生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能及基本訓(xùn)練102

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能及基本訓(xùn)練YOURLOGO化學(xué)實(shí)驗(yàn)、公開課、教師說課、教學(xué)培訓(xùn)PPT模板第一部分生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)一、離心分離技術(shù)離心分離原理離心是指利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力、密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。按轉(zhuǎn)速不同可將離心機(jī)分為常速、高速和超速3類一、離心分離技術(shù)2.離心分離基本方法1.差速離心法2.速率區(qū)帶離心3.等密度梯度離心二、分光光度技術(shù)分光光度計(jì)的基本原理分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析的基本原理是根據(jù)朗伯一比爾（Lambert-Beer）定律，這個(gè)定律是討論有色溶液對(duì)單色光的吸收程度與溶液濃度及液層厚度間的定量關(guān)系，公式為E=kcL式中：E一一消光度（光密度OD，吸光度A);K-－消光系數(shù)，僅與入射光波長(zhǎng)有關(guān)；c一一溶液濃度；L一一液層厚度。二、分光光度技術(shù)2.分光光度檢測(cè)的基本方法(1）樣品溶液的配制：對(duì)紫外光、可見光或紅外光有選擇性吸收特性的物質(zhì)，只需選擇適當(dāng)?shù)娜軇┡渲瞥梢欢舛确秶臉悠啡芤杭纯蛇M(jìn)行分光光度檢測(cè)。二、分光光度技術(shù)2.分光光度檢測(cè)的基本方法(2）樣品檢測(cè)與定性、定量分析：根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的吸收光譜特性，選擇好入射光線的波長(zhǎng)，用蒸館水或空白液調(diào)節(jié)好零點(diǎn)，即可進(jìn)行樣品的檢測(cè)。欲確定待測(cè)物質(zhì)，有下列3種方法。1）將樣品溶液在一定條件下（pH、溫度、緩沖液等）的吸收光譜（吸光度－波長(zhǎng)曲線）與物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜（有關(guān)手冊(cè)可以查到）相對(duì)照，借以推斷樣品屬于什么物質(zhì)。二、分光光度技術(shù)2.分光光度檢測(cè)的基本方法(2）樣品檢測(cè)與定性、定量分析：根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的吸收光譜特性，選擇好入射光線的波長(zhǎng)，用蒸館水或空白液調(diào)節(jié)好零點(diǎn)，即可進(jìn)行樣品的檢測(cè)。欲確定待測(cè)物質(zhì)，有下列3種方法。2）根據(jù)吸收光譜中峰頂與峰谷吸光度比值與相當(dāng)條件下資料所載的比值相比較，推斷樣品是何物質(zhì)。例如：ATP:OD280/OD260=0.85OD250/OD260=0.90AMP:OD250/0D260=0.85OD280/0D260=0.22二、分光光度技術(shù)2.分光光度檢測(cè)的基本方法(3）用分光光度法測(cè)定注意事項(xiàng)1）分光光度計(jì)濾光性能。2）吸光度值應(yīng)控制在0.05~1.0。3）正確選用參比溶液，當(dāng)顯色劑及其他試劑均元色而被測(cè)溶液中又元其他離子時(shí)，可用蒸館水作參比溶液；如顯色劑本身具有顏色，則用顯色劑作對(duì)照。三、電泳技術(shù)各種生物大分子在一定pH條件下，可以成為帶電荷的顆粒，這種帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用在生化物質(zhì)的分析檢測(cè)中。1.電泳基本原理三、電泳技術(shù)各種生物大分子在一定pH條件下，可以成為帶電荷的顆粒，這種帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用在生化物質(zhì)的分析檢測(cè)中。2.常用的電泳技術(shù)(1）薄膜電泳：(2）薄層電泳:(3）凝膠電泳：四、層析分離技術(shù)層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）盡管各種層析的原理和操作有所不間，但其基本步驟是相同的，包括選擇適當(dāng)?shù)膶游霾牧?、上樣（點(diǎn)樣）、洗脫（展層）、檢測(cè)鑒定等4個(gè)環(huán)節(jié)。(1）柱層析法：四、層析分離技術(shù)盡管各種層析的原理和操作有所不間，但其基本步驟是相同的，包括選擇適當(dāng)?shù)膶游霾牧稀⑸蠘樱c(diǎn)樣）、洗脫（展層）、檢測(cè)鑒定等4個(gè)環(huán)節(jié)。(2)紙層析法：紙層析法又稱紙色譜法，是以紙為載體的色譜法。四、層析分離技術(shù)(2)紙層析法：紙層析法又稱紙色譜法，是以紙為載體的色譜法。1）原理紙層析法是依據(jù)極性相似相溶原理，以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，以有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相的分離方法2）操作方法。將試樣點(diǎn)在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑展開，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。四、層析分離技術(shù)(3）離子交換層析法：離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換來分離離子型化合物的一種方法?；驹恚弘x子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之為陰離子交換樹脂，帶有負(fù)電荷的稱之陽離子交換樹脂。四、層析分離技術(shù)(4)凝膠層析法：凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。1）凝膠層析法原理。四、層析分離技術(shù)(4)凝膠層析法：凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。2）凝膠層析的基本技術(shù)。凝膠的選擇與處理：凝膠的處理：其過程為吸水溶脹→除去微小顆?！鷾p壓排氣等。凝膠層析的基本過程：凝膠層析常采用柱層析，其操作方法與其他柱層析相似，包括裝柱、加樣、洗脫收集飛檢測(cè)等。層析柱如圖3所示。第二部分生物化學(xué)實(shí)訓(xùn)實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳實(shí)訓(xùn)一

