《中級(jí)食品檢驗(yàn)工 》課件-實(shí)訓(xùn)任務(wù)7 大腸菌群的測(cè)定

實(shí)訓(xùn)任務(wù)7大腸菌群的測(cè)定中級(jí)食品檢驗(yàn)工目錄二

儀器和用具一

測(cè)定原理三

培養(yǎng)基及試劑四

操作方法五

注意事項(xiàng)大腸菌群是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。食品中的大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群的最可能數(shù)（簡(jiǎn)稱MPN）表示。據(jù)此含義，所有食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的大腸菌群均應(yīng)以100mL（g）食品內(nèi)允許含有大腸菌群的實(shí)際數(shù)值為報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。檢查大腸菌群數(shù)，一方面能表明食品中有無(wú)糞便污染，另一方面還可以根據(jù)大腸菌群數(shù)量的多少，判定食品受污染的程度。一、測(cè)定原理二、儀器和用具恒溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)。平皿：直徑為90mm。試管、廣口瓶或三角瓶、吸量管、載玻片、接種針。玻璃珠：直徑約為5mm。酒精燈、試管架。單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管。乳糖發(fā)酵管。伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）。生理鹽水。革蘭氏染色液。三、培養(yǎng)基及試劑1、檢樣稀釋（1）以無(wú)菌操作將檢樣25mL（25g）放于含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌三角燒瓶?jī)?nèi)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨制成1:10的均勻稀釋液。（2）用1mL滅菌吸量管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管使其混勻，制成1:100的稀釋液。（3）另取1mL滅菌吸量管，按上項(xiàng)操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸量管。（4）根據(jù)焙烤食品及糖果衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3次接種。四、操作方法2、發(fā)酵實(shí)驗(yàn)選擇3個(gè)稀釋度的樣品分別接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，可用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；接種量為1mL及1mL以下者，可用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每個(gè)稀釋度的樣品接種3管，置于36±1℃的恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告大腸菌群陰性：若有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行檢驗(yàn)。四、操作方法（1）分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置于36±1℃的恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18-24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色、鏡檢和乳糖復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。四、操作方法（2）復(fù)發(fā)酵證實(shí)實(shí)驗(yàn)在上述平板上、挑取可疑大腸菌群菌落1~2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。四、操作方法3、報(bào)告根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定大腸菌群為陽(yáng)性的管數(shù)，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的最可能數(shù)。1）程序大腸菌群的國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)法采用三步法，即乳糖發(fā)酵、分離培養(yǎng)和證實(shí)實(shí)驗(yàn)。第一步乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所以初發(fā)酵陽(yáng)性管經(jīng)過(guò)后兩步操作有可能成為陰性。大量檢驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)程序的符合率、初發(fā)酵與證實(shí)實(shí)驗(yàn)相差很大。一般來(lái)說(shuō)，如果平板上有較多典型的大腸菌群菌落，革蘭氏染色為陰性桿菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落較少或均不夠典型，則應(yīng)多挑菌落做證實(shí)實(shí)驗(yàn)，以免出現(xiàn)假陰性。只做一步初發(fā)酵，對(duì)某些食品來(lái)說(shuō)誤差較大。這樣做，會(huì)有相當(dāng)部分的合格樣品被作為不合格樣品處理，應(yīng)予以注意。五、注意事項(xiàng)2）挑取菌落大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱，大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等復(fù)雜多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。在實(shí)際工作中，為了提高大腸菌群的檢出率，應(yīng)當(dāng)熟悉其菌落的形態(tài)和色澤。在檢驗(yàn)方法中我們選用伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落大多呈紫黑色，有金屬光澤或無(wú)金屬光澤。菌落形態(tài)的其他方面（如菌落的大小、光滑與粗糙程度、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤(rùn)與干燥情況等）雖也應(yīng)注意，但不如色澤方面更為重要。五、注意事項(xiàng)選取的菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率也有密切的關(guān)系。在實(shí)際工作中，由于工作量較大，操作人員通常只挑取一個(gè)菌落檢驗(yàn)，但影響大腸菌群檢出率的因素很多，如食品種類、菌落色澤和形態(tài)、細(xì)菌種類等，只挑取一個(gè)菌落，由于概率問(wèn)題，很難避免假陰性的出現(xiàn)，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)，更是如此。所以，挑取菌落時(shí)一定要挑取典型菌落，若無(wú)典型菌落則應(yīng)多挑取幾個(gè)菌落，以免出現(xiàn)假陰性。五、注意事項(xiàng)2）挑取菌落3）產(chǎn)氣量在糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中經(jīng)?？梢钥吹?，在發(fā)酵套管內(nèi)存在極微小的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，類似這種情況能否算作產(chǎn)氣陽(yáng)性，這是許多人經(jīng)常遇到的問(wèn)題。大腸菌群的產(chǎn)氣量多時(shí)可以使發(fā)酵套管充滿氣體，少時(shí)產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)，但隨樣品種類而有不同，有米粒大小氣泡的也有陽(yáng)性檢出。五、注意事項(xiàng)另外，對(duì)未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管是否均應(yīng)做陰性處理，根據(jù)大量實(shí)踐工作經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，對(duì)這種情況應(yīng)慎重考慮，有時(shí)會(huì)遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸無(wú)氣，但復(fù)發(fā)酵卻證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的情況。有時(shí)套管內(nèi)雖無(wú)氣體，但在液面及管壁可以看到緩緩上升的小氣泡。所以對(duì)未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕敲動(dòng)或搖動(dòng)試管，若有氣泡沿管壁上浮，即考慮為有氣體產(chǎn)生，應(yīng)做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。這種情況的陽(yáng)性檢出率可達(dá)半數(shù)以上。五、注意事項(xiàng)4）MPN檢索表最可能數(shù)（MPN）是對(duì)樣品中活菌密度的估測(cè)。MPN檢索表采用3個(gè)稀釋度九管法，稀釋度的選擇基于對(duì)樣品中菌數(shù)的估測(cè)，較理想的結(jié)果應(yīng)是最低稀釋度3管為陽(yáng)性，而最高稀釋度3管為陰性。五、注意事項(xiàng)在查閱MPN檢索表時(shí)，應(yīng)注意以下問(wèn)題。（1）MPN檢索表中只提供了3個(gè)稀釋度，即1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)；若改用10mL(g)、1mL(g)、0.1mL（g）時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。其余情況可類推。