阿米洛利對大鼠膀胱ICCs細胞內Ca2 波動的影響研究

1/1阿米洛利對大鼠膀胱ICCs細胞內Ca2波動的影響研究阿米洛利對大鼠膀胱ICCs細胞內Ca2+波動的影響研究1湖北省十堰市人民醫(yī)院湖北省十堰市4420002昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院云南昆明650032本研究受云南省應用基礎研究資助，項目編號：

2014FB042作者簡介：

王天寶（1985-），男，碩士，十堰市人民醫(yī)院。

通訊作者：

劉孝東，碩士生導師，副教授，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院。

【摘要】目的：

探討鹽酸阿米洛利對膀胱cajal樣間質細胞（interstitialcellsofCajal，ICCs）細胞內Ca2+波動的影響。

方法：

體外分離并培養(yǎng)SD大鼠膀胱ICCs細胞，膀胱ICCs細胞爬片成功后，將待實驗細胞爬片分為：

50mu;mol/L和100mu;mol/L的阿米洛利溶液孵育組、空白對照組采取PBS溶液孵育。

在顯微鏡下隨機選取20個與周圍細胞無接觸、孤立存在的膀胱ICCs細胞，采用Fluo-3-AM孵育后在激光掃描共聚焦顯微鏡下檢測各組膀胱ICCs細胞內Ca2+波動情況。

結果:50mu;mol/L阿米洛利處理組，膀胱ICCs細胞內Ca2＋波動較孵育前有所頻率減慢但經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但Ca2＋波動振幅明顯較前變小，有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；100mu;mol/L阿米洛利處理組的膀胱ICCs細胞內Ca2＋波動頻率和振幅下調顯著(Plt;0.01)，而對照組前后變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

結論：

阿米洛利可以降低膀胱ICCs細胞內Ca2＋波動頻率和振幅。

【關鍵詞】膀胱；間質細胞；阿米洛利；鈣離子波動【中圖分類號】R473【文獻標識碼】A【文章編號】1001-5213(2016)08-0414-02膀胱是一種介于自主神經(jīng)和非自主神經(jīng)支配的一種特殊的空腔臟器[1]。

傳統(tǒng)觀點認為：

膀胱收縮存在神經(jīng)源性和肌源性兩種學說[2]。

雖然從膀胱正常收縮完全受意識控，神經(jīng)源性控制說看其合理性是毋庸置疑的。

但在一些特定情況下，諸如膀胱過度活動綜合癥(OveractiveBladder，OAB)，患者的膀胱黏膜無明顯病理變化（或者說目前有我們未知的病理改變）而出現(xiàn)非充盈性膀胱異常活動，提示膀胱有可能還受其它機制調控。

這種情況下，膀胱的收縮更多的表現(xiàn)為肌源性特征，呈現(xiàn)出一定程度的非神經(jīng)源性的自主性。

以往的觀點認為這種自發(fā)性興奮起搏來源于逼尿肌細胞，但更多實驗數(shù)據(jù)表明：

逼尿肌細胞沒有自發(fā)性興奮的特點，無法擔當膀胱起搏的任務[3]。

綜合OAB的病因來看，多種因素參與致病。

Kubota[4]等人研究發(fā)現(xiàn)：

膀胱出口梗阻情況下，OAB膀胱中ICCs樣細胞顯著增多，提示OAB的發(fā)生可能和ICCs細胞增多；McCloskey[5]和Hashitani[6]等研究發(fā)現(xiàn)逼尿肌的自發(fā)性電活動源于逼尿肌束邊緣的ICCs樣細胞，這些細胞首先產(chǎn)生自發(fā)性電活動，隨后刺激逼尿肌細胞產(chǎn)生動作電位，并通過肌間的縫隙連接傳導，引起其他肌束的電位變化的收縮活動。

分布在膀胱逼尿肌肌束間的膀胱ICCs細胞，可通過胞體間的縫隙連接及ICCs細胞的突起相互形成網(wǎng)狀結構聯(lián)系,并伸出突起到肌束內與平滑肌或神經(jīng)組織相聯(lián)系，縫隙連接是在相鄰細胞間的縫隙中構成一個通道，細胞胞質中的離子和小分子物質可以通過這一通道相互溝通，進行細胞間通訊,使興奮信號得到迅速傳播[7]。

