第49講　基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)練習(xí)（新人教新高考）

第49講基因工程的基本工具和基本操作程序課標(biāo)內(nèi)容(1)闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。(2)闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。(3)DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)。(4)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)?？键c(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程概述基因工程的理論基礎(chǔ)2.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)①將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。(2)DNA連接酶①DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，而DNA聚合酶是把單個(gè)的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。(3)載體【情境推理·探究】1.實(shí)踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通“質(zhì)粒載體”的條件外，還應(yīng)具有的條件是______________________________________________________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。提示對(duì)靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率，不能增殖，對(duì)細(xì)胞無害。2.限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ只能識(shí)別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoRⅠ的切點(diǎn)，請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。提示3.軟米基因會(huì)導(dǎo)致水稻稻米合成直鏈淀粉含量降低呈現(xiàn)軟米特征，人們大多喜歡軟米的口感，為獲得高產(chǎn)軟米粳型水稻，軟米基因Weq\o\al(mq,x)與蠟質(zhì)基因Wx互為等位基因，序列長度相同均為557堿基對(duì)(bp)，但基因內(nèi)部出現(xiàn)了限制酶NlaⅢ識(shí)別位點(diǎn)，用限制酶NlaⅢ處理不同植株的DNA片段，獲得電泳圖如下，分析可知含有純合軟米基因的植株為哪幾個(gè)？(填植株編號(hào))軟米基因檢測(cè)結(jié)果提示1、4、5、9、10?！局攸c(diǎn)難點(diǎn)·透析】1.限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。2.標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因可用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞：考向圍繞基因工程的基本工具，考查科學(xué)思維1.(2023·江蘇鹽城調(diào)研)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長答案D解析切割目的基因時(shí)，用BamHⅠ切割會(huì)破壞目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體，會(huì)出現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，或目的基因和質(zhì)粒的反向連接，而用PstⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切，能確保目的基因和質(zhì)粒的正向連接，并且質(zhì)粒上保留新霉素抗性基因作為標(biāo)記基因，A、C正確；在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因，至少需保留其中的一個(gè)，B正確；用PstⅠ切割后，質(zhì)粒上氨芐青霉素抗性基因被破壞了，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，D錯(cuò)誤。2.(2021·全國乙卷，38)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。回答下列問題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是________。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能________；質(zhì)粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是___________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指_________________________________________________________________________________________________________。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制限制酶切割位點(diǎn)用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞(4)RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列解析(1)由題圖可以看出，EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分別形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coliDNA連接酶可用于連接黏性末端，T4DNA連接酶可用于連接黏性末端和平末端。(2)DNA連接酶催化DNA鏈的5′端與另一DNA鏈的3′端生成磷酸二酯鍵。(3)復(fù)制原點(diǎn)是在基因組上復(fù)制起始的一段序列，可以保證質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。質(zhì)粒上有限制酶切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)可被限制酶切開并使外源目的基因插入其中。若質(zhì)粒DNA分子上有某種抗生素抗性基因，則可以用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因①在PCR過程中實(shí)際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點(diǎn)，只能結(jié)合在母鏈的3′端，使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。③復(fù)性溫度過高，則引物難以與模板鏈結(jié)合，溫度過低則易使兩條母鏈配對(duì)結(jié)合，均無法獲得PCR產(chǎn)物。④真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心提醒啟動(dòng)子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區(qū)別

