多肽合成與生物活性肽省公開課一等獎全國示范課微課金獎?wù)n件

多肽合成與生物活性肽一、多肽與多肽合成氨基酸甘氨酸（Gly、G）、丙氨酸（Ala、A）、苯丙氨酸（Phe、F）、谷氨酰胺（Gln、Q）、天冬酰胺（Asn、N）、纈氨酸（Val、V）、亮氨酸（Leu、L）、異亮氨酸（Ile、I）、脯氨酸（Pro、P）、甲硫氨酸（Met、M）、半胱氨酸（Cys、C，巰基）、絲氨酸（Ser、S，羥基）、蘇氨酸（Thr、T，羥基）酪氨酸（Tyr、Y，酚羥基）、色氨酸（Trp、W，吲哚基）、谷氨酸（Glu、E，羧基）、天冬氨酸（Asp、D、羧基）、賴氨酸（Lys、K，氨基）、精氨酸（Arg、R，氨基）、組氨酸（His、H，胺基）多肽（蛋白質(zhì)）

氨基酸“首－尾”以酰胺鍵相連，相連的氨基酸數(shù)較少時稱多肽，較多時稱蛋白質(zhì)。多肽、蛋白質(zhì)人工合成胰島素

1965年，我國上海生化所、上海有機(jī)所和北京大學(xué)的科學(xué)家經(jīng)過6年多的努力，在世界上首次人工合成具有生命活力的蛋白質(zhì)－牛胰島素。（1953年合成八肽－催產(chǎn)素，獲得了1955年諾貝爾化學(xué)獎。）

胰島素由A、B兩個肽鏈組成，A鏈有21個氨基酸，B鏈有個30個氨基酸，A鏈和B鏈間由三個二硫鍵連接起來。

上面的氨基酸縮合脫水形成肽的反應(yīng)式在生物體內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)的合成是成立的，但在人工合成多肽時，這一反應(yīng)式是不能實(shí)現(xiàn)的。液相法合成多肽

固相多肽合成方法

Merrifield在1962年開創(chuàng)了固相多肽合成法，并于1984年獲得諾貝爾化學(xué)獎。固相多肽合成法的原理：用交聯(lián)聚合物樹脂作為載體，肽的合成在交聯(lián)聚合物樹脂內(nèi)進(jìn)行（共價(jià)固載于載體上）。交聯(lián)聚合物樹脂在任何溶劑中都不能溶解，但在某些溶劑中可溶脹，這樣反應(yīng)物、催化劑等可擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部參與反應(yīng)。每一步反應(yīng)結(jié)束后，通過簡單的過濾、洗滌，即可將剩余的反應(yīng)物、催化劑、副產(chǎn)物等去掉，然后進(jìn)行下一步反應(yīng)。最后將合成的肽從樹脂上裂解下來。聚合功能基基化固相合成固相合成的優(yōu)點(diǎn)可以用過量的反應(yīng)試劑使反應(yīng)完全。每步的產(chǎn)物都固定于不溶于任何溶劑的固相載體上，因此所需產(chǎn)物與其它過量試劑、催化劑等小分子試劑的分離可通過簡單的過濾而實(shí)現(xiàn)。在裂解前的所有操作步驟中，固相載體始終處于同一容器中，沒有任何機(jī)械損失?？梢杂么筮^量的反應(yīng)試劑及催化劑，使每一步反應(yīng)趨于完全，提高產(chǎn)率，使最后的產(chǎn)物的純化更加容易。沒有液相法中遇到的當(dāng)肽鏈較長時不易找到合適的溶劑的問題。容易實(shí)現(xiàn)自動化?，F(xiàn)已有自動化程度很高的自動多肽合成儀。二、生物活性肽

生物活性肽在生命活動中起著非常重要的作用，如胰島素、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、催產(chǎn)素等。許多天然活性肽或天然活性肽的類似物也是非常重要的藥物，多肽作為藥物具有如下優(yōu)點(diǎn)。高效、專一，用量少