原代培養(yǎng)的ICCs細胞和逼尿肌細胞的靜息膜電位、膜電容存在明顯差異；ICCs細胞可記錄到起搏細胞特征電流Ih,而在逼尿肌細胞則記錄不到[8]，同時膀胱ICCs細胞表面存在多種受體蛋白，最近有關超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolatization-activated，cyclicnucleotide-gatedcationchannel，HCN陽離子通道，簡稱HCN通道)在ICCs細胞膜上的發(fā)現(xiàn)為其是膀胱活動的潛在起搏點提供一重要依據(jù)[9]。

由此可見ICCs對在膀胱逼尿肌異常收縮的病理過程中可能發(fā)揮重要作用。

同時我們設想的一個問題是：

有沒有一種藥能夠通過透過膀胱粘膜影響膀胱ICCs細胞從而抑制逼尿肌異常收縮？本實驗將在細胞水平進行實驗探討酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利（Ami）對膀胱ICCs細胞內Ca2+濃度的影響，從而為通過阿米洛利影響膀胱ICCs為中間環(huán)節(jié)，間接影響膀胱逼尿肌收縮，為治療膀胱異常收縮的相關疾病提供相關的基礎研究。

材料和方法1、材料實驗動物：

健康成年SD大鼠，雌雄不限，體質量200～250g。

主要試劑：

DMEM培養(yǎng)液、Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國）、胎牛血清（FBS，Hycone公司）、Ficoll400細胞分離液（Pharmacia，美國）、青鏈雙抗（哈爾濱哈藥集團，哈爾濱）、Alexa488標記的兔抗羊熒光二抗、羊抗大鼠c-kit多克隆抗體（SantaCruz公司）、Fluo－3－AM（invitrogen公司）、鹽酸阿米洛利（Sigma，美國）、胰蛋白酶抑制劑（Sigma，美國）、L-多聚賴氨酸（Sigma，美國）、干細胞生長因子（SCF，Ramp;D公司）2、實驗方法2.1體外膀胱ICCs的分離與培養(yǎng)2.1.1酶解液的配制：

Ⅱ型膠原酶10mg、牛血清白蛋白10mg、胰酶抑制劑10mg，放入小培養(yǎng)瓶中，加入D-Hank’s5ml，充分溶解，濾頭過濾后備用。

2.1.2標本的分離制備：

動物采用SD大鼠2-3月齡，體質量200-250g，提前沿下腹剪毛，斷頸法處死動物，超凈工作臺內大鼠備皮處消毒后，在大鼠恥骨聯(lián)合后方尋找辨認膀胱后取出膀胱，將膀胱組織放入冷D-Hank’s（PH7.0）液中漂洗數(shù)分鐘，在解剖顯微鏡下縱行剪開膀胱，小心撕去膀胱粘膜和漿膜層后，制成細小肌條，并用D-Hankrsquo;s反復沖洗肌條3次。

將膀胱肌條剪成1times;1times;1mm3組織塊。

2.1.3細胞懸液制作：

將組織塊移入培養(yǎng)瓶，加入配制好的酶解液充分混勻，37℃培養(yǎng)箱中消化15分鐘，期間用吸管吹打2次，將消化好的組織懸液移入離心管離心，1500rpmtimes;5分鐘，棄上清，去除消化酶；在離心管中加入等量D-Hank’s，吹打混勻，組織懸液用200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎塊；將細胞懸液加進等體積的密度梯度分離液Ficoll400，1000r/min離心7min，棄上清。

2.1.4接種：

將分離好的細胞懸液加入適當?shù)腄MEM培養(yǎng)基(含DMEM成分、10%FBS、1mlAntibiotic、SCF50ng/ml)，取0.1ml的細胞液滴到血細胞計數(shù)板，計算細胞密度將細胞濃度調整至1times;106/ml并接種至6孔培養(yǎng)板，板中預先放置包被貼黏多聚賴氨酸的蓋玻片。

放入培養(yǎng)箱內，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)24h后換液，去除未貼壁細胞，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔1d換液一次，期間用倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

2.2膀胱ICCs細胞的鑒定細胞穩(wěn)定爬片培養(yǎng)5d后，進行免疫熒光檢測。

步驟：

傾去培養(yǎng)基，用0.01mol/PBS漂洗，5mintimes;3次；室溫下用4%多聚甲醛固定30min，0.01mol/PBS漂洗5mintimes;3次，在室溫下加入10%BSA封閉30min棄液；0.2%TritonX-100（10mlPBS，20mu;lTritonX-100）透膜15min棄液，；羊抗大鼠c-kit多克隆抗體（1：