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞只有該步驟沒涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(1)農(nóng)桿菌特點(diǎn)①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。(3)導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。4.目的基因的檢測(cè)與鑒定【情境推理·探究】1.設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請(qǐng)分別說明理由。①第1組：__________________________________________________________；②第2組：__________________________________________________________。提示引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效；引物Ⅰ自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。2.如果將某種抗性基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，僅一條染色體含抗性基因，該基因的傳遞遵循孟德爾分離定律。判斷依據(jù)是__________________________________________________________________________________________________________。提示僅一條染色體含有抗性基因，另一條沒有其等位基因。3.利用大腸桿菌可生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面各種細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的胰島素，可用大腸桿菌嗎？提示不可用。大腸桿菌為原核生物，沒有真核生物所具有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等結(jié)構(gòu)，無法對(duì)核糖體合成的肽鏈進(jìn)行加工?？枷?PCR技術(shù)及其應(yīng)用1.(2021·湖北卷，16)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A.增加模板DNA的量B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度答案D解析PCR過程中，引物和模板不完全配對(duì)會(huì)形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會(huì)減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，A錯(cuò)誤；延長熱變性的時(shí)間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，B錯(cuò)誤；延長延伸的時(shí)間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，C錯(cuò)誤；在一定溫度范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，D正確。2.(2022·全國乙卷，38)新冠疫情出現(xiàn)后，病毒核酸檢測(cè)和疫苗接種在疫情防控中發(fā)揮了重要作用。回答下列問題：(1)新冠病毒是一種RNA病毒，檢測(cè)新冠病毒RNA(核酸檢測(cè))可以采取RT—PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA，這一過程需要的酶是________________________，再通過PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。(2)為了確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的____________________________________來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，其中溫度最低的一步是______________。(3)某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)(檢測(cè)體內(nèi)是否有新冠病毒抗體)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明________________________(答出1種情況即可)；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性，說明_________________________________________________________。(4)常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等。已知某種病毒的特異性蛋白S(具有抗原性)的編碼序列(目的基因)。為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術(shù)獲得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是______________________________________________________________________________________。答案(1)逆轉(zhuǎn)錄酶(或反轉(zhuǎn)錄酶)(2)特異性核苷酸序列復(fù)性(或退火)(3)曾感染新冠病毒，已康復(fù)已感染新冠病毒，是患者(4)獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→導(dǎo)入受體細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定解析(1)以病毒RNA為模板合成cDNA是逆轉(zhuǎn)錄過程，這一過程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶(或反轉(zhuǎn)錄酶)。獲得cDNA后可通過PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷被檢測(cè)者是否感染新冠病毒。(2)為確保PCR擴(kuò)增獲得的是特異性序列，從而確保新冠病毒核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)必須依據(jù)新冠病毒RNA中的特異性核苷酸序列來進(jìn)行。PCR過程每次循環(huán)分為3步，即變性(超過90℃)→復(fù)性(50℃左右)→延伸(72℃左右)，其中溫度最低的一步是復(fù)性(或退火)。(3)某人同時(shí)進(jìn)行了新冠病毒核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)，若核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性而抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明他體內(nèi)沒有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已經(jīng)康復(fù)；若核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽性，說明他體內(nèi)已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測(cè)與鑒定?？枷?結(jié)合基因工程的基本操作程序，考查科學(xué)探究能力3.(2022·廣東卷，22)“綠水逶迤去，青山相向開?！贝罅Πl(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)已成為全社會(huì)的共識(shí)。