油菜籽攜帶黑脛病菌檢測技術規(guī)程

1油菜籽攜帶黑脛病菌檢測技術規(guī)程本文件規(guī)定了油菜籽攜帶黑脛病菌的檢測方法。本文件適用于油菜籽攜帶黑脛病菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件僅該日期對應的版本，適用于本文件不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。SN/T3685-2013油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1油菜黑脛病phomastemcankerofRapeseed由小球腔菌屬真菌Leptosphaeriamaculans或Leptosphaeriabiglobosa侵染引起的油菜病害，危害葉片和莖稈。L.Biglobosa致病性較弱，侵染油菜葉片和莖稈后，形成黑色病斑，病斑上散有零星的黑色分生孢子器。葉片上病斑的周圍可見有黃色暈圈。L.maculans致病性較強，侵染油菜葉片后，形成大的、黑褐色病斑，上面分布有較多的黑色的分生孢子器。后期在莖基部也能形成病斑，從而造成莖基部的腐爛。4主要儀器設備和試劑4.1主要儀器設備高壓滅菌鍋、超純水系統(tǒng)、制冰機、水浴鍋、電泳儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、超低溫冰箱、常規(guī)冰箱、離心機、渦旋振蕩器、移液器。4.2主要試劑本文件中所有試劑均為分析純或生化試劑，除另有規(guī)定外。4.2.1DNA提取試劑：QIAGEN’sminikit提取試劑盒，CTAB提取液（1.4mol/LNaCl，100mmol/LTris-HClpH8.0，20mmol/LEDTApH8.0，2%CTAB），氯仿，異戊醇，醋酸鈉，異丙醇，乙醇。4.2.2PCR檢測試劑：10×PCR緩沖液，Taq酶，dNTP，ddH2O。4.2.3凝膠電泳試劑：瓊脂糖，TAE，loadingbuffer，核酸染料。25樣品DNA提取隨機抽取0.5g油菜籽置于冷凍過的研缽中，液氮迅速研磨后將粉末分裝到1.5mL的離心管中，先用CTAB法提?。ㄒ姼戒汚），再用QIAGEN’splantminikit試劑盒提?。ㄒ姼戒汢）。6PCR擴增檢測特異性引物：LmacA:5，—CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA—3，LmacB:5，—ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA—3，LmacR：5，—GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG—3，LmacR為共用反向引物，強致病性病原菌L.maculans可獲得大小為334bp的特異性擴增產物，弱致病性病原菌L.biglobosa可獲得大小為440bp的特異性擴增產物。反應體系(20μL)：基因組DNA2μL，上下游引物（10μM）各1uL，10μLTaqmix(2x),MQ6μL。反應條件：94℃預變性2min,94℃變性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min;35個循環(huán)；72℃延伸5min.7瓊脂糖凝膠電泳在電泳緩沖液中加入1%瓊脂糖，加熱融化后冷卻至55℃左右加入5μL核酸染料搖勻，倒入膠板制備凝膠，凝固后上樣進行電泳。8結果判定在空白對照不出現(xiàn)任何條帶的前提下，如果測定病原菌，PCR獲得大小為334bp的條帶，鑒定為強致病性病原菌L.maculans，如果PCR獲得大小為440bp的條帶，鑒定為弱致病性病原菌L.biglobosa。3（資料性）CTAB提取法提取方法及步驟A.1隨機抽取0.5g油菜籽樣品置于冷凍過的研缽中，加入750μL預熱的2%CTABbuffer（1.4mol/LNaCl，100mmol/LTris-HClpH8.0，20mmol/LEDTApH8.0，2%CTAB）迅速磨成漿糊狀；隨后將所有樣品移入1.5mL離心管中，65℃,溫育1h，溫育期間每隔10min上下顛倒數(shù)次。A.2加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒混勻，室溫，12000rpm/min，離心10min，吸上清。A.3加上清液1/10體積的3MNaAc和等體積冰凍異丙醇，10000rpm離心2min，收集沉淀。A.475%乙醇浸泡沉淀2min，10000rpm離心2min，棄乙醇，重復一次。A.5室溫風干后，加200μLTE溶解DNA，保存?zhèn)溆谩?（資料性）QIAGEN’sminikit提取試劑盒提取方法及步驟B.1在CTAB提取法提取DNA的離心管中加400μLAP1Buffer，4μLRNaseA，充分渦旋，混勻。B.265℃水浴10min，水浴期間上下顛倒2-3次，以使充分裂解。B.3再加130μlAP2Buffer，混勻，冰浴5min。14000rpm離心5min。B.4吸上清于收集管內，14000rpm離心2min。B.5將上一步的濾液吸到一個新的離心管中，吸取過程中盡量避免殘體。B.6加1.5倍體積的AP3/EBuffer，并用移液槍吹吸使其混勻。B.7吸取上一步的混合液于2mL的濾管中，8000rpm離心1min，棄濾液。B.8將濾管置于新的離心管中，加500μLAWBuffer，8000rpm