500稀釋）滴到細胞片上，4℃過夜；次日0.01mol/PBS沖洗3次，每次5min；加入AlexaFluo488標記的羊抗兔二抗（1:150稀釋），37℃孵育1小時，0.01mol/PBS漂洗5分鐘times;3次；最后DIPI染核，指甲油封片后供激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.3阿米洛利對膀胱ICCs細胞內游離鈣離子的影響2.3.1染液配制：

Fluo-3-AM50ug溶于45ulDMSO(Fluo-3-AM濃度1mM)，15ul/支分裝，-20℃保存。

染色時用15～50mMHEPES緩沖液將其稀釋為1～20uM(如1.5ml為10uM)。

必要時，可加入助染劑HBSS增強染色效果。

2.3.2染色步驟：

1)取在圓形蓋玻片上培養(yǎng)細胞，緩沖液漂洗2～3次。

2)對照組加入500mu;lPBS，實驗組加入同濃度Fluo-3-AM(1～20uM)，37℃下孵育30分鐘。

3)緩沖液漂洗2～3次。

4)加0.5ml緩沖液，上機測量。

2.3.3細胞分組：

將待實驗細胞爬片分為實驗組和對照組。

實驗組分別以50mu;mol/L和100mu;mol/L的阿米洛利的PBS溶液孵育30分鐘，對照組以PBS孵育。

隨機選取20個目標細胞，要求選擇顯微鏡下細胞形態(tài)典型的、與周圍細胞無接觸孤立的ICCs細胞，用藥前、用藥后分別進行檢測，最后采用樣本均數(shù)進行統(tǒng)計學假設檢驗，檢驗水平Plt;0.050為差異有統(tǒng)計學意義。

3.結果3.1膀胱ICCs的分離與培養(yǎng)結果對大鼠膀胱細胞分離并培養(yǎng)8h后通過相差顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)胞體呈紡錘狀、梭形貼壁生長細胞，胞體較小，折光性強，有兩個長的突起或多個短的側突，梭形細胞兩極可見有兩個或多個突起的膀胱ICCs細胞，視野中偶見膀胱平滑肌細胞（SMC）其形態(tài)上與膀胱ICCs細胞有明顯區(qū)別，呈現(xiàn)短棒狀，ICCs-SMC可見類似神經(jīng)-肌肉突觸鏈接樣結構單元(圖1-A)。

培養(yǎng)72h后可見膀胱ICCs細胞突起間相互接觸(圖1-B)，原代分離培養(yǎng)8h膀胱ICCs光鏡下形態(tài)，藍色箭頭指示大鼠膀胱cajal間質細胞(ICCs)，藍色箭頭指示膀胱平滑肌細胞（SMC），可見ICCs-SMC間借助ICCs的突起相接處。

（times;40倍）(圖1-A)；原代分離培養(yǎng)72h膀胱ICCs光鏡下形態(tài)，可見ICCs-ICCs間突起相互交錯、接觸成網(wǎng)狀，部分ICCs細胞胞體呈紡錘形，折光性強，其中夾雜少量平滑肌肌細胞。

（times;20倍）(圖1-B)3.2膀胱ICCs細胞的鑒定待細胞穩(wěn)定爬片培養(yǎng)5d后行C-Kit免疫熒光抗體鑒定膀胱ICCs細胞，結果提示此類貼壁細胞C-Kit染色呈陽性，提示為膀胱ICCs細胞(圖2-A及圖2-B)。

膀胱ICCs培養(yǎng)5d后，免疫熒光染色激光共聚焦下細胞形態(tài)，紅色為細胞核，胞體C-kit受體熒光染色呈綠色，兩端可見長的細胞突起，形成ICCs-ICCs間突起相互交錯、接觸成網(wǎng)狀，細胞核與胞體重疊部分顯色成淡黃色。

(圖2-A)；膀胱ICCs細胞DIPI染核，細胞核呈紅色，標尺。

(圖2-B)3.3應用共聚焦顯微鏡鏡觀察阿米洛利對膀胱ICCs細胞內的Ca2＋波動的影響，統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)plusmn;標準差表示，檢驗方法采用配對t檢驗。

對照組的膀胱ICCs細胞呈有規(guī)律的亮度波動，Ca2＋波動振幅、頻率變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