基于某些梭菌的特殊代謝能力，有研究者以某些工業(yè)廢氣(含CO2等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業(yè))為原料，通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，構(gòu)建一種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)?；卮鹣铝袉栴}：(1)研究者針對(duì)每個(gè)需要擴(kuò)增的酶基因(如圖)設(shè)計(jì)一對(duì)______，利用PCR技術(shù)，在優(yōu)化反應(yīng)條件后擴(kuò)增得到目標(biāo)酶基因。(2)研究者構(gòu)建了一種表達(dá)載體pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因組合表達(dá)庫，經(jīng)篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動(dòng)子、終止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________，終止子的作用是________________________________________________。(3)培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)重組梭菌大量表達(dá)上述酶蛋白時(shí)，出現(xiàn)了生長遲緩的現(xiàn)象，推測(cè)其原因可能是_________________________________________________，此外丙酮的積累會(huì)傷害細(xì)胞，需要進(jìn)一步優(yōu)化菌株和工藝才能擴(kuò)大應(yīng)用規(guī)模。(4)這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了______________，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于___________________________________________________________________，具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會(huì)效益。答案(1)引物(2)作為標(biāo)記基因，篩選含有基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞終止轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停下來(3)二氧化碳等氣體用于大量合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長(4)廢物的資源化不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業(yè)廢氣中的二氧化碳解析(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)酶基因，首先需要根據(jù)目標(biāo)酶基因兩端的堿基序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物與模板鏈結(jié)合后，耐高溫的DNA聚合酶才能從引物的3′端延伸子鏈。(2)抗生素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是將含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞篩選出來。終止子的作用是終止轉(zhuǎn)錄過程，使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停下來。(3)重組梭菌大量表達(dá)上述酶蛋白時(shí)，在這些酶蛋白的作用下，二氧化碳等氣體大量用于合成丙酮，而不是用于重組梭菌的生長，所以會(huì)導(dǎo)致重組梭菌生長遲緩。(4)根據(jù)題意可知，這種生產(chǎn)高附加值化工產(chǎn)品的新技術(shù)，以高污染企業(yè)排放的二氧化碳等一碳溫室氣體為原料，實(shí)現(xiàn)了廢物的資源化，體現(xiàn)了循環(huán)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。從“碳中和”的角度看，該技術(shù)生產(chǎn)丙酮的過程不僅不排放二氧化碳，而且還可以消耗工業(yè)廢氣中的二氧化碳，有利于減緩溫室效應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)較高的經(jīng)濟(jì)效益，所以具有廣泛的應(yīng)用前景和良好的社會(huì)效益。4.(2023·中原名校聯(lián)盟)某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請(qǐng)回答下列問題：(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞，采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。其中用到的質(zhì)粒是________；該質(zhì)粒含有一段特殊的DNA片段，稱為________。該方法中農(nóng)桿菌的作用是_______________________________________________________。(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質(zhì)粒相比，選用HindⅢ和SalⅠ兩種酶的好處是_________________________________________________________________________________________________________。(3)含有目的基因的農(nóng)桿菌可根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行篩選。若農(nóng)桿菌在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上都可以生長繁殖，農(nóng)桿菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。為什么？_________________________________。(4)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行如下操作，篩選出符合要求的農(nóng)桿菌。先把轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種到A培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個(gè)菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環(huán)素和氨芐青霉素)兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請(qǐng)?jiān)趫D中相應(yīng)的位置上圈出來。答案(1)Ti質(zhì)粒T-DNA感染煙草細(xì)胞，把目的基因插入到煙草細(xì)胞的染色體DNA上(2)防止目的基因自連和質(zhì)粒自連，以提高帶有目的基因的重組質(zhì)粒的合成效率；防止目的基因與質(zhì)粒反向連接(3)否含有目的基因的質(zhì)粒中抗四環(huán)素基因被破壞(4)跳出題海如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如下圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。(2)被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌。(3)篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)?？