基于mRNA-LNP技術(shù)的（細(xì)胞）免疫治療產(chǎn)品開發(fā)指南

GB/TXXXXX—XXXX基于mRNA-LNP技術(shù)的（細(xì)胞）免疫治療產(chǎn)品開發(fā)指南范圍本文件適用于基于mRNA-LNP技術(shù)的（細(xì)胞）免疫治療產(chǎn)品開發(fā)的全流程和相關(guān)質(zhì)量管理，包括mRNA-LNP制備及質(zhì)量控制、工程化免疫細(xì)胞制備及質(zhì)量控制、功能驗證，以及物料管理、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)備、人員管理等須遵循的基本要求和原則，旨在幫助研究機(jī)構(gòu)更好地利用mRNA-LNP技術(shù)開發(fā)細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品。本文件適用于科研機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)基于mRNA-LNP技術(shù)開發(fā)CAR-T或CAR-NK細(xì)胞等免疫治療產(chǎn)品的全過程。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成對本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29022粒度分析動態(tài)光散射法GB/T42398細(xì)胞培養(yǎng)潔凈室設(shè)計技術(shù)規(guī)范GB50457醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)JGJ91科研建筑設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)ISO17867粒度分析-小角度X射線散射[Particlesizeanalysis—SmallangleX-rayscattering（SAXS）]中華人民共和國藥典（簡稱《中國藥典》）國家藥包材標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）細(xì)胞制品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）體細(xì)胞臨床研究工作指引（試行）藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范脂質(zhì)體藥物非臨床藥代動力學(xué)研究指導(dǎo)原則新藥用輔料非臨床安全性評價指導(dǎo)原則藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則藥品包裝材料與藥物相容性試驗指導(dǎo)原則醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)開展研究者發(fā)起的臨床研究管理辦法藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范中華人民共和國人類遺傳資源管理條例化學(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）化學(xué)藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南（試行）國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）E6（GoodClinicalPractice）來源于人或動物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全性評價（ViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin）美國藥典（TheUnitedStatesPharmacopoeia）術(shù)語和定義信使核糖核酸（mRNA）MessengerRNAmRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的單鏈核糖核酸，攜帶遺傳信息能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸。在細(xì)胞內(nèi)，mRNA通過與核糖體結(jié)合，并在tRNA（轉(zhuǎn)運RNA）的幫助下，翻譯成多肽鏈，進(jìn)而形成蛋白質(zhì)。mRNA在基因表達(dá)過程中起著承上啟下的作用，它從DNA傳遞遺傳信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制生物體的生長、發(fā)育和功能。自擴(kuò)增核糖核酸（saRNA）Self-amplifyingRNA自擴(kuò)增RNA是一種能夠以自身序列為模板，進(jìn)行自我擴(kuò)增的線性mRNA。saRNA主要衍生于甲病毒基因組，通過替換病毒結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因序列編碼來構(gòu)建。因此，saRNA保持了源于RNA病毒載體的自復(fù)制活性，在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后可以像病毒一樣，能夠利用宿主細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制，并指示細(xì)胞持續(xù)制造治療性蛋白質(zhì)來發(fā)揮作用。環(huán)狀RNA（circRNA）circularRNA一類單鏈閉合的RNA分子，由mRNA前體通過可變剪接產(chǎn)生，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。體外轉(zhuǎn)錄Invitrotranscription主要是以質(zhì)粒DNA為模板通過體外轉(zhuǎn)錄得到RNA，常用的是以線性化質(zhì)粒DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板利用RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成。PIE（PermutedIntron-Exon）系統(tǒng)一種將mRNA合成環(huán)狀RNA的系統(tǒng)。通過序列設(shè)計將天然的內(nèi)含子、外顯子反向剪切而形成新的內(nèi)含子-外顯子構(gòu)建體，可以在構(gòu)建體中間插入目的序列，這個構(gòu)建體為PIE系統(tǒng)。超濾ultrafiltration一項膜分離技術(shù)，主要以壓力為動力，將大分子與小分子進(jìn)行分離，常用于溶液中溶劑的置換，樣品的純化等。RNAR酶RNaseR具有催化功能的小分子RNA，屬于生物催化劑。RNaseR能消化線性RNA（LinearRNA），但不能消化環(huán)狀RNA（CircularRNA，circRNA）、套索RNA（LariatRNA）、3’突出末端少于7個核苷酸的雙鏈RNA以及具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的tRNA、5SRNA等。脂質(zhì)納米顆粒（LNP）lipidnanoparticle是一種由多個脂質(zhì)成分構(gòu)建的納米級載體。它通常由可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)組成。