如鮭魚降鈣素劑量為20g/支（50000支/g)結(jié)構(gòu)多變，隨著各種生物技術(shù)和計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的發(fā)展，可得到具有各種功能的多肽藥物

如在計(jì)算機(jī)模擬的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了治療艾滋病的多肽藥物T-20。FDA已批準(zhǔn)200多種多肽和蛋白質(zhì)藥物的臨床應(yīng)用。代謝產(chǎn)物為無毒的氨基酸抗菌素的耐藥性

抗菌素的使用挽救了無數(shù)的生命，使人的預(yù)期壽命增加了十年以上。但隨著抗菌素的使用，細(xì)菌也逐漸對其產(chǎn)生了耐藥性。一個新藥研制的平均周期是約10年，而一個新抗菌素臨床使用后細(xì)菌對其產(chǎn)生耐藥性的平均時間為約2年。

一些超級細(xì)菌對目前使用的所有抗菌素包括被稱為抗菌最后防線的萬古霉素具有耐藥性。細(xì)菌感染住院的患者中約7%由于耐藥細(xì)菌感染而死亡。

陽離子抗菌肽抗菌素的種類

-內(nèi)酰胺類大環(huán)內(nèi)酯類喹諾酮四環(huán)素類氨基糖苷類磺胺類耐藥機(jī)理1.細(xì)菌變異細(xì)胞壁上抗菌素的結(jié)合部位，使抗菌素失去與細(xì)胞壁的結(jié)合能力。

如萬古霉素與細(xì)菌細(xì)胞壁粘肽末端的-D-Ala-D-Ala結(jié)合，從而抑制細(xì)菌的某些生理功能，起到抑菌作用。

抗萬古霉素的細(xì)菌則把-D-Ala-D-Ala變異成-D-Ala-D-Lac，使萬古霉素對其失去結(jié)合力而不起作用2.通過分泌

-內(nèi)酰胺酶而破壞化學(xué)上很不穩(wěn)定的

-內(nèi)酰胺類抗菌素的

-內(nèi)酰胺環(huán)。3.分泌某種酶修飾抗菌素上的某些基團(tuán)如乙?；u基等。陽離子抗菌肽1981年Boman等人從西哥羅佩蛾（MothHyalophoracecropia）體中分離得到抗菌多肽天蠶素（cecropin）（Nature，1981，292，246）。抗菌肽廣泛存在于動植物體內(nèi)，用來對付細(xì)菌、病毒和真菌等，已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已超過1000種?？咕闹卸己休^多的堿性氨基酸，在生理?xiàng)l件下帶凈正電荷，因此也叫陽離子抗菌肽。

抗菌肽的陽離子部分與細(xì)菌的細(xì)胞膜（陰離子性磷脂膜）的磷酸基負(fù)離子結(jié)合（靜電作用），多肽的疏水部分與細(xì)胞膜的碳?xì)滏溄Y(jié)合（疏水作用），從而起到抑菌作用。

抗菌機(jī)理抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性的原因

由于陽離子多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合的特異性不高，細(xì)菌不易通過簡單的變異或修飾多肽產(chǎn)生耐藥性。