而在被Ami孵育的實驗組中，與加藥之前相比，實驗1組(50mu;mol/L阿米洛利處理)，膀胱ICCs細胞的Ca2＋波動較孵育前有所頻率減慢但經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但Ca2＋波動振幅明顯較前變小，有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；而實驗2組(100mu;mol/L阿米洛利處理)的膀胱ICCs細胞的Ca2＋波動這種頻率和振幅下調的現(xiàn)象更為顯著(Plt;0.01)。

6.討論膀胱的貯尿、排尿功能有乃于膀胱結構的完整外還受自主神經(jīng)支配。

目前的研究表明膀胱黏膜由外向內由3種明顯的細胞層：

基底細胞層；中間細胞層；傘狀細胞層。

傘狀細胞層表面由葡萄糖胺聚糖層（GAG）、Uroplakin班及盤狀小泡、封閉帶組成的防水層。

Birder[10]等在對尿路上皮細胞的研究表明其具有感覺并且發(fā)出信號的特征，這使得它們能夠對周圍的物理和化學環(huán)境變化做出反應，并且傳遞給膀胱壁的下級傳導結構。

最近的有關超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(HCN陽離子通道，簡稱HCN通道)在ICCs胞膜上的發(fā)現(xiàn)為其膀胱活動的潛在起搏點提供一重要依據(jù)。

HCN離子通道在心臟的竇房結細胞，神經(jīng)元細胞等自律性細胞上被發(fā)現(xiàn)，被認為是起搏細胞的重要特征，同時HCN通道是產(chǎn)生起搏電流Ih(hyperpolarization-activatedinwardcurrent)的結構基礎。

相關研究表明Ih特異性阻斷劑ZD7288對ICCs細胞Ih有明顯抑制作用，從而可以抑制逼尿肌的收縮活動，而膀胱ICCs與神經(jīng)末梢間存在傳導電信號的縫隙連接,表明膀胱ICCs細胞可能是神經(jīng)膀胱ICCs細胞逼尿肌這一信號傳導通路的中間環(huán)節(jié)，為以膀胱ICCs細胞為靶點治療膀胱異?；顒有约膊√峁┝艘罁?jù)。

Fluo-3-AM是一種檢測細胞內鈣離子的熒光探針。

Fluo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與鈣離子Ca2+結合后熒光會增加60至80倍，是目前最常用的一種鈣離子熒光探針。

Fluo-3-AM被動擴散進入細胞后，被酯酶水解釋出Fluo-3，F(xiàn)luo-3會與Ca2+絡合，受488nm的激光激發(fā)而產(chǎn)生熒光，其熒光值與[Ca2+]i呈正相關，即以熒光值變化表示[Ca2+]i變化，在激光掃描共聚焦顯微鏡TimeSeries程序下對細胞XY平面進行掃描，基礎熒光值在圖像分析程序下按最小噪聲最大圖像信號人為設定。

計算細胞XY平面內平均熒光強度，以平均熒光強度代表細胞內Ca2+。

本實驗成功體外、分離培養(yǎng)大鼠膀胱ICCs細胞，對大鼠膀胱細胞分離并培養(yǎng)8h后通過相差顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)胞體呈紡錘狀、梭形貼壁生長細胞，胞體較小，折光性強，有兩個長的突起或多個短的側突，梭形細胞兩極可見有兩個或多個突起的膀胱ICCs細胞，視野中偶見膀胱平滑肌細胞（SMC）其形態(tài)上與膀胱ICCs細胞有明顯區(qū)別，呈現(xiàn)短棒狀，ICCs-SMC可見類似神經(jīng)-肌肉突觸鏈接樣結構單元(圖1-A)。

培養(yǎng)72h后可見膀胱ICCs細胞突起間相互接觸(圖1-B)，待細胞穩(wěn)定爬片培養(yǎng)5d后行C-Kit免疫熒光抗體鑒定膀胱ICCs細胞，結果提示此類貼壁細胞C-Kit染色呈陽性，提示為膀胱ICCs細胞，為膀胱ICCs細胞在逼尿肌異常活動相關疾病的研究提供了基本的實驗探索，SCF(干細胞生長因子)為ICCs細胞膜C-kit的配體，培養(yǎng)液中加入干細胞生長因子，是維持ICCs細胞表型和功能的關鍵；是進行該類研究的基礎。

本研究采用細胞內鈣離子的熒光探針（Fluo-3-AM）檢測經(jīng)阿米洛利處理后膀胱ICCs細胞[Ca2+]i變化。

結果表明：

對照組的膀胱ICCs細胞以PBS孵育前后仍有規(guī)律的亮度波動，Ca2＋波動振幅、頻率變化前后無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