聚合物分散性指數(shù)（PDI）polydispersityindex一種描述顆粒尺寸分布均勻程度的參數(shù)。PDI的值越小，顆粒尺寸分布越均勻；反之，PDI的值越大，顆粒尺寸分布越不均勻。佐劑adjuvant與抗原同時或預(yù)先注射，可非特異性地增強(qiáng)或改變機(jī)體對抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，稱為佐劑。微流控microfluidic使用微管道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）。氮磷比（N/P）nitrogenphosphorusratio基于陽離子胺氮（在陽離子脂質(zhì)中）和核酸中磷酸基團(tuán)濃度計算正負(fù)電荷之比?？缒海═MP）transmembranepressure純化系統(tǒng)中跨越透析膜兩側(cè)的壓力差。免疫原性immunogenicity能引起免疫應(yīng)答的性能，即抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性。轉(zhuǎn)錄Transcription是遺傳信息從DNA流向RNA的過程。即以雙鏈DNA中的確定的一條鏈（模板鏈用于轉(zhuǎn)錄，編碼鏈不用于轉(zhuǎn)錄）為模板，以A、U、C、G四種核糖核苷酸為原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的過程。質(zhì)粒plasmid一類存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中獨立于染色體DNA而自主復(fù)制的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子，通常攜帶一定數(shù)量的基因，是基因工程最常見的載體。外周血單個核細(xì)胞（PBMC）peripheralbloodmononuclearcell血液中具有單個核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和少量其他細(xì)胞類型。核糖核酸酶（RNase）ribonuclease水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。脫氧核糖核酸酶（DNase）deoxyribonuclease水解脫氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯鍵，生成寡核苷酸或單核苷酸的核酸酶。STR分析shorttandemrepeatSTR分型檢測是一種用于檢測人類及哺乳動物的基因組。T細(xì)胞T-lymphocyteT淋巴細(xì)胞來源于骨髓的多功能干細(xì)胞（胚胎期則來源于卵黃囊和肝）。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞competentcell理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，吸收周圍環(huán)境中的DNA分子，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。核苷酸nucleotide核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物，又稱核甙酸。自然殺傷細(xì)胞（NK）naturalkillercell自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生，能夠識別靶細(xì)胞、殺傷介質(zhì)。原液Bulk指用于制造最終配制物（Fillalformulation）或半成品（FinalBulk）的均一物質(zhì)?？s略語3’UTR：3′非翻譯區(qū)（3’Un-translatedregion）5’UTR：5′非翻譯區(qū)（5’Un-translatedregion）ATP：腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate）CAR：嵌合抗原受體（ChimericAntigenReceptor）CAR-T：嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimericantigenreceptorTcell）CAR-NK：嵌合抗原受體NK細(xì)胞（chimericantigenreceptorNKcell）CAR-qPCR：測定CAR部分的qPCR方法（CARQuantitativePCR）CD3+：分化抗原簇3（ClusterofDifferentiation3）CD4+：分化抗原簇4（ClusterofDifferentiation4）CD8+：分化抗原簇8（ClusterofDifferentiation8）CRS：細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokinereleasesyndrome）DLT：劑量限制性毒性（Doselimitingtoxicity）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）ddPCR：微滴式數(shù)字PCR（DropletDigitalPCR）dsRNA：雙鏈核糖核酸（double-strandedRNA）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay）FACS：流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）FOB：功能觀察試驗組合（FunctionalObservationBattery）GTP：鳥苷三磷酸（Guanosinetriphosphate）HHV：人類皰疹病毒（Humanherpesvirus）HPLC：高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography）HPLC-CAD：高效的高效液相色譜-電霧式檢測器（high-performanceliquidchromatography-diodearraydetection）HLA：人類白細(xì)胞抗原（humanleukocyteantigen）IIT：研究者發(fā)起的臨床試驗（Investigator-InitiatedClinicalTrial）IL-2：白細(xì)胞介素-2（interleukin2）IL-4：白細(xì)胞介素-4（interleukin4）IL-6：白細(xì)胞介素-6（interleukin6）IL-10：白細(xì)胞介素-10（interleukin10）INF-γ：干擾素γ（Interferongamma）IVT：體外轉(zhuǎn)錄（Invitrotranscription）IST：藥企發(fā)起的臨床試驗（Industry-SponsoredClinicalTrial）mRNA：信使RNA（MessagerRNA）mRNAseq：轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（mRNAsequencing）nickedRNA：circRNA的開環(huán)異構(gòu)體NAT：核酸擴(kuò)增檢測法（nucleicacidamplificationtest）NTP：核苷三磷酸（Nucleosidetriphosphate）PBMC：外周血單個核細(xì)胞（Peripheralbloodmononuclearcell）