抗菌肽的副作用

大部分抗菌肽除具有抗菌活性外，對哺乳動物細(xì)胞也有毒性，如溶血活性。

抗菌肽的抗菌活性和溶血活性都由多肽的兩親性引起，但一些抗菌肽具有溶血活性，而另一些抗菌肽沒有溶血活性的現(xiàn)象不能達(dá)到滿意的解釋。*BC,bloodcell;H,haemolymph;E,epithelialtissue.M.Zasloff,Nature,2002,415,389-395TableCommercialdevelopmentofantimicrobialpeptidesofanimaloriginModeofusePeptideCompanyApplicationStageToticalMSI-78GenaeralInfecteddiabeticCompletedPhaseIII;notfootulcersapprovedbyFDA,pend-ingadditionalstudiesToticalMBI-226MicrologixCatheterinfectionPhaseIIIToticalMBI-594MicrologixAcnePhaseIIOralIB-367IntrobioticsMucostisPhaseIIIOralP-113DemegenGingivitisPhaseIISystemicHeliomycinEntomedAntifungalPreclinicalSystemicHumanAMPharmAntibacterialPreclinicallavotoferricinSystemicBPIXomaMeningococcalPhaseIIImeningitisM.Zasloff,Nature,2002,415,389-395目前的研究熱點(diǎn)抗菌機(jī)理、溶血機(jī)理提高抗菌活性，抗菌活性不夠高，因而用量較大減小鏈長，肽鏈較長時合成成本高，且免疫源性高較少溶血副作用

GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2Melittin的氨基酸序列蜂毒肽(melittin)類似物

我們的研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽12－26殘基片斷基本保留抗菌活性，但溶血活性基本消失。

蜂毒肽由26個氨基酸組成，具有很強(qiáng)的抗菌活性，同時還具有很強(qiáng)的溶血副作用。Melittin的短缺肽及其類似物抗菌和溶血活性

PeptideHD50ag.HRBC（

g/ml）MICag.SA（

g/ml）Melittin56.25M(13-26)

1000012.5M(12-26)

1000012.5M(11-26)

100006.25M(11-26,G12W192L)11006.25M(11-26,G12A15W193L)2903.1以M(12-26)為模板，逐個改變1-9位的疏水性

GLPALISWIKRKRQQ-NH2結(jié)果：右側(cè)氨基酸的疏水性增加，則其抗菌活性顯著的增加；左側(cè)氨基酸的疏水性增加，則其抗菌活性略有增加。右側(cè)氨基酸的疏水性增加，則其溶血活性減小；左側(cè)氨基酸的疏水性增加，則其溶血活性增加。三、聚合物修飾多肽、蛋白質(zhì)藥物多肽、蛋白質(zhì)藥物的缺點(diǎn)口服生物利用率低

消化系統(tǒng)各種蛋白水解酶的降解作用保存壽命短血液半衰期短

血液及各器官中蛋白水解酶的降解作用、腎過濾清楚作用具有免疫原性不易穿透生物膜聚乙二醇，poly(ethyleneglycol)(PEG)，poly(ethyleneoxide)(PEO)：特性：兩親性，既親水又親油，可溶于水和許多有機(jī)溶劑如鹵代烴，鏈高度柔順。無毒，可靜脈注射、口服和外用高生物相容性，是已知聚合物中對蛋白質(zhì)的吸附作用最小的聚合物。表面用PEG修飾可減小對蛋白質(zhì)吸附，進(jìn)而降低被RES的俘獲和免疫反應(yīng)。多肽、蛋白質(zhì)藥物用PEG修飾MainadvantagesofPEGylatedprotein.PEGconjugateTypeofPEGylationsYeartomarketDiseasePEG–asparaginase(Oncaspar?)Random,linearPEG1994AcutelymphoblasticleukemiaPEG–adenosinedeaminase(Adagen?)Random,linearPEG1990Severecombinedimmunodeficiencydisease(SCID)PEG–interferonα2a(Pegasys?)Random,branchedPEG40kDa2002HepatitisCPEG–interferonα2b(PEG–Intron?)Random,linearPEG12kDa2000HepatitisCandclinicaltrialsforcancer,multiplesclerosis,HIV/AIDSApprovedPEGconjugatesPEGconjugateTypeofPEGylationsYeartomarketDiseasePEG–G-CSF(pegfilgrastim,Neulasta?)Selective,linearPEG20kDa2002TreatingofneutropeniaduringchemotherapyPEG–growthhormonereceptorantagonist(Pegvisomant,Somavert?)Random,linearPEG5kDa(geneticmodifiedprotein)2002AcromegalyApprovedPEGconjugates(continued)PEG修飾多肽、蛋白質(zhì)藥物的作用柔順的PEG鏈及其結(jié)合的水分子對多肽、蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用，減小蛋白酶對其的降解作用。PEG修飾使其分子量增大，減小腎過濾的清除作用。PEG的保護(hù)作用減小其免疫原性。PEG化后在更寬的pH和溫度范圍內(nèi)更穩(wěn)定。使多肽、蛋白質(zhì)藥物具有更高的療效顯著延長其血液半衰期副作用小保存時間長PEG分子量、支化對修飾多肽、蛋白質(zhì)藥物的影響PEG分子量愈大，則對多肽、蛋白質(zhì)的保護(hù)作用愈大，血液半衰期愈長，免疫原性愈小。支化的PEG對多肽、蛋白質(zhì)的保護(hù)作用比直鏈PEG的大。PEG化往往使多肽、蛋白質(zhì)的體外生物活性降低。PEG分子量愈大，體外生物活性降低降低得愈多。

