蘇云金芽孢桿菌母藥 編制說(shuō)明

1《蘇云金桿菌母藥》修訂編制說(shuō)明意見(jiàn)、標(biāo)準(zhǔn)評(píng)審匯報(bào)等工作。草單位及有關(guān)單位的分工和大體工作進(jìn)度，2770/WG/GR（October2012）。經(jīng)比較，以上的WHO規(guī)格涉及的產(chǎn)品屬于B.T.i（蘇云金桿菌的以色列亞種，BacillusthurstrainAM65-52.并且一般適用于衛(wèi)生消殺領(lǐng)域中的蚊蟲(chóng)防治，故對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)3GB/T8170-2008數(shù)值修約規(guī)則與極限蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏昆蟲(chóng)尸體內(nèi)及植物葉片，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生劑總量的90%～95%。我國(guó)最早用于防治小菜蛾的Bt菌是庫(kù)斯塔克亞種，其主效cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1F、cry2A、cry1I、cry7Ba1c此類菌在芽孢形成時(shí)期產(chǎn)生一種或多種殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal藥被廣泛應(yīng)用。其中對(duì)昆蟲(chóng)的毒性大部分或者完全取決于伴胞晶體對(duì)昆蟲(chóng)的毒異受體結(jié)合而形成穿孔病灶。Bt晶體蛋白作為一種胃毒素發(fā)揮作用，其對(duì)多種昆蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活性，包括鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoplera)、雙翅目4指標(biāo)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了外觀、毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、毒力效價(jià)、水分、pH值，并規(guī)毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%pH值水分/%H.a.代表棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera（P.x.）和毒力效價(jià)（S.e.但應(yīng)以毒力效價(jià)（H.a.）作為仲裁法。夜蛾(Spodopteraexigua)。當(dāng)以毒素）；armigera)和(甜菜夜蛾，Spodopteraexigua)作為試驗(yàn)蟲(chóng)，可根據(jù)產(chǎn)品防治對(duì)5原國(guó)標(biāo)規(guī)定：“兩年內(nèi)產(chǎn)品毒力效價(jià)和毒素蛋白含量均不低于指標(biāo)的60%”。b）生產(chǎn)地址、生產(chǎn)設(shè)備或生產(chǎn)工藝有較大改變，可能影6參照NY/T4407-2023,毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜合報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果法和SDS法，方法均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于工業(yè)控制分析。四、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)五、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家七、標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)渡辦法等內(nèi)7十一、蘇云金桿菌母藥產(chǎn)品質(zhì)量測(cè)試數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)水平對(duì)9標(biāo)準(zhǔn)名稱外觀毒力效價(jià)，IU/mg毒素蛋白，%水分，%pH范圍m，%本標(biāo)準(zhǔn)灰白色至棕褐色粉末≥50000≤6.04.0~7.0/GB/T19567.1-2004灰白色至棕褐色粉末≥60000IU/mg（一等品）和≥50000IU/mg（合格品B.t.a、甜菜夜蛾）；≥等品）和≥40000IU/mg（合格品）棉鈴蟲(chóng)）≥8.0%（一等品）和≥7.0%（合格品））；7.0%（一等品）和≥6.0%（合格品B.t.k）≤6.05.5~7.0NY/T4407-2023灰白色至棕褐色粉末≥50000≤6.04.0~7.0/批號(hào)IU/mg毒素蛋pH范圍水分，%HH200917462311.304.345.30HH200928591411.834.285.06HH200937127412.374.364.51HH200947169611.784.374.84HH200957556811.594.364.85HH200968679512.004.254.74HH200978348511.814.265.02HH200988961311.944.304.77HH200998180611.004.225.00HH201008