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）Poly（A）：聚腺嘌呤（Polyadenine）RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR）preRNA：前體RNA（precursorRNA）qPCR：定量PCR（QuantitativePCR）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）SAXS：X射線小角散射（small-anglex-rayscattering）TNF-α：腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor）mRNA-LNP制備及質(zhì)量控制模板質(zhì)粒序列設(shè)計與合成mRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計與合成線性mRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計與合成DNA轉(zhuǎn)錄模板設(shè)計宜包括：目的基因。宜分別闡述其序列來源、基因和氨基酸序列、共翻譯機(jī)制，以及在疾病預(yù)防或治療中的作用；功能性元件的設(shè)計及確認(rèn)研究結(jié)果。功能性元件的設(shè)計宜包括轉(zhuǎn)錄啟動子的選擇，帽子結(jié)構(gòu)設(shè)計，5’UTR和3’UTR的設(shè)計，信號肽和蛋白標(biāo)簽的設(shè)計（如有），Poly（A）加尾結(jié)構(gòu)及長度設(shè)計，線性化位點選擇，所用核苷三磷酸（NTP）類型及其修飾信息等。若對編碼目的蛋白的mRNA序列進(jìn)行了任何修飾、序列優(yōu)化（如密碼子優(yōu)化等），宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的（如提高mRNA翻譯效率、降低模板合成難度、降低先天免疫原性、增加穩(wěn)定性等）。宜保留修飾或優(yōu)化后的序列示意圖等，并對序列修飾或優(yōu)化的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，保留確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。自復(fù)制mRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計與合成使用自復(fù)制mRNA載體來表達(dá)目的蛋白，除了闡述目的基因外，需保留以下信息：編碼病毒RNA依賴性RNA聚合酶復(fù)合物（復(fù)制子）的序列來源，并闡述其功能；若復(fù)制子序列含有氨基酸突變，闡述突變的依據(jù)和功能變化；若自復(fù)制mRNA的加帽序列與病毒天然起始序列不一致，闡述選擇依據(jù)和效果對比情況；若病毒復(fù)制子與目的蛋白分別位于不同的mRNA分子上，需額外的控制措施（比如二者長度、純度、加帽類型和摩爾比例）以確保它們的協(xié)同作用，并予以說明。若對自復(fù)制mRNA序列進(jìn)行了任何修飾、序列優(yōu)化，宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的。宜保留修飾或優(yōu)化后的序列示意圖等，并對序列修飾或優(yōu)化的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，保留確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。circRNA模板質(zhì)粒序列設(shè)計與合成序列設(shè)計策略circRNA成環(huán)策略包括化學(xué)合成法、酶促連接法、Ⅰ型內(nèi)含子自剪接系統(tǒng)、Ⅱ型內(nèi)含子自剪接系統(tǒng)等，宜闡述模板設(shè)計的環(huán)化方式及成環(huán)原理。目的基因宜闡述目的基因來源、基因和氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)，及其表達(dá)蛋白在疾病預(yù)防或治療中的作用或作用機(jī)理。關(guān)注序列篩選及優(yōu)化過程，若對編碼目的基因序列進(jìn)行了任何修飾、序列優(yōu)化或序列改構(gòu)，宜保留修飾或序列優(yōu)化的依據(jù)與目的。宜保留結(jié)構(gòu)示意圖等，宜與數(shù)據(jù)庫收錄的相關(guān)序列進(jìn)行序列比對，并對基因修飾或序列改構(gòu)的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析，保留確認(rèn)的支持性研究結(jié)果。功能性元件宜提供功能性元件的設(shè)計及確認(rèn)研究結(jié)果。功能性元件的設(shè)計宜包括轉(zhuǎn)錄啟動子、自剪切內(nèi)含子的選擇，IRES結(jié)構(gòu)設(shè)計，5’UTR和3’UTR的設(shè)計，外顯子殘留，Poly（A）加尾結(jié)構(gòu)及長度設(shè)計，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯效率相關(guān)元件、選擇性標(biāo)記、復(fù)制起始位點、額外引入的基因序列等的來源及選擇依據(jù)，明確完整的帶注釋的序列信息。宜設(shè)計合理線性化酶切位點，避免多余序列殘留。質(zhì)粒構(gòu)建時宜避免使用β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因。質(zhì)粒載體骨架部分序列設(shè)計與合成對質(zhì)粒模板骨架中包含的控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來源進(jìn)行闡述，如：轉(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、抗生素抗性標(biāo)記、質(zhì)粒復(fù)制子、多克隆位點、線性化位點等。宜選擇高拷貝的質(zhì)粒復(fù)制子（如pUC/pBR322），以提升質(zhì)粒產(chǎn)量。抗生素使用應(yīng)符合《中國藥典》的相關(guān)要求，避免使用β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因。多克隆位點宜包含常見且唯一的限制性內(nèi)切酶位點如HindIII、BamHI、NotI等。明確轉(zhuǎn)錄啟動子（如T7啟動子）及其下游的加帽起始序列。明確終止子的序列及其功能。宜設(shè)計合理線性化酶切位點，避免多余序列殘留。模板質(zhì)粒序列設(shè)計與合成質(zhì)量控制對轉(zhuǎn)錄模板的控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來源進(jìn)行闡述，如：轉(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、抗生素抗性標(biāo)記等進(jìn)行分析。抗生素使用應(yīng)符合《中國藥典》的相關(guān)要求。提供構(gòu)建和制備轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒的詳細(xì)信息和步驟、鑒定及確證方法。