键c(diǎn)三DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.DNA的粗提取與鑒定(2)方法步驟①加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絲狀沉淀。②本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)。可選用雞血細(xì)胞作為材料。2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟(3)電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300__nm的紫外燈下被檢測(cè)出來。①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。②在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換，避免試劑的污染。③電泳時(shí)，DNA的相對(duì)分子量越大，遷移速率越慢；DNA的相對(duì)分子量越小，遷移速率越快?？枷?結(jié)合DNA的粗提取與鑒定，考查科學(xué)探究能力1.(2023·江蘇啟東中學(xué)檢測(cè))如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是()A.圖1中的溶液a是NaCl溶液B.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶C.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯D.圖2中試管1的作用是證明2(mol·L－1)的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色答案C解析圖1所示操作為析出DNA，溶液a是研磨液過濾靜置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A錯(cuò)誤；加入預(yù)冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精，B錯(cuò)誤；圖2所示操作中的錯(cuò)誤是試管中的液面高于水浴的液面，導(dǎo)致試管受熱不均勻，C正確；圖2中試管1的作用是作為對(duì)照，排除NaCl溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，D錯(cuò)誤?？枷?結(jié)合DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定，考查科學(xué)探究2.利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增，下列有關(guān)“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)敘述，錯(cuò)誤的是()A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理B.PCR利用了DNA的熱變性原理C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換答案C解析PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖液中穩(wěn)定性較差的成分，同樣保護(hù)酶的活性不被破壞，C錯(cuò)誤。3.(2023·河北衡水調(diào)研)下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是()A.電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程B.待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA在電泳中的遷移速率C.進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)D.PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定答案C解析DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳，即帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程，A正確，C錯(cuò)誤。重溫真題經(jīng)典再現(xiàn)1.(2021·重慶卷，26)為了研究PDCD4基因?qū)π∈笞訉m內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。(1)取小鼠子宮時(shí)，為避免細(xì)菌污染，手術(shù)器具應(yīng)進(jìn)行________處理；子宮取出剪碎后，用________處理一定時(shí)間，可獲得分散的子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞，再分離獲得基質(zhì)細(xì)胞用于培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)有________________(填寫兩種)；培養(yǎng)箱中CO2濃度為5%，其主要作用是___________________________________________________。(3)在含PDCD4基因的表達(dá)載體中，啟動(dòng)子的作用是___________________________________________________________________。為了證明PDCD4基因?qū)|(zhì)細(xì)胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表達(dá)載體和基質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，還應(yīng)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組，分別為________________________________________________________________________________________________________________________________________。經(jīng)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組中PDCD4表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，說明該基因?qū)|(zhì)細(xì)胞凋亡具有________(填“抑制”或“促進(jìn)”)作用。答案(1)滅菌(或消毒)胰蛋白酶或膠原蛋白酶(2)無機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生長因子、血清或血漿維持培養(yǎng)液的pH(3)RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA基質(zhì)細(xì)胞懸浮液和空載體與基質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)液促進(jìn)解析(1)手術(shù)器具應(yīng)滅菌或消毒處理；分散動(dòng)物組織細(xì)胞用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理。(2)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)有無機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生長因子、血清或血漿；培養(yǎng)箱中濃度為5%的CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。(3)啟動(dòng)子的作用是被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。