PEG分子量的大小對多肽、蛋白質(zhì)的保護(hù)作用的影響和對其體外生物活性的影響是相互矛盾的。Interferon

-2a的PEG化ReactionmechanismofthesynthesisofPEG2-IFN.P.Bailon,etal.,BioconjugateChem.,2001,12,195-202

InVitroAntiviralActivitiesofInterferon

-2aandPEG2-IFNInterferon

-2aPEG化后其血清半衰期增加了70倍。Invivoantitumoractivityofinterferon

-2a(toppanel)andPEG2-IFN(bottompanel)Growthhormone-releasingfactor(GRF)的PEG化如果多肽中含有多個氨基，PEG化往往得到混合物。P.Espositoa,etal.,Adv.DrugDeliveryRev.2003,55,1279–1291PrimaryaminoacidsequenceofGRFInvitrobiologicalactivityofthetwoisomerscompositionGRF–1PEG5000andofthetwosinglemono-PEGylatedisomersBiologicalstabilityinhumanpooledplasma抗菌肽的PEG化Nisin用5000kDa的PEG修飾后抗菌活性完全喪失。A.Guiotto,etal.,IlFarmaco2003,58,45-50tachyplesin用5000kDa的PEG修飾Y.Imura,etal.,Biochim.Biophys.Acta2007,1768,1160–1169PEG分子量、支化對修飾多肽、蛋白質(zhì)藥物的影響PEG分子量愈大，則對多肽、蛋白質(zhì)的保護(hù)作用愈大，血液半衰期愈長，免疫原性愈小。支化的PEG對多肽、蛋白質(zhì)的保護(hù)作用比直鏈PEG的大。PEG化往往使多肽、蛋白質(zhì)的體外生物活性降低。PEG分子量愈大，體外生物活性降低降低得愈多。

PEG分子量的大小對多肽、蛋白質(zhì)的保護(hù)作用的影響和對其體外生物活性的影響是相互矛盾的。PEG修飾降低生物活性的原因直接修飾在活性部位。PEG的位阻作用。從熱力學(xué)原理分析，多肽的PEG化后其平動和轉(zhuǎn)動熵的增加是使其活性降低的普適原因

。用大分子量PEG修飾多肽（文獻(xiàn)中采用）（粗線代表多肽，細(xì)線代表PEG）

用小分子量PEG修飾強(qiáng)疏水性多肽的聚集和與受體的作用Self-assemblyofPEGylatedpeptidesandshieldingeffectbyPEGshell

多肽的固相合成及其PEG化MAGLLALILWIKRKR-NH2

mPEG750-MAmPEG750-GLLALILWIKRKR-NH2mPEG1100-MAmPEG1100-GLLALILWIKRKR-NH2TEMimagesofmPEG750-MA(a)andmPEG1100-MA(b)aggregates

DegradationprofilesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MAincubatedwithchymotrypsin(3.64

g/mL)atpH4.5and37C

DegradationprofilesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MAincubatedwith20%bovinecalfserumat37

C

AntimicrobialactivitiesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MA

藥物的靶向釋放藥物的控制釋放緩釋