宜結(jié)合工程菌種子庫的檢定對轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒進(jìn)行全基因序列分析及確認(rèn)，提供用于生產(chǎn)mRNA或circRNA的轉(zhuǎn)錄模板的全長核苷酸序列，宜分析轉(zhuǎn)錄模板的控制元件、插入的目的基因序列、選擇標(biāo)記基因有無變異等。質(zhì)粒模板中包含Poly（A）序列，宜通過測序等方法確保質(zhì)粒模板中Poly（A）序列的完整性可以滿足下游應(yīng)用。建立種子批系統(tǒng)建立種子批的關(guān)鍵起始原材料包括質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細(xì)胞，宜有清晰的來源和完整的溯源信息，對轉(zhuǎn)錄模板質(zhì)粒宜明確其控制元件和選擇標(biāo)記的序列與來源，如轉(zhuǎn)錄啟動子、抗生素抗性標(biāo)記等。將合格的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至適宜的宿主菌，經(jīng)克隆篩選后建立至少兩級種子批系統(tǒng)，宜避免存在其他細(xì)菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保在限定代次內(nèi)具有遺傳穩(wěn)定性。原始種子庫的建立過程包括模板質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、單克隆篩選和傳代培養(yǎng)。其中單克隆篩選宜重點關(guān)注模板質(zhì)粒的產(chǎn)量、超螺旋純度、Poly（A）完整性等。主種子庫和工作種子庫的建立過程包括種子復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)和分裝凍存。建庫過程宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，確保無外源因子污染和交叉污染。建立種子庫使用的物優(yōu)先采用風(fēng)險級別較低的物料，如國家已批準(zhǔn)上市的藥品，藥用級原輔料，GMP級物料，宜避免使用人源或動物源性物料。對各級種子庫，宜明確制備規(guī)模、擴(kuò)增條件、貯存條件等信息。種子庫標(biāo)簽標(biāo)明菌種編號、模板質(zhì)粒名稱、代次、批號、規(guī)格和制備日期等內(nèi)容。種子庫的管理宜遵循《中國藥典》通則“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制”的要求。種子庫檢定和穩(wěn)定性研究種子批檢定宜遵循《中國藥典》通則“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制”和“人用基因治療制品總論”的要求。種子批的檢定項目一般包括菌落形態(tài)、鑒別、染色鏡檢、生化特性、活率、抗生素抗性、電鏡檢查、目的基因和其他元件測序、限制性酶切圖譜等，種子批宜無其他細(xì)菌、真菌、噬菌體等污染。對主種子庫和工作種子庫進(jìn)行傳代穩(wěn)定性研究，使用模擬或代表實際生產(chǎn)工藝的條件開展傳代穩(wěn)定性研究，種子批的遺傳和表型特征宜能滿足生產(chǎn)需求。傳代穩(wěn)定性考察的指標(biāo)一般包括質(zhì)粒序列、質(zhì)粒限制酶切圖譜、質(zhì)粒保有率、質(zhì)粒拷貝數(shù)、超螺旋純度、Poly（A）完整性等。根據(jù)研究結(jié)果明確種子批的限定傳代代次。限定傳代代次需要覆蓋生產(chǎn)規(guī)模的最大代次。宜對主種子庫和工作種子庫開展貯存穩(wěn)定性研究，關(guān)注在貯存條件下和時長內(nèi)種子庫的活菌數(shù)和活率等，種子批的貯存穩(wěn)定性宜能滿足生產(chǎn)需求。模板質(zhì)粒制備模板質(zhì)粒的制備應(yīng)基于種子庫系統(tǒng)，一般包括種子庫復(fù)蘇和擴(kuò)增、發(fā)酵、純化和分裝保存，宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，確保無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測。模板質(zhì)粒的制備過程中不宜使用人源和動物源性材料。在發(fā)酵過程中不宜使用β-內(nèi)酰胺類抗生素。如需使用其他種類的抗生素，如卡那霉素，宜說明使用的必要性，并對模板質(zhì)粒的純化中間體及成品的抗生素殘留量進(jìn)行控制和安全性評估。模板質(zhì)粒的純化工藝單元的設(shè)定宜考慮后續(xù)生產(chǎn)規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。模板質(zhì)粒的成品分裝規(guī)格宜與后續(xù)的質(zhì)粒DNA線性化規(guī)模相適應(yīng)，宜開展儲存穩(wěn)定性研究。模板質(zhì)粒的成品標(biāo)簽標(biāo)明質(zhì)粒名稱、貯存條件、批號、規(guī)格、生產(chǎn)日期等信息。模板質(zhì)粒質(zhì)量控制宜建立模板質(zhì)粒質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。特別注意外源因子污染和交叉污染，宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測。無菌可參照《中國藥典》通則“1101無菌檢查法”，或選用快速無菌檢查法如ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用進(jìn)行檢測。細(xì)菌內(nèi)毒素按照《中國藥典》通則“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：凝膠法、光度測定法”檢測。外觀可參照《中國藥典》通則“0901溶液顏色檢查法”、“0902澄清度檢查法”、“0904可見異物檢查法”進(jìn)行檢測。pH按照《中國藥典》通則“0631pH值測定法”檢測。質(zhì)粒純度（A260/280）按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留按照《中國藥典》通則“3412菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”檢測。宿主細(xì)胞DNA殘留量按照《中國藥典》通則“3407外源性DNA殘留量測定法”檢測。宿主細(xì)胞RNA殘留量可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細(xì)管電泳”，或選用PCR法、熒光毛細(xì)管電泳CE法進(jìn)行檢測。全序列測定可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則”，或選用sanger法進(jìn)行檢測。質(zhì)粒濃度（A260）按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。RNase殘留可參照熒光探針法（詳見附錄A），或選用ELISA法進(jìn)行檢測。限制性內(nèi)切酶鑒別可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細(xì)管電泳”進(jìn)行檢測。Poly（A）完整性可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則”、“0542毛細(xì)管電泳法”，或選用sanger法進(jìn)行檢測。