而在被Ami孵育的實驗組中，與加藥之前相比，實驗1組(50mu;mol/L阿米洛利處理)，膀胱ICCs細胞的Ca2＋波動較孵育前有所頻率減慢但經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但Ca2＋波動振幅明顯較前變小，有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）；實驗2組(100mu;mol/L阿米洛利處理)的膀胱ICCs細胞的Ca2＋波動和振幅均下調，且下調較明顯，有顯著差異，統(tǒng)計學有意義(Plt;0.01)。

甲磺酸伊馬替尼(Glivec)在體內外均可在細胞水平上抑制酪氨酸激酶C受體，實驗表明甲磺酸伊馬替尼可以與ICCs細胞表面的酪氨酸激酶C受體結合并特異性阻斷酪氨酸激酶C受體，致使ICCs細胞內Ca2＋波動頻率、振幅下降，通使用Glivec后進行FRAP（熒光漂白實驗）實驗發(fā)現(xiàn)：

膀胱ICCs細胞與逼尿肌細胞之間的信號傳遞被明顯抑制。

鹽酸阿米洛利也有相似作用，由于膀胱GAG層細胞不能阻止鹽酸阿米洛利進入并影響傘狀細胞上皮表面的鈉通道功能，同時可以影響膀胱ICCs細胞內鈣離子波動，為優(yōu)勢，但其能否在膀胱灌注治療時透過膀胱粘膜而抑制膀胱ICCs而影響膀胱平滑肌的收縮尚需實驗驗證。

酸敏感離子通道（acid-sensingionchannels，ASICs）是一類由胞外液體酸化所激活的陽離子通道，酸化激活后產(chǎn)生電流并影響相關靶器官。

到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ASICs家族的6個亞基ASIC1a、ASIC1b、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。

這6個亞基可以按照不同的模式，組成同聚體或異聚體酸敏感離子通道。

已初步探明ASICs在人體內廣泛分布，在觸覺、痛覺、酸味覺、學習記憶以及部分病理反應中具有重要作用。

李霞等研究發(fā)現(xiàn)：

在脊髓背根有ASIC3較多的表達，與痛覺及傷害性感受密切相關，在慢性炎性疼痛的病理過程中發(fā)揮重要的作用，在炎性痛模型中可以增加脊髓背根ASIC3在轉錄和蛋白水平的表達；阻斷或敲除ASIC3基因(ASIC3-/-)能明顯抑制炎癥性關節(jié)痛。

上述研究表明，在生理或病理情況下,脊髓背根中ASIC3對脊髓水平的感覺信息傳遞特別是痛覺的傳導可能發(fā)揮著重要作用，這可能是關節(jié)炎疼痛的治療靶點。

有學者研究發(fā)現(xiàn)：

激活ASIC3可以刺激小腸迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元產(chǎn)生相應的電流改變，進而影響小腸平滑肌的收縮。

由此提出ASIC3與胃腸道收縮可能有一定的聯(lián)系。

ASIC3抑制劑鹽酸阿米洛利臨床上為保鉀利尿藥或鈉氫交換抑制劑。

目前除抑制ASICs外，短時間低劑量的的膀胱灌注不會產(chǎn)生任何的藥理作用。

由于ASIC3與痛覺和平滑肌收縮密切相關，OAB癥狀通常伴有不同程度的膀胱疼痛以及膀胱逼尿肌亢進。

因此我們大膽設想：

阿米洛利對膀胱ICCs細胞內Ca2+抑制波動的作用是否通過抑制ASIC3的表達通路完成的，其作用機制值得深入研究。

值得提出的是：

甲磺酸伊馬替尼(Glivec)雖然可以抑制膀胱ICCs細胞與逼尿肌細胞之間的信號傳遞，但尚無磺酸伊馬替尼(Glivec)能自由通過膀胱灌注進入黏膜下層的相關研究；同時其價格昂貴，難以在臨床上普及使用，而阿米洛利價格便宜。

本實驗通過基礎實驗證明阿米洛利對膀胱ICCs細胞內Ca2+抑制波動的作用，為OAB等膀胱異?；顒拥倪M一步研究提供新的思路。

參考文獻[1].WardSM，BurnsAJ，TorihashiS，etal.Mutationoftheprotooncogenec-kitblocksdevelopmentofinterstitialcellsandelectricalrhythmicityinmurineintestine.JPhysiol1994;480(Pt1):91-97.[