要證明PDCD4基因?qū)|(zhì)細(xì)胞凋亡的作用，實(shí)驗(yàn)組是含有PDCD4基因的表達(dá)載體和基質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)液，為了能對(duì)比得出結(jié)果和排除載體本身與培養(yǎng)液的作用，對(duì)照組有兩組，一組為等量的只含基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液，另一組為等量的空載體(載體上無PDCD4基因)和基質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)液。若實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，說明PDCD4基因?qū)|(zhì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。2.(2022·湖北卷，24改編)“端穩(wěn)中國碗，裝滿中國糧”，為了育好中國種，科研人員在雜交育種與基因工程育種等領(lǐng)域開展了大量的研究。二倍體作物M的品系甲有抗蟲、高產(chǎn)等多種優(yōu)良性狀，但甜度不高。為了改良品系甲，增加其甜度，育種工作者做了如下實(shí)驗(yàn)：【實(shí)驗(yàn)一】遺傳特性及雜交育種的研究在種質(zhì)資源庫中選取乙、丙兩個(gè)高甜度的品系，用三個(gè)純合品系進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表。雜交組合F1表型F2表型甲×乙不甜1/4甜、3/4不甜甲×丙甜3/4甜，1/4不甜乙×丙甜13/16甜、3/16不甜【實(shí)驗(yàn)二】甜度相關(guān)基因的篩選通過對(duì)甲、乙、丙三個(gè)品系轉(zhuǎn)錄的mRNA分析，發(fā)現(xiàn)基因S與作物M的甜度相關(guān)?！緦?shí)驗(yàn)三】轉(zhuǎn)S基因新品系的培育提取品系乙的mRNA，通過基因重組技術(shù)，以Ti質(zhì)粒為表達(dá)載體，以品系甲的葉片外植體為受體，培育出轉(zhuǎn)S基因的新品系。根據(jù)研究組的實(shí)驗(yàn)研究，回答下列問題：(1)假設(shè)不甜植株的基因型為AAbb和Aabb，則乙、丙雜交的F2中表現(xiàn)為甜的植株基因型有________種。品系乙基因型為________。若用乙×丙中F2不甜的植株進(jìn)行自交，F(xiàn)3中甜∶不甜比例為________。(2)下圖中，能解釋(1)中雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代謝途徑有________。(3)如圖是S基因的cDNA和載體的限制性內(nèi)切核酸酶(限制性核酸內(nèi)切酶)酶譜。為了成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，確保目的基因插入載體中方向正確，最好選用________________酶切割S基因的cDNA和載體。(4)用農(nóng)桿菌侵染品系甲葉片外植體，其目的是______________________________________________________________________________________________。(5)除了題中所示的雜交育種和基因工程育種外，能獲得高甜度品系，同時(shí)保持甲的其他優(yōu)良性狀的育種方法還有________________(答出2點(diǎn)即可)。答案(1)①7②aabb③1∶5(2)①③(3)XbaⅠ、HindⅢ(4)通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞(5)單倍體育種、誘變育種解析(1)甲為純合不甜品系，基因型為AAbb，根據(jù)實(shí)驗(yàn)一結(jié)果可推得乙基因型為aabb，丙基因型為AABB，乙、丙雜交的F2基因型有3×3＝9種，由于不甜植株的基因型為AAbb和Aabb，F(xiàn)2中表現(xiàn)為甜的植株基因型有7種。若用乙×丙中F2不甜的植株進(jìn)行自交，F(xiàn)3中不甜比例＝1/3＋2/3×3/4＝5/6，F(xiàn)3中甜∶不甜比例為1∶5。(2)不甜植株的基因型為AAbb和Aabb，只有A導(dǎo)致不甜，當(dāng)A與B同時(shí)存在時(shí)，表現(xiàn)為甜，故選①③。(3)為了成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，不破壞載體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和目的基因，確保目的基因插入載體中方向正確，最好選用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和載體。(4)用農(nóng)桿菌侵染品系甲葉片外植體，可以通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。(5)除了題中所示的雜交育種和基因工程育種外，能獲得高甜度品系，同時(shí)保持甲的其他優(yōu)良性狀的育種方法還有單倍體育種、誘變育種。限時(shí)強(qiáng)化練(時(shí)間：30分鐘)【對(duì)點(diǎn)強(qiáng)化】考點(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具1.(2023·山東日照期中)四種限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示，下列敘述錯(cuò)誤的是()A.上圖中EcoRⅠ、PstⅠ兩種酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接B.圖中SmaⅠ、EcoRV兩種酶切割后的DNA片段，可以用T4DNA連接酶連接C.DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段連接的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵D.限制酶能識(shí)別特定的核苷酸序列，具有專一性，不同的限制酶切割不能產(chǎn)生相同的黏性末端答案D解析不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D錯(cuò)誤。2.(2023·北京海淀區(qū)模擬)科研人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗病毒蛋白基因C導(dǎo)入番木瓜，培育出轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜，Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖如圖所示。下列敘述正確的是()A.農(nóng)桿菌的TDNA與番木瓜基因發(fā)生重組B.構(gòu)建重組質(zhì)粒需要限制酶和DNA聚合酶C.含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌具有四環(huán)素抗性D.轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性答案A解析構(gòu)建重組質(zhì)粒需要限制酶和DNA連接酶，B錯(cuò)誤；抗病毒蛋白基因C的插入位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，插入抗病毒蛋白基因C后，重組Ti質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因被破壞，含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌不具有四環(huán)素抗性，C錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D錯(cuò)誤。考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序3.(2023·北京民族大學(xué)附中期末)下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是()A.⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異B.③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀D.②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與答案A解析⑤為轉(zhuǎn)基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就說明轉(zhuǎn)入的目的基因成功表達(dá)了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A正確；③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒上的TDNA整合到植物細(xì)胞的染色體上，B錯(cuò)誤；受體細(xì)胞的染色體上可能含抗蟲基因，但不代表該基因就一定成功表達(dá)，因此不能確定⑤是否表現(xiàn)出抗蟲性狀，C錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶參與，D錯(cuò)誤。4.(2023·山東濟(jì)寧聯(lián)考)圖甲、乙中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列關(guān)于培育轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的敘述錯(cuò)誤的是()A.若通過PCR獲取該目的基因，應(yīng)該選用引物甲和引物丙B.圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建表達(dá)載體，應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ剪切C.若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，需選用Ca2＋轉(zhuǎn)化法D.在受體細(xì)胞中，氨芐青霉素抗性基因和目的基因可同時(shí)表達(dá)答案D解析通過PCR獲取目的基因時(shí)，兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，并沿相反的方向合成子鏈，故選用引物甲和引物丙，A正確；由甲圖可知，選用BamHⅠ會(huì)破壞兩種抗性基因，結(jié)合乙圖可確定應(yīng)選擇BclⅠ和HindⅢ剪切，B正確；將目的基因?qū)氪竽c桿菌常采用Ca2＋轉(zhuǎn)化法，C正確；構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)目的基因插入氨芐青霉素抗性基因中，故氨芐青霉素抗性基因被破壞不能表達(dá)，D錯(cuò)誤?！揪C合提升】5.(2023·河南新鄉(xiāng)模擬)賴氨酸是人體(成人)8種必需氨基酸之一，玉米中的賴氨酸含量比較低，其原因如圖所示。通過基因工程中的定點(diǎn)誘變技術(shù)，將天冬氨酸激酶(AK)的第352位蘇氨酸誘變成異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的第104位天冬酰胺誘變成異亮氨酸，就可以使玉米葉片和種子中游離的賴氨酸分別提高5倍和2倍。回答下列問題：(1)從“提升玉米種子中的賴氨酸含量”這一功能出發(fā)，預(yù)期構(gòu)建出_____________________________________________________________________的結(jié)構(gòu)，再推測(cè)出DHDPS基因的序列，最終合成DHDPS基因，該技術(shù)屬于________工程。(2)利用________技術(shù)可在體外大量擴(kuò)增DHDPS基因，此過程需要________酶，該酶能在高溫條件下催化DNA子鏈的延伸。(3)將DHDPS基因?qū)胗衩准?xì)胞中需要借助________________的運(yùn)輸。為確保DHDPS基因能隨玉米細(xì)胞的核DNA同步復(fù)制，需要將DHDPS基因插入玉米細(xì)胞的________________________上。(4)借助________________技術(shù)，可將轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因植株。若要從個(gè)體水平上鑒定轉(zhuǎn)DHDPS基因的玉米育種工作是否成功，需要測(cè)定__________________________________________________________________。答案(1)二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)蛋白質(zhì)(2)PCR耐高溫的DNA聚合(3)基因表達(dá)載體染色體DNA(4)植物組織培養(yǎng)玉米種子中賴氨酸的含量解析(1)從“提升玉米種子中的賴氨酸含量”這一功能出發(fā)，預(yù)期構(gòu)建出二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的結(jié)構(gòu)，再推測(cè)出DHDPS基因的序列，最終合成DHDPS基因，該技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程。(2)通常采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，該過程中需要耐高溫的DNA聚合酶的催化。(3)將目的基因?qū)胗衩准?xì)胞中需要借助基因表達(dá)載體的運(yùn)輸。要想確保目的基因在玉米細(xì)胞中隨核DNA同步復(fù)制，必須將目的基因插入玉米細(xì)胞的染色體DNA上。(4)將轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因植株可利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)。若要從個(gè)體水平上鑒定轉(zhuǎn)DHDPS基因的玉米育種工作是否成功，需要測(cè)定玉米種子中賴氨酸的含量。6.(2023·黑龍江哈三中階段考)口服α-干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。如圖1為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程。請(qǐng)回答下列問題：圖1(1)步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。由于DNA復(fù)制時(shí)，子鏈只能由5′向3′方向延伸，因此可以從圖2A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取________作為引物。圖2(2)步驟②用到的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的功能是_________________________________。圖1過程涉及的生物工程包括植物基因工程和________，后者利用了細(xì)胞________的原理。(3)如果將干擾素基因?qū)氩溉閯?dòng)物的受精卵，早期胚胎培養(yǎng)至________階段，然后進(jìn)行胚胎移植，可從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中獲得干擾素，人們把這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稱為________。(4)干擾素體外保存相當(dāng)困難，如果將其分子上的一個(gè)半胱氨酸變成絲氨酸，就可在－70℃條件下保存半年，給廣大患者帶來福音。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，應(yīng)該直接對(duì)________進(jìn)行操作。原因是_____________________________________________________________