超螺旋比例可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0513離子色譜法”、“0542毛細(xì)管電泳法”、“3431質(zhì)粒DNA構(gòu)象測定法”進(jìn)行檢測。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表1。表1模板質(zhì)粒質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值鑒別限制性內(nèi)切酶鑒別《中國藥典》三部電泳法（通則0541）毛細(xì)管電泳法（通則0542）實測條帶應(yīng)與理論條帶一致全序列測定《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（9108）；Sanger法非PloyA區(qū)的實測序列應(yīng)與理論序列一致Poly（A）完整性《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（通則9108）；Sanger法理論長度±論長度《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）-含量質(zhì)粒濃度（A260）《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）1.0±0.1mg/ml純度質(zhì)粒純度（A260/280）《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（0401）1.8-2.0超螺旋比例《中國藥典》三部通則高效液相色譜法（0512）、離子色譜法（0513）、毛細(xì)管電泳法（0542）、質(zhì)粒DNA構(gòu)象測定法（3431）≥90%產(chǎn)品及工藝相關(guān)雜質(zhì)宿主細(xì)胞殘留蛋白《中國藥典》三部菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法（通則3412）<0.10%宿主DNA殘留量《中國藥典》三部外源性DNA殘留量測定法（通則3407）<1.0%宿主RNA殘留量《中國藥典》三部電泳法（通則0541）-《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳（通則0542）-PCR法-熒光毛細(xì)管電泳CE法-RNase殘留熒光探針法≤3.125×10-10mg/mlELISA法-安全性細(xì)菌內(nèi)毒素《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：凝膠法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：光度測定法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定無菌《中國藥典》三部無菌檢測法（通則1101）；ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用陰性其它pH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）無色澄明/澄清液體質(zhì)粒DNA線性化制備流程制備流程：酶切→陰離子交換層析→超濾濃縮→除菌過濾→分裝。模板質(zhì)粒的線性化模板質(zhì)粒的線性化宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，宜使用一次性設(shè)備和耗材，避免外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐笵Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的DNase消除和殘留檢測。模板質(zhì)粒的線性化過程宜通過被確認(rèn)過的工藝參數(shù)，獲得線性化比例符合質(zhì)量控制要求的線性化DNA。線性化質(zhì)粒的純化線性化質(zhì)粒的純化宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，明確制造工藝各單元操作，同時按照經(jīng)過驗證和批準(zhǔn)后的操作規(guī)程的要求進(jìn)行。純化過程宜建立合理的中間體質(zhì)量控制程序，監(jiān)測和控制工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主DNA殘留，宿主蛋白殘留，和宿主RNA殘留。線性化質(zhì)粒的分裝在無菌條件下，使用符合要求的包裝材料對除菌過濾后的樣品進(jìn)行分裝，分裝精度、規(guī)格、包材宜經(jīng)過確認(rèn)和驗證。樣品宜儲存在經(jīng)確認(rèn)和驗證過的合適的儲存條件及環(huán)境下。線性化質(zhì)粒DNA原液質(zhì)量控制宜建立線性化質(zhì)粒DNA原液質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。細(xì)菌內(nèi)毒素、外觀、pH、A260/A280純度、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留、宿主細(xì)胞DNA殘留量、宿主細(xì)胞RNA殘留、序列測定、濃度、RNase殘留按照—1檢測。質(zhì)粒檢查按照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測。線性比例可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0513離子色譜法”、“0542毛細(xì)管電泳法”、“3431質(zhì)粒DNA構(gòu)象測定法”進(jìn)行檢測?？偟鞍讱埩艨蓞⒄铡吨袊幍洹吠▌t“0731蛋白質(zhì)含量測定法”，或選用熒光法（詳見附錄D）進(jìn)行檢測。微生物限度按照《中國藥典》通則“1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表2。表2線性化質(zhì)粒原液質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值理化性質(zhì)外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）無色澄明/澄清液體濃度《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）1.0±0.1mg/mlpH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定鑒別序列準(zhǔn)確性《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（9108）；Sanger法與理論序列相符質(zhì)粒檢查《中國藥典》三部電泳法（通則0541）酶切后無雜帶且條帶符合理論大小純度A260/A280純度《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）1.8-2.0線性比例《中國藥典》三部通則高效液相色譜法（通則0512）、離子色譜法（通則0513）、毛細(xì)管電泳法（通則0542）、質(zhì)粒DNA構(gòu)象測定法（通則3431）≥90.0%工藝相關(guān)雜質(zhì)總蛋白殘留《中國藥典》三部蛋白質(zhì)含量測定法（通則0731）≤1.0%熒光法-宿主細(xì)胞DNA殘留量《中國藥典》三部外源性DNA殘留量測定法（通則3407）<1.0%宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