血清蛋白醋酸薄膜電泳一、目的要求(1）了解醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白的原理。(2）掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作方法。二.原理電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)分子在溶液中的電泳是由于蛋白質(zhì)的分子具有一些可解離的基團(tuán)，因而在某種pH值溶液中蛋白質(zhì)分子就帶有一定電荷。實(shí)訓(xùn)一

血清蛋白醋酸薄膜電泳三、試劑和器材試劑(1)pH值8.6巴比妥緩沖液：巴比妥納12.76g，巴比妥1.66g，溶于蒸館水，定容至1000mL。(2）染色液：氨基黑10B5g溶于水400mL，甲醇500mL，冰醋酸100mL中。(3）漂洗液：959毛乙醇450mL，冰醋酸50mL，水500mLo(4）透明液：無水乙醇7份，冰醋酸3份。(5）洗脫液：0.4mol/LNaOH溶液。(6）動(dòng)物血清（制備時(shí)要無溶血現(xiàn)象）。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳三、試劑和器材2.器材醋酸纖維素薄膜（2cmX8cm）、常壓電泳儀和電泳槽、點(diǎn)樣器（蓋玻片）,培養(yǎng)皿（染色及漂洗用）、濾紙、剪刀、懾子（元齒）、玻璃板、白瓷反應(yīng)板、分光光度計(jì)、吹風(fēng)機(jī)、鉛筆。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳四、操作步驟準(zhǔn)備用懾子取醋酸纖維薄膜1張（識(shí)別出光澤面與無光澤面，并在無光澤面角上用鉛筆做上記號(hào)）放在緩沖液中浸泡20min。若放在緩沖液中后迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則表明薄膜質(zhì)地均勻；若潤濕時(shí)，薄膜出現(xiàn)深淺不一的條紋或斑點(diǎn)等，則為薄厚不勻的薄膜。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用質(zhì)地均勻的薄膜，因?yàn)槔w維素薄膜的質(zhì)量對(duì)電泳的結(jié)果影響很大。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳四、操作步驟2.點(diǎn)樣把膜條從緩沖液中取出夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在玻璃板上（元光澤面朝上），將點(diǎn)樣器先在白瓷板上的血清中蘸一下，再在膜條一端2~3cm處輕輕地水平落下并隨即提起這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血清樣品。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳四、操作步驟3.電泳在電泳槽內(nèi)加入緩沖液使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面等高將膜條元光澤面向下平懸于電泳槽支架的濾紙橋上（先剪裁尺寸合適的濾紙條，取雙層濾紙條附著在電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對(duì)齊，而另一端浸入電極槽的緩沖液內(nèi).膜條上點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極，蓋嚴(yán)電泳室，通電，調(diào)節(jié)電壓至160V，電流強(qiáng)度0.4~0.7mA/cm膜寬，電泳時(shí)間為40~60min，待電泳區(qū)帶展開3~5cm時(shí)關(guān)閉電源。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳四、操作步驟4.染色和漂洗電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡10min。將膜條從染色液中取出，置漂洗液中漂洗數(shù)次至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得色帶清晰的電泳圖譜。5.結(jié)果判斷一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、αl球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳五、結(jié)果方法一：將上述漂凈的薄膜用濾紙吸干剪下各種蛋白質(zhì)色帶分別浸于4.0mL洗脫液（37℃）中5~10min，色澤浸出后，比色（590nm）。設(shè)各部分的光密度分別為：OD清、ODα1飛ODα2、ODβ、ODγ。則光密度總和OD總為實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳五、結(jié)果方法二：把薄膜放在濾紙上用電吹風(fēng)吹干待薄膜完全干燥后，浸入透明液中5~10min，取出，平貼于干凈玻璃片上，自然干燥或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干，即得背景透明的電泳圖譜，可用刀片刮開并從玻板上取下圖譜?？捎霉饷芏扔?jì)測(cè)定各蛋白斑點(diǎn)。此圖譜可長(zhǎng)期保存。實(shí)訓(xùn)一血清蛋白醋酸薄膜電泳(1）血清樣品為何點(diǎn)在負(fù)極端？(2）總結(jié)醋酸纖維薄膜用作電泳支持物的特點(diǎn)。思考題:實(shí)訓(xùn)二雙縮服法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)訓(xùn)二

