點,常用ori或o表示。細胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細胞中，每個DNA分子只有一個復(fù)制起始點，因而只有一個復(fù)制子。復(fù)制起點DNA區(qū)段的克隆方法：根據(jù)該原核生物的基因序列確定限制性內(nèi)切酶，再利用這種限制性內(nèi)切酶分別酶E.coliDNA和具有抗生素抗性基因的質(zhì)粒DNA（例如Ampr），選擇最小的E.coliDNA片段與DNA片段連接后，轉(zhuǎn)化缺乏Ampr基因的受菌體(Amps)，接種于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，根據(jù)只有同時具有具有oriC和Ampr的重組DNA的菌落才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能正常繁殖的原則，選擇能正常生長的單菌落，搖床過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定驗證克隆到E.coli復(fù)制起點區(qū)的DNA片段，通過測序進一步驗證克隆結(jié)果。第九題，一個基因如何產(chǎn)生多種不同類型的mRNA分子？

答：一個基因產(chǎn)生一種以上mRNA的方式主要有兩種。第一種是：一個原初轉(zhuǎn)錄物含有一個以上的多腺苷化位點，就能產(chǎn)生一種以上的具有不同3ˊ末端的mRNA。第二種是：如果一個原初轉(zhuǎn)錄物含有幾個外顯子，那么，會發(fā)生不同的剪接，就會產(chǎn)生多種mRNA。此外，RNA編輯可以通過某些核苷酸的修飾，插入或缺失，產(chǎn)生不同類型的mRNA。

第十題，談?wù)勅绾慰寺∫还δ芤阎蛄形粗恼婧松锏幕虼穑?、由功能推知基因編碼的氨基酸序列，進而得出密碼子序列，最后得到基因的脫氧核苷酸序列，然后進行人工合成，用PCR技術(shù)增殖即可。2、Phagedisplay的基本操作過程為:(1)提取某一病原體基因組DNA,用超聲波將DNA切割成500～1500的片段;(2)將片段末端用T4DNA聚合酶處理后,與載體DNA(p