留《中國藥典》三部菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法（通則3412）<0.10%宿主細(xì)胞RNA殘留量《中國藥典》三部電泳法（通則0541）-《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳（通則0542）-PCR法-熒光毛細(xì)管電泳CE法-RNase殘留熒光探針法檢測≤3.125×10-10mg/ml安全性細(xì)菌內(nèi)毒素《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法：凝膠限度試驗（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：光度測定法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定微生物限度《中國藥典》三部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）<1cfu/mlmRNA合成線性mRNA合成mRNA的合成所用原材料遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，根據(jù)物料風(fēng)險等級建立相適應(yīng)的控制措施。mRNA生產(chǎn)過程需要進(jìn)行原料藥制備，再進(jìn)行制劑的制備，原料藥制備過程中常使用PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒作為模板，宜制定模板的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。mRNA原料藥和制劑生產(chǎn)過程遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，宜保證純度以及無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase等污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測。研究與優(yōu)化mRNA的關(guān)鍵工藝參數(shù)，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應(yīng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)，關(guān)鍵工藝參數(shù)如下：體外轉(zhuǎn)錄工藝中的反應(yīng)體系、RNA聚合酶濃度以及活性標(biāo)準(zhǔn)、帽子類似物（共轉(zhuǎn)錄體系）、NTP濃度、轉(zhuǎn)錄時間、溫度、Mg2+、補(bǔ)料方式、終止反應(yīng)條件等；DNA酶處理工藝（如有）中的DNA酶濃度、純度酶活性標(biāo)準(zhǔn)、處理時間、溫度、補(bǔ)料方式、終止反應(yīng)條件等；酶法加帽工藝（如有）宜研究RNA反應(yīng)濃度、加帽反應(yīng)緩沖體系、加帽酶濃度純度活性標(biāo)準(zhǔn)、物料投料比（如mRNA、鳥苷三磷酸（GTP）、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、RNA酶抑制劑、加帽酶等）、補(bǔ)料方式、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等；對加帽類型（如有）及不同加帽類型的比例進(jìn)行研究，有利于mRNA轉(zhuǎn)錄的5’UTR和3’UTR的選擇和優(yōu)化；加Poly（A）尾工藝（如有）宜研究加尾反應(yīng)體系、ATP濃度、加尾酶濃度純度活性標(biāo)準(zhǔn)、反應(yīng)溫度、時間、補(bǔ)料方式等；去磷酸化工藝中（如有）的磷酸酶濃度、反應(yīng)時間、補(bǔ)料方式等；如涉及修飾核苷酸，宜明確被修飾的核苷酸、修飾類型、修飾后的純化方法和純度、投料比例等。且在保證不影響mRNA轉(zhuǎn)染的情況下，對修飾進(jìn)行優(yōu)化，促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性；mRNA純化（如有）宜研究純化方式、純化條件、純化后mRNA濃度、純度、完整性、雜質(zhì)殘留等；過濾除菌工藝（如有）宜研究過濾后mRNA的生物活性；mRNA凍干（如有）宜研究凍干方式、凍干條件、分裝方式、凍干復(fù)溶后mRNA濃度質(zhì)量，如濃度、純度、完整性、溶解性、表達(dá)蛋白效力等；circRNA合成circRNA合成所用原材料宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，根據(jù)物料風(fēng)險等級建立相適應(yīng)的控制措施。DNA模板的質(zhì)量控制應(yīng)當(dāng)符合《中國藥典》要求，保證無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase污染。circRNA制備宜明確circRNA環(huán)化方法，包括以下幾種：化學(xué)連接法：可通過溴化氰（BrCN）或1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺（EDC）將線性RNA的首尾連接成環(huán)。酶法連接：常用于RNA環(huán)化的酶有3種，T4DNA連接酶1（T4Dnl1）、T4RNA連接酶1（T4Rnl1）和T4RNA連接酶2（T4Rnl2）。PIE系統(tǒng)：常用于RNA環(huán)化PIE系統(tǒng)-Ⅰ型內(nèi)含子自剪接、PIE系統(tǒng)-Ⅱ型內(nèi)含子自剪接。宜對circRNA合成的體外轉(zhuǎn)錄、DNA酶處理、RNA環(huán)化等工藝步驟的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化，以提高產(chǎn)率和效率，對關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行確認(rèn)。宜研究與優(yōu)化circRNA合成關(guān)鍵工藝參數(shù)，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應(yīng)的關(guān)鍵工藝參數(shù)，關(guān)鍵工藝參數(shù)如下：體外轉(zhuǎn)錄工藝參數(shù)：RNA聚合酶濃度、NTP濃度、模板濃度、轉(zhuǎn)錄時間、溫度、Mg2+、終止反應(yīng)條件等；DNA酶處理工藝參數(shù)（如有）：DNA酶濃度、處理時間、溫度、終止反應(yīng)條件等；RNA環(huán)化工藝參數(shù)（如有）：IVT產(chǎn)物濃度、溫度、反應(yīng)時間、GTP濃度、Mg2+濃度、連接酶濃度等；如涉及修飾核苷酸，宜明確被修飾的核苷酸、修飾類型、修飾后的純化方法和純度、投料比例等。mRNA合成質(zhì)量控制線性mRNA合成質(zhì)量控制宜建立mRNA合成質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌按照—檢測。總蛋白殘留可參照《中國藥典》通則“0731蛋白質(zhì)含量測定法”，或選用熒光法（詳見附錄D）進(jìn)行檢測。mRNA序列長度可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”、“0542毛細(xì)管電泳法”進(jìn)行檢測。