雙縮服法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、目的要求(1）掌握雙縮腮法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。(2）熟悉雙縮腺法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的實(shí)驗(yàn)操作。二、原理雙縮服（NH2CONHCONH2）在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱為雙縮服反應(yīng)；蛋白質(zhì)分子中含有許多膚鍵，在堿性溶液中也能與Cu2＋反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。因此，可以利用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)訓(xùn)二

雙縮服法測(cè)定蛋白質(zhì)含量三.試劑和器材1.試劑6mol/LNaOH溶液：稱取240g氫氧化納溶于1000mL水中。0.9%NaCl溶液：稱取9g氯化納溶于1000mL水中。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（10mg/mL）：稱取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理鹽水溶解后倒入10mL容量瓶中，淋洗稱量瓶數(shù)次，一并倒入容量瓶中，最后加生理鹽水至刻度線，或用凱氏定氮法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量，然后稀釋成10mg/mL作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。雙縮腺試劑：稱取CuS04·5H203.0g，酒石酸餌納9.0g和腆化餌5.0g，分別溶解后混勻，加6mol/LNaOH100mL，最后加水至1000mL，貯于棕色瓶中，避光，可長(zhǎng)期保存。待測(cè)血清：將人血清或動(dòng)物血清用生理鹽水稀釋10倍。2.器材試管、移液管（1mL,10mL）、水浴鍋、721型分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙、分析天平。實(shí)訓(xùn)二

雙縮服法測(cè)定蛋白質(zhì)含量四、操作步驟取試管7支，按下表操作。各管混勻，放置37℃水浴中保溫20min.540nm比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度值。實(shí)訓(xùn)二

雙縮服法測(cè)定蛋白質(zhì)含量六、思考題(1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的注意事項(xiàng)有哪些？(2）雙縮服法有何特點(diǎn)？實(shí)訓(xùn)三動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定實(shí)訓(xùn)三

動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定一、目的要求(1）掌握從動(dòng)物組織中提取核酸的實(shí)驗(yàn)原理。(2）熟練掌握從動(dòng)物中提取核酸的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、原理核酸是廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)的一類高分子物質(zhì)。在細(xì)胞核內(nèi)核酸通常與某些組織蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，即以脫氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，在提取過程中這兩種核蛋白會(huì)混在一起。實(shí)訓(xùn)三

動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定三、試劑和器材試劑(1)0.14moVLNaCl-0.01moVLEDTA溶液（pH7.0）：稱取NaCl8.18ι乙二膠四醋酸二納鹽3.27g，加蒸館水溶解，調(diào)pH至7，定容至1000mL。(2)250g/LSDS溶液：稱取十二燒基硫酸納25g，溶于50%乙醇中，定容至100mL。(3)2moVLNaCl溶液：稱取11.7gNaCl，用蒸餡水配成100mL溶液。(4)氯仿－異戊醇：氯仿24份與異戊醇1份混合。(5)95%乙醇。(6）動(dòng)物肝臟。2.器材紫外分光光度計(jì)、玻璃勻漿器、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、玻棒、量筒、吸管、三角瓶、燒杯等。實(shí)訓(xùn)三