065011.294.174.80批號(hào)IU/mg毒素蛋pH范圍水分，%20210111540007.25.54.420210118510007.15.74.120210119570007.45.53.120210120500007.15.73.120210126530007.25.64.620210127540007.35.74.320210318510007.35.64.720210320580007.55.73.920210403560007.25.64.720210404510007.15.84.1溫度條件2年降解率，%0~5℃20~25℃＜20%>30℃>30%編號(hào)（H.aIU/mgpH范圍水分，%18110012.174.245.3928090011.264.255.353544007.285.534.70蘇云金桿菌母藥分析方法研究蘇云金桿菌分析方法研究查詢相關(guān)文獻(xiàn)，參考了原行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)比了WHOspecification770/WG（October2012），經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、對(duì)比后提出。本方法適用于蘇云金桿菌毒方法來(lái)源適用菌種檢測(cè)方法方法摘要本標(biāo)準(zhǔn)蘇云金桿菌鲇澤亞和蘇云金桿菌庫(kù)斯塔克亞種（B.t.k）SDS-PAGE凝膠圖像處理法試樣處理：試樣用水溶解；加入終濃度為0.1mol/L的氫氧化鈉溶液；加入3×樣品稀釋液；沸水浴中煮6min；15000r/min離心5min，取上清液。SDS電泳：上樣量2~10μL；初期電壓100V；待試樣進(jìn)入分離膠后加大電壓到120V。凝膠成像系統(tǒng)：毒素蛋白目標(biāo)區(qū)帶:130kDa。毒力效價(jià)法H.a.為棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)的縮寫(xiě)，也可選擇P.x.和S.e.作為試驗(yàn)蟲(chóng)，試驗(yàn)結(jié)果分別表示為分別毒力效價(jià)（P.x.）和毒力效價(jià)（S.e.但應(yīng)以毒力效價(jià)（H.a.）作為仲裁法。P.x.和S.e.分別為小菜蛾(Plutellaxylostella)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的縮寫(xiě)。WHOspecification770/WG（October2012）蘇云金桿菌以色列亞種（B.t.i）SDS-PAGE凝膠圖像處理法試樣處理：試樣用1M/5mM，NaCl/EDTA溶液溶解；離心后棄上清溶液；用5mMEDTA溶液洗滌2次，離心棄上清液；加入0.1mol/L的氫氧化鈉溶液，取上清液；加入2×樣品稀釋液；沸水浴中煮5min；8000g離心5min，取上清液。SDS電泳：上樣量10~20μL；分離膠濃度10%；凝膠成像系統(tǒng)：毒素蛋白目標(biāo)區(qū)帶:135、70和28kDa。毒力效價(jià)法B.t.i使用埃及伊蚊（Aedesaegypti）作為試蟲(chóng)鈉，邊加入邊攪拌溶解，待充分溶解后，放置1mol/L、pH8.8三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲1mol/L、pH6.8三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲再加入3×樣品稀釋液0.325mL，于沸水浴中煮6min，冷卻至室溫，15000r/min制板:選擇兩塊大小一樣的玻璃板，其中一塊一端帶有2~3cm高的凹槽。制備分離膠:從冰箱中取出制膠試劑，平衡至室溫。按表2先配制分離膠。將膠液配好、混勻后，迅速注入兩塊玻璃板的間隙中，至膠液面離玻璃板凹槽勿擾亂膠面。垂直放置膠板于室溫約30min左右使之凝聚。此時(shí)，在凝膠和水///水標(biāo)準(zhǔn)曲線，取6μL的試樣溶液上層清液(毒素蛋白含量約為3μg)加入到上樣孔倒去染色液，先用漂洗液洗滌凝膠，然后加入脫色液，于37℃下加熱使其膠板經(jīng)脫色后，可清晰地看到130kDa蛋白區(qū)帶，用凝膠成像系統(tǒng)掃描該區(qū)）；）；毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩次平行測(cè)定結(jié)果之相對(duì)差應(yīng)不大于8%，取其算術(shù)平均于聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔中分別上樣2，41~5μg)，測(cè)定目標(biāo)蛋白區(qū)帶灰度值，以毒素蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)蛋白區(qū)帶12345質(zhì)量在1.25μg~6.25μg之間時(shí)，與相應(yīng)的蛋白區(qū)帶灰度值有良測(cè)定次數(shù)12345稱樣量,g0.046280.046740.047090.046810.04645毒素蛋白含量，%極差，%0.62平均值，%變異系數(shù)（RSD），%2.22霍維茨值RSDR（Hor），%2.74＞2.22如圖2所示，Marker為預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1~泳道5為不同濃度毒素蛋表5不同實(shí)驗(yàn)室蘇云金桿菌母藥試樣驗(yàn)證結(jié)果項(xiàng)目單位母藥