mRNA純度可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0401紫外-可見分光光度法”進(jìn)行檢測。DNA模板殘留量按照《中國藥典》通則“3407外源性DNA殘留量測定法”檢測。mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E），或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測。dsRNA殘留量可參照《中國藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”ELISA法（詳見附錄B）進(jìn)行檢測。金屬元素殘留量按照《中國藥典》通則“0412電感耦合等離子體質(zhì)譜法”檢測。DNase殘留熒光探針法，詳見附錄C。游離單核苷酸（NTPs）殘留量可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”、“0431質(zhì)譜法”進(jìn)行檢測。酶殘留量按照《中國藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”檢測。序列完整性及準(zhǔn)確性（特別是關(guān)鍵元件）可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9109標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則”，或選用mRNAseq法進(jìn)行檢測。有機(jī)溶劑殘留量按照《中國藥典》通則“3200化學(xué)殘留物測定法”檢測。帽子類似物殘留量按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。加帽率可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0431質(zhì)譜法”、“0512高效液相色譜法”進(jìn)行檢測。ploy（A）尾長度可參照《中國藥典》通則“0431質(zhì)譜法”、“0512高效液相色譜法”、“0542毛細(xì)管電泳法”進(jìn)行檢測。表達(dá)成蛋白的能力使用基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗檢測。不完整mRNA按照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測。mRNA聚集體按照《中國藥典》通則“0541電泳法”初步判斷，“0512高效液相色譜法”、“0514分子排阻色譜法”進(jìn)行檢測。生物負(fù)載量按照《中國藥典》通則“1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表3。表3mRNA合成質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值理化性質(zhì)pH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）無色澄明/澄清液體鑒別mRNA序列長度《中國藥典》三部電泳法（通則0541）依據(jù)方案而定序列完整性及準(zhǔn)確性（特別是關(guān)鍵元件）《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（9108）；mRNAseq法與理論序列相符ploy（A）尾長度和均一性《中國藥典》三部質(zhì)譜法（通則0431）、高效液相色譜法（通則0512）依據(jù)方案而定《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）依據(jù)方案而定《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）依據(jù)方案而定含量mRNA含量《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）；RiboGreen熒光檢測法、熒光PCR法、ddPCR法依據(jù)方案而定純度mRNA純度《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）1.8-2.0《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）＞30%加帽率《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）依據(jù)方案而定《中國藥典》四部質(zhì)譜法（通則0431）≥90.0%《中國藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）依據(jù)方案而定效力表達(dá)成蛋白的能力基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗依據(jù)方案而定產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)不完整mRNA《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）≤10%mRNA聚集體《中國藥典》三部電泳法（通則0541）≤10%《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）、分子排阻色譜法（通則0514）依據(jù)方案而定dsRNA殘留《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）；ELISA法＜0.1/％工藝相關(guān)雜質(zhì)DNA模板殘留量《中國藥典》三部外源性DNA殘留量測定法（通則3407）<1.0%總蛋白殘留《中國藥典》三部蛋白質(zhì)含量測定法（通則0731）≤1.0%熒光法-酶殘留量《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）≤5%游離單核苷酸（NTPs）殘留量《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）、質(zhì)譜法（通則0431）≤5%帽子類似物殘留量《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）≤5%有機(jī)溶劑殘留量《中國藥典》三部化學(xué)殘留物測定法（通則3200）-金屬元素殘留量《中國藥典》四部電感耦合等離子體質(zhì)譜法（通則0412）-DNase殘留熒光探針法≤1.25×10-6U/μl安全性無菌《中國藥典》三部無菌檢查法（通則1101）；ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用陰性細(xì)菌內(nèi)毒素《中國藥典》三部凝膠限度試驗法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：光度測定法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定生物負(fù)載量微生物計數(shù)《中國藥典》四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）＜1cfu/10mlcircRNA合成質(zhì)量控制宜建立circRNA合成產(chǎn)物質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌按照—檢測。