動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定四、操作步驟提取DNA(1）選取雞或兔肝臟為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前饑餓1~2d，使肝糖原含量降低以免干擾試驗(yàn)。(2）將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放血處死，取其肝臟或腎臟（約2剖，浸于預(yù)冷至0℃的0.14moVLNaCl一0.01moVLEDTA中，除去脂肪、血塊等雜物，反復(fù)洗幾次，用濾紙吸干水分。(3）低溫下將組織剪碎，加入7mL0.14moVLNaCl-0.01moVLEDTA溶液混勻，在玻璃勻漿器中搗至大部分細(xì)胞破碎為止。(4)2500r/min離心15min，棄上層液體，向沉淀中再加入0.14moVLNaCl-0.01moVLEDTA液混勻再次離心洗滌。實(shí)訓(xùn)三動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定四、操作步驟提取DNA(5）經(jīng)洗滌后的沉淀，加入3mL0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA邊攪拌邊緩緩滴入250g/LSDS0.4mL，轉(zhuǎn)入勻漿器內(nèi)勻漿使沉淀懸浮均勻再加入2mol/LNaCl4mL，此時(shí)由于大分子DNP的溶出，溶液由教稠變稀薄。(6）轉(zhuǎn)入三角瓶，加入等容積的氯仿－異戊醇8mL劇烈振搖15min0將混合液于3000r/min離心10min。上層為水溶液，下層為氯仿，中間層為變性蛋白。吸出上層水溶液，加入等體積的氯仿－異戊醇，劇烈振搖15min再于3000r/min離；ù?lOmin,如此重復(fù)直至中間蛋白層消失。(7）取上層水溶液，加入2倍體積959毛乙醇，邊加邊用玻棒攪拌此時(shí)可不斷見到有結(jié)稠狀物質(zhì)（DNA）逐漸纏于玻棒上，盡量將水分在玻璃壁上擠干，然后溶于1mL2mol/LNaCl溶液中，留作定量、電泳用。實(shí)訓(xùn)三動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定四、操作步驟2.測(cè)定DNA(1）吸取5μLDNA樣品，加水至1mL（稀釋200倍），混勻后用石英比色杯進(jìn)行吸光度值測(cè)定。(2）分光光度計(jì)先用1mL蒸館水校正零點(diǎn)，在260nm處讀出樣品吸光度值。如果A2曠A2&0比值大于1.8，說明存在RNA，可以考慮用RNA酶處理樣品；比值小于1.6，說明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)再次抽提，之后用乙醇沉淀純化DNA。五、結(jié)果把實(shí)驗(yàn)結(jié)果代入下面公式中：樣品中DNA的濃度＝A260x核酸稀釋倍數(shù)x50/1000實(shí)訓(xùn)三動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定五、結(jié)果把實(shí)驗(yàn)結(jié)果代入下面公式中：樣品中DNA的濃度＝A260x核酸稀釋倍數(shù)x50/1000實(shí)訓(xùn)三動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定六、注意事項(xiàng)(1）由于組織中廣泛存在DNA核酸酶，因此全部提取過程應(yīng)在低溫下（4℃以下）操作，并加入擰棱酸鹽、EDTA等核酸酶的抑制劑，以防止其降解。(2）由于核酸極不穩(wěn)定，在較劇烈的化學(xué)、物理因素和酶的作用下很容易被降解，因此在制備過程中應(yīng)盡量避免這些因素的影響。(3）由于DNA分子大而長(zhǎng)，為了獲得大的DNA分子而不被破壞在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量避免劇烈振蕩、用力過猛。不可用口徑小的滴管、吸頭吸取轉(zhuǎn)移DNA溶液。(4）酚有腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)小心，若沾在皮膚上應(yīng)立即用水或70%乙醇擦洗。實(shí)訓(xùn)三動(dòng)物組織核酸的提取與鑒定七、思考題?(1）如何防止大分子核酸在提取過程中被降解？?(2）氯仿一異戊醇的作用是什么？?(3）在提取DNA的過程中，應(yīng)該注意哪些問題？實(shí)訓(xùn)四牛乳中酪蛋白的制備實(shí)訓(xùn)四

牛乳中酪蛋白的制備一、目的要求掌握從牛乳中制備酶蛋白的原理和操作。二.原理酪蛋白是牛乳中主要的蛋白質(zhì)，它在牛乳中的含量約為35g/L。將牛乳pH調(diào)到4.6，酪蛋白即可從牛乳中分離出來。實(shí)訓(xùn)四

牛乳中酪蛋白的制備三、試劑和器材試劑pH4.6醋酸納緩沖液（0.2moνL):A液（0.2moVL醋酸納溶液）：稱NaAc?3H2054.44g于2000mL容量瓶?jī)?nèi)，定容至2000mL0B液（O.2moVL醋酸溶液）：稱純醋酸（含量大于99.8%)12.0g，定容至1000mL。取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4.6醋酸納緩沖液。(2)95%乙醇。(3)95%乙醋。(4）乙醇－乙醚混合液(1:1體積比）(5）牛乳.2.器材離心機(jī)、pH試紙、溫度計(jì)、布氏漏斗、抽濾瓶,電爐、燒杯飛量筒等。實(shí)訓(xùn)四

