實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座

試驗課要求預習不遲到、早退、不曠課、有事請假穿白大褂、注意自我防護不能喧嘩，不做與試驗無關(guān)事認真完成試驗匯報值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、關(guān)燈和門窗實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第1頁一、試驗目標二、試驗原理三、試驗儀器及試劑四、試驗步驟五、注意事項六、數(shù)據(jù)處理及計算

試驗一兔血清免疫球蛋白分離實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第2頁一、試驗目標

學習并掌握鹽析法原理及用鹽析法進行免疫球蛋白分離與純化技術(shù)。（IgG

）實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第3頁

抗體結(jié)構(gòu)

抗體分子是由兩條輕鏈(lightchain,L鏈)和兩條重鏈(heavychain,H鏈)經(jīng)過鏈間二硫鍵連接而成。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第4頁二、試驗原理一鹽析

當用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍水化膜減弱甚至消失；同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，因為離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，愈加造成蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀，這個過程叫做鹽析。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第5頁試驗原理-鹽析不一樣蛋白質(zhì)因為所帶電荷不一樣以及水化程度不一樣，加入不一樣濃度中性鹽可分階段從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)鹽析中最慣用鹽是硫酸銨硫酸銨分級沉淀實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第6頁三、試驗儀器及試劑1.試驗材料：血清（兔免疫血清）。2.試劑：0.01mol/LpH7.4PBS、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、飽和硫酸按（用前以5mol/LNaOH調(diào)至pH7.4）、奈氏試劑。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第7頁三、試驗儀器及試劑3.用具：三角瓶、燒杯、各種吸管、小試管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或雙蒸水煮沸10min）、飯盒（裝碎冰）等。4.儀器：攪拌器、離心機等。5.溶液配制實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第8頁三、試驗試劑飽和硫酸銨溶液配制：稱（NH4）2SO4400～425克，以70～80℃之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水（28%氨溶液）調(diào)PH至7.4。配制好飽和硫酸銨，瓶底應有結(jié)晶析出。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第9頁磷酸鹽緩沖液0.2M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液（PhosphateBufferedSalinePBS）配制。

貯存液：

A液：0.2MNaH2PO4：NaH2PO4·2H2O31.2克，加蒸餾水至1000ml；

B液：0.2MNa2HPO4：Na2HPO4·12H2O71.7克，加蒸餾水至1000ml；應用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋，加入NaCl至終濃度為0.85%，即為PBS。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第10頁柰氏試劑HgI11.5g，KI8.0g，加雙蒸水至50ml；攪拌溶解后過濾，濾液中再加入濃度為20%溶液NaOH50ml。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第11頁四、試驗步驟1兔免疫血清制備實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第12頁2硫酸銨分級沉淀（1）取制備好血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置10min。（2）3000r/min離心10min，棄去上清。（3）用6ml磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4飽和溶液3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置10min。（4）3000r/min離心10min，棄上清。（5）為深入純化，可重復步驟32~3次。實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第13頁3透析去鹽（6）用5mlPBS溶解沉淀，裝入透析袋。（7）透析除鹽，中間換液數(shù)次，至奈氏試劑測透析外液無黃色。

實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第14頁五、數(shù)據(jù)處理及計算蛋白含量（mg/mL）＝（1.45×OD280nm－0.74×OD260nm）×樣品稀釋度注：式中1.45與0.74為常數(shù)，nm為波長。蛋白質(zhì)及其定量判定：取樣品少許作適量稀釋，以紫外分光光度計測量蛋白含量

260、280nm處讀數(shù)實驗兔血清免疫球蛋白分離和純化專家講座第15