circRNA序列長度、circRNA純度、總蛋白殘留、DNA模板殘留量、circRNA含量、dsRNA殘留量、金屬元素殘留量、DNase殘留、游離單核苷酸（NTPs）殘留量、酶殘留、序列完整性及準(zhǔn)確性、有機(jī)溶劑殘留量按照.2—.13檢測。preRNA可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測，或使用RT-PCR和特異性引物檢測preRNA的存在，以評估轉(zhuǎn)錄過程中的效率和精確性。內(nèi)含子片段可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測，或采用特異性PCR和電泳技術(shù)檢測是否有未正確剪接的內(nèi)含子片段，以確保RNA的成熟和功能性。nickedRNA可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測，或采用靈敏的電泳分析，識別和定量可能存在的nickedRNA，以評估RNA合成過程中的完整性。RNaseR耐受性可參照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測，或處理樣品后用RNaseR酶處理，通過RT-PCR和電泳確認(rèn)circRNA的耐酶性，以驗證其環(huán)狀結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性。環(huán)化比例可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”，或選用qPCR法進(jìn)行檢測，或通過RT-PCR結(jié)合特異性引物，定量環(huán)化和非環(huán)化RNA的比例，確保產(chǎn)品的一致性。環(huán)化位點可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9109標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則”檢測?；蚰孓D(zhuǎn)錄反應(yīng)后，按照Sanger法檢測?；虿捎肦T-PCR結(jié)合測序技術(shù)定位circRNA的環(huán)化位點，確保環(huán)化的特異性和準(zhǔn)確性。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表4。表4circRNA體外合成質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值理化性質(zhì)pH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）無色澄明/澄清液體鑒別circRNA序列長度《中國藥典》三部電泳法（通則0541）符合預(yù)定設(shè)計序列完整性及準(zhǔn)確性《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（9108）；mRNAseq法與理論序列相符環(huán)化位點《中國藥典》四部標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則（9109）；Sanger法、RT-PCR結(jié)合測序技術(shù)環(huán)化位點需準(zhǔn)確無誤，匹配設(shè)計序列RNaseR耐受性《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；RT-PCR經(jīng)RNaseR處理后，circRNA不應(yīng)有明顯降解含量circRNA含量《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）；熒光PCR法、ddPCR法根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格確定純度circRNA純度《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）、毛細(xì)管電泳法（通則0542）電泳圖譜應(yīng)顯示單一清晰條帶，無雜質(zhì)峰環(huán)化比例《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；qPCR法、RT-PCR結(jié)合特異性引物依據(jù)方案而定產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)preRNA《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；RT-PCR和特異性引物依據(jù)方案而定內(nèi)含子片段《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；特異性PCR不可檢出nickedRNA《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；靈敏的電泳不可檢出dsRNA殘留量《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）；ELISA法依據(jù)方案而定工藝相關(guān)雜質(zhì)DNA模板殘留量《中國藥典》三部外源性DNA殘留量測定法（通則3407）<1.0%總蛋白殘留《中國藥典》三部蛋白質(zhì)含量測定法（通則0731）≤1.0%熒光法-酶殘留量《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）-游離單核苷酸（NTPs）殘留量《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）、質(zhì)譜法（通則0431）-金屬元素殘留量《中國藥典》四部電感耦合等離子體質(zhì)譜法（通則0412）金屬元素殘留量應(yīng)符合國家藥典或相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，具體值根據(jù)使用的化學(xué)試劑和工藝不同而定有機(jī)溶劑殘留量《中國藥典》三部化學(xué)殘留物測定法（通則3200）-DNase殘留熒光探針法≤1.25×10-6U/μl安全性無菌《中國藥典》三部無菌檢查法（通則1101）；ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用陰性細(xì)菌內(nèi)毒素《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法：凝膠限度試驗（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：光度測定法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定mRNA純化線性mRNA純化mRNA純化所用物料宜優(yōu)先采用風(fēng)險級別較低的物料，根據(jù)物料風(fēng)險等級建立相適應(yīng)的控制措施。mRNA純化生產(chǎn)過程宜遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，保證無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測。mRNA的純化工藝單元的設(shè)定需要考慮后續(xù)生產(chǎn)規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