牛乳中酪蛋白的制備四、操作步驟1.酪蛋白的粗提(1）將100mL牛乳放到500mL燒杯中，加熱至40℃，邊攪拌邊慢慢加入100mL40℃左右的醋酸納緩沖液，直到pH達(dá)到4.6左右，用pH試紙或酸度計(jì)調(diào)試。(2）將上述懸浮液冷卻至室溫，放置5min,3000r/min離心15min，棄去上清液，即得酷蛋白粗制品。實(shí)訓(xùn)四牛乳中酪蛋白的制備2.酪蛋白的純化(1）用水洗滌沉淀3次，3000r/min離心10min，棄去上清液。(2）在沉淀中加入30mL95%乙醇，攪拌片刻，將懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液再倒入乙醇一乙醚混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗滌沉淀兩次，抽干?！?3）將布氏漏斗中的沉淀移出，在表面皿上攤開、風(fēng)干，即得自各蛋白純品。3.準(zhǔn)確稱重。實(shí)訓(xùn)四牛乳中酪蛋白的制備五、結(jié)果(1）準(zhǔn)確稱重后，計(jì)算出每100mL牛乳中制備出的酪蛋白含量（g)。(2）求出自酪蛋白收率，即收率（%）＝測(cè)得含量／理論含量x100%實(shí)訓(xùn)四牛乳中酪蛋白的制備六、思考題實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)五

唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)一.目的要求(1）了解酶的性質(zhì)，掌握不同因素對(duì)酶活性影響的原理。(2）掌握不同因素對(duì)酶活性影響的測(cè)定方法。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)三、試劑和器材1.試劑(1)1%淀粉溶液：取淀粉1g加蒸館水少許，攪拌成糊狀然后用煮沸的1%NaCl溶液稀釋至100mL0(2)0.1moVLpH值5~8磷酸鹽緩沖液：分別配制下列兩種溶液，再按下表混合后稀釋1倍即可。0.2moVLNaH2P04液：稱取NaH2P04·2H2031.2g，加水準(zhǔn)確定容至1000mL。0.2moVLNa2HP04·12H2O液：稱取0.2moVLNa2HP04·12H2071.64g，加水準(zhǔn)確定容至1000mL。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)三、試劑和器材1.試劑(3）腆溶液：腆化餌1g加少許水溶解后，再加腆0.5g，溶后加水至100mL，用時(shí)加10倍水稀釋。(4)0.1%淀粉溶液：將1%淀粉溶液稀釋至10倍。(5)1%NaCl溶液。(6)1%CuS04溶液。(7)1%Na2S04溶液。(8)1%震糖。(9）班氏試劑：拘橡酸納173g和碳酸納100g溶于約700mL水中，另將硫酸銅17.3g溶于100mL水中。可分別加熱助溶。冷卻后將兩液混合，再加水至1000mL混勻。2.器材水浴鍋、電爐、比色板＼吸管、試管、燒杯。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)四、操作步驟1.唾液淀粉酶的制備每人用自來水漱口3次，然后取20mL蒸館水含于口中，1min后吐入燒杯中，紗布過濾，取濾液10mL，稀釋至20mL為稀釋酶液。2.溫度對(duì)酶活性的影響取4支試管，編好號(hào)，加入淀粉酶，分別放入冰水浴、37℃水浴和沸水浴中，待管內(nèi)溫度與水浴溫度一致時(shí)，向4支試管同時(shí)迅速加入稀釋唾液，搖勻后及時(shí)放回原水浴中。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)四、操作步驟(1）在比色板各孔中置腆液1滴，每隔1~2min用滴管從第3管中取反應(yīng)液1滴，滴入比色板一孔中觀察腆液顏色變化每次取反應(yīng)液之前，都應(yīng)將滴管洗凈后才能取反應(yīng)液。待檢查到腆液顏色不變時(shí)取出第4管冷卻后，再取出第1管，兩管同時(shí)各加入腆液1滴，搖勻，觀察并記錄各管顏色。(2）取出第2管置于37~40℃水浴中，10min后加入2滴腆液，其顏色與第1管比較有何變化？根據(jù)觀察和記錄結(jié)果說明溫度對(duì)酶活性的影響。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)3.pH對(duì)酶活性的影響(1）比色板中加腆液備用，準(zhǔn)備好37℃水浴。(2）取小試管4支，編號(hào)，按下表加入試劑，混勻。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)(3)4號(hào)管加稀釋酶液10滴，放37℃水浴中，計(jì)時(shí)，每隔1min由第4號(hào)試管中取出1滴溶液做腆反應(yīng)，待腆反應(yīng)呈淺紅色或橙黃色時(shí)，取出試管，記錄保溫時(shí)間。(4)1~3號(hào)試管放入37℃水浴中，向1~3號(hào)管中加入稀釋唾液10滴，搖勻，按照4號(hào)管的保溫時(shí)間，取出各管，并立即加腆液2滴，混勻。觀察各管呈現(xiàn)的顏色，判斷在不同pH值下淀粉被水解的程度，分析pH對(duì)淀粉酶活性的影響，并確定其最適pH值。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)4.激活劑和抑制劑對(duì)酶活性的影響取4支試管，按下表編號(hào)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)5.酶的專一性取試管3支，編號(hào)，按下表操作：將各管放沸水浴中煮沸3~5min，觀察結(jié)果。實(shí)訓(xùn)五唾液淀粉酶的特性實(shí)驗(yàn)五、思考題(1)認(rèn)真填寫各項(xiàng)表格，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)實(shí)驗(yàn)中必須控制哪些條件？為什么？實(shí)訓(xùn)六琥珀酸脫氫酶作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制觀察實(shí)訓(xùn)六

琥珀酸脫氫酶作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制觀察一、目的要求(1）理解競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的原理。(2）理解丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制作用。二、原理本實(shí)驗(yàn)利用肝細(xì)胞中提取的玻王自酸脫氫酶，在無氧的情況下使琥珀酸脫氫，脫下的氫由藍(lán)色亞甲藍(lán)（甲烯藍(lán)）接受，將藍(lán)色的亞甲藍(lán)還原成無色的甲烯白。反應(yīng)如下：實(shí)訓(xùn)六

琥珀酸脫氫酶作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制觀察三、試劑和器材1.試劑(1)0.1moVL磷酸鹽緩沖液（pH7.4）：取0.1moVLNa2HP04溶液19mL和0.1moVLNaH2P04溶液81mL混合。(2)1.5%瓏王自酸納溶液：取琉王自酸納1.5g，用蒸館水溶解并定容到100mL。(3)1%丙二酸納溶液：取丙二酸納1g，用蒸館水溶解并定容到l00mL。(4)0.02%亞甲藍(lán)溶液。(5）生理鹽水。(6）液體石蠟。2.器材水浴鍋、勻漿器或研缽、剪刀、試管、滴管等。實(shí)訓(xùn)六琥珀酸脫氫酶作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制觀察四、操作步驟1.琥珀酸脫氫酶液的制備取新鮮動(dòng)物肌肉或肝臟5g左右，放入研缽，用剪刀將組織剪碎，按20%濃度加入在冰箱中保存的pH7.4的磷酸緩沖液l0mL充分研磨均勻，過濾備用。2.酶反應(yīng)及競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的觀察(1）取4支試管分別編號(hào)，按下表操作。實(shí)訓(xùn)六琥珀酸脫氫酶作用及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制觀察五、思考題(1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用有何不同？(2）加液體石蠟的目的是什么？實(shí)訓(xùn)七層析法分離測(cè)定氨基酸實(shí)訓(xùn)七

層析法分離測(cè)定氨基酸一、目的要求(1）掌握紙層析法分離氨基酸的原理和方法。(2）能夠利用紙層析法分析樣品氨基酸的成分。二原理層析法是利用混合物中各組分之間物理化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中（固定相和流動(dòng)相），從而達(dá)到分離。分配系數(shù)＝物質(zhì)在固定相中的濃度／物質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度實(shí)訓(xùn)七

層析法分離測(cè)定氨基酸三、試劑和器材1.試劑(1）擴(kuò)展劑：4份水飽和的正丁醇和1份乙酸的混合物。將20mL正丁醇和5mL冰乙酸放入分液漏斗中，與15mL水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴(kuò)展劑約5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養(yǎng)皿中備用。(2）氨基酸溶液：0.5%賴氨酸、脯氨酸、繳氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組分濃度均為0.5%），各5mL。(3）顯色貯備液：0.1%水合茍三百同的正了醇溶液。2.器材層析缸、毛細(xì)管、噴霧器、培養(yǎng)皿、小燒杯飛鉛筆、電吹風(fēng)機(jī)、針、白線飛手套、層析濾紙（新華一號(hào)）實(shí)訓(xùn)七

層析法分離測(cè)定氨基酸四、操作步驟(1）將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。(2）取層析濾紙（長(zhǎng)22cm、寬14cm）一張。在紙的一端距邊緣2~3cm處用鉛筆畫一條直線，在此直線上每間隔2cm做一記號(hào)，如圖4所示。實(shí)訓(xùn)七

層析法分離測(cè)定氨基酸四、操作步驟(3）點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各種氨基酸樣品分別點(diǎn)在這6個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次，每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過3mmo(4）擴(kuò)展：用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm）。待溶劑上升15~20cm時(shí)即取出濾紙，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。(5）顯色：用噴霧器均勻噴上0.1%茍三四同正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5min(100℃），或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。注意操作過程中避免用手接觸層析濾實(shí)訓(xùn)七

層析法分離測(cè)定氨基酸五、結(jié)果用鉛筆輕輕描出顯色斑點(diǎn)的形狀，并用一直尺測(cè)量每一顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，計(jì)算各色斑的Rf值，與標(biāo)準(zhǔn)氨基的Rf值對(duì)照，確定水解液中含有哪些氨基酸。實(shí)訓(xùn)七

層析法分離測(cè)定氨基酸六、思考題(1）為什么幾種氨基酸的Rr值不同？(2）為什么顯色過程中避免用于接觸濾紙？實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量實(shí)訓(xùn)八

福林一吳憲法測(cè)定血糖含量一、目的要求(1）掌握福林一吳憲法測(cè)定血液葡萄糖含量的原理和方法。(2）掌握分光光度計(jì)的原理和使用方法。二、原理動(dòng)物血液中的糖主要是葡萄糖。正常情況下，血糖濃度相對(duì)恒定。實(shí)訓(xùn)八

福林一吳憲法測(cè)定血糖含量三、試劑和器材1.試劑(1)10%鴿酸納溶液：取鴿酸納（Na2W04·2H20)10g，用蒸館水溶解并稀釋至100mL。(2)0.333mol/L硫酸溶液：取1份1mol/LH2S04溶液，加2份水。(3）堿性銅試劑：在400mL水中加入無水碳酸納40趴在300mL水中加入酒石酸7.5趴在200mL水中加入結(jié)晶硫酸銅4~5g。以上分別加熱溶解，冷卻后將酒石酸溶液傾入碳酸納溶液中，再將硫酸銅溶液傾人，并加水至1000mL?；靹颍A存于棕色瓶中。(4）磷鋁酸試劑：取奪目酸35g和鴿酸納10g，加入10%NaOH溶液400mL及蒸館水400mL，混合后煮沸20~40min，以除去鋁酸中存在的氨（直至元氨味為止），冷卻后加入濃磷酸（80%)250mL，混勻，貯存于棕色瓶中。(5)0.259毛苯甲酸溶液：稱取苯甲酸2.5g加入1000mL蒸館水中，煮沸使之溶解，冷卻后補(bǔ)加至1000mL，此試劑可長(zhǎng)期保存。實(shí)訓(xùn)八

福林一吳憲法測(cè)定血糖含量三、試劑和器材(6）葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg/mL）：將少量元水葡萄糖（A.R.或C.P）置于硫酸干燥器內(nèi)一夜后精確稱取此葡萄糖1.000g，以0.259毛苯甲酸溶液溶解并移入100mL容量瓶?jī)?nèi)再以0.259毛苯甲酸溶液稀釋至100mL，置冰箱中可長(zhǎng)期保存。(7）葡萄糖應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/mL）：準(zhǔn)確吸取葡萄糖貯存標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL,置100mL容量瓶?jī)?nèi)以0.25%苯甲酸溶液稀釋至100mL。(8）動(dòng)物血清。2.器材試管及試管架、奧氏吸管、吸管、錐形瓶、血糖管、電爐、分光光度計(jì)、漏斗、濾紙等。實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量四、操作步驟1.無蛋白血濾液的制備鴿酸鈾與硫酸混合生成鴿酸和硫酸納，血液中蛋白質(zhì)在pH小子等電點(diǎn)的溶液中可被鴿酸沉淀，將沉淀液過濾或離心，上層清液即為無色透明、pH約等于6的無蛋白濾液。(1）取20mL錐形瓶1只，加入蒸館水7mL0(2）用奧氏吸管吸取抗凝血lmL，擦去管壁外血液，將吸管插入錐形瓶底部，緩緩放出血液。放完血液后，將吸管提高吸取上清液再吹入，反復(fù)洗管3次。充分混勻，使紅細(xì)胞完全溶解。實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量四、操作步驟(3）加入0.333mol/L硫酸溶液1mL，邊加邊搖，充分混勻，此時(shí)血液由鮮紅色變成棕色，靜置5~10min，使其酸化完全。(4）加入10%鎢酸納1mL，邊加邊搖。(5）放置約5min后，直至振搖也不再發(fā)生泡沫，說明蛋白質(zhì)已經(jīng)完全變性沉淀。用定量濾紙過濾或離心（2500r/min,10min），即得完全澄清無色的無蛋白血濾液。實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量四、操作步驟2.取血糖管3支按下表操作。實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量五、結(jié)果將測(cè)得數(shù)值代入下列公式計(jì)算：實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量六、注意事項(xiàng)(1）正常畜禽在飼喂前采血，病畜禽要在補(bǔ)糖前采血，否則結(jié)果偏高。(2）采血后最好在2~4h測(cè)定完畢。若放置過久，由于紅細(xì)胞的酵解作用，會(huì)使結(jié)果偏低；如不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)制成無蛋白血濾液置于冰箱內(nèi)保存。(3）在本法的元蛋白血濾液中，除含有葡萄糖外，尚有微量的其他還原物質(zhì)，故測(cè)定結(jié)果比實(shí)際血糖含量高10%左右。(4）一定要等水沸后再放入血糖管加熱時(shí)間必須準(zhǔn)確否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(5）加入磷鋁酸試劑后顯色不穩(wěn)定應(yīng)立即進(jìn)行比色。(6）若酸性鋁酸鹽試劑出現(xiàn)藍(lán)色，表示試劑本身已被還原，不能再用，應(yīng)重新配制。(7）若堿性硫酸銅試劑出現(xiàn)紅黃沉淀，則不宜使用須重新配制。實(shí)訓(xùn)八福林一吳憲法測(cè)定血糖含量七、思考題(1）此法測(cè)定葡萄糖的原理是什么？(2）實(shí)驗(yàn)中，若測(cè)定管顏色明顯深于或淺于標(biāo)準(zhǔn)管顏色時(shí)應(yīng)如何處理？(3）實(shí)驗(yàn)中哪些操作會(huì)影響測(cè)定結(jié)果？實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法一、目的要求(1）了解索氏提取器的基本結(jié)構(gòu)及索氏抽提法的提取原理。(2）掌握用濾紙包減量法提取樣品中的粗脂肪并計(jì)算其含量的方法。二、原理脂肪是丙三醇（甘油）和脂肪酸結(jié)合成的脂類化合物，能溶于脂溶性有機(jī)溶劑中，其廣泛存在于許多植物的種子和果實(shí)中，測(cè)定脂肪的含量可以作為鑒別其品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)指標(biāo)。實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法三試劑和器材1.試劑無水乙醚或石油醚、濾紙、飼料或食品。2.器材索氏脂肪抽提器、恒溫水浴鍋、烘箱、電子分析天平。實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法四、操作步驟(1）用電子分析天平準(zhǔn)確稱取2.000g（精確至0.01mg）原料，用濾紙包好（保證樣品不散漏），在100~105℃烘箱中烘干脫水，放入干燥器中冷卻，達(dá)到恒重后稱重（前后兩次稱量差不超過2mg）。(2）將索氏脂肪抽提器安裝妥當(dāng)，并將烘干稱重的濾紙包放入抽提管（圖5）中，注入無水乙醚以濾紙包全部浸泡于乙醚中為準(zhǔn)。盛乙醚瓶應(yīng)提前注入無水乙醚60~100mL。實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法四、操作步驟(3）加熱水浴鍋使溫度達(dá)45~65℃，使乙醚回流，控制乙醚回流為6~8min/次，共回流50次（含油高的試樣約70次），或檢查抽提管流出的乙醚揮發(fā)后不留下油跡為抽提終點(diǎn)。樣品中所含脂肪可全部抽提出而積存于乙醚瓶中。(4）提取完畢后，移去上部的冷凝管，取出濾紙包，放在盤子中，通風(fēng)使乙醚揮發(fā)，然后再置100~105℃烘箱中，需1~2h，取出濾紙包，放入干燥器中冷卻，達(dá)到恒重時(shí)稱重（前后兩次稱量差不超過2mg）。實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法五、結(jié)果根據(jù)恒重前后濾紙包的質(zhì)量，按下式計(jì)算樣品中粗脂肪含量：實(shí)訓(xùn)九粗脂肪含量的測(cè)定一一索氏抽提法六、注意事項(xiàng)(1)抽提劑乙釀是易燃、易爆物質(zhì)，應(yīng)注意通風(fēng)并且不能有火源。(2）樣品濾紙包的高度不能超過虹吸管，否則上部脂肪因不能提凈而造成誤差。(3）試樣必須充分磨碎和烘干，否則溶劑不易浸透和不易抽出脂肪。(4）用濾紙包樣品時(shí)應(yīng)注意一定不能散漏，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。(5）樣品和自迷浸出物在烘箱中干燥時(shí)，時(shí)間不能過長(zhǎng)，以防止極不飽和的脂肪酸受熱氧化而增加質(zhì)量。(6）脂肪燒瓶在烘箱中干燥時(shí)，瓶口側(cè)放，以利于空氣流通，而且先不要關(guān)上烘箱門，于90℃以下鼓風(fēng)干燥10~20min，驅(qū)盡殘余溶劑后再將烘箱門關(guān)緊，升至所需溫度。(7）反復(fù)加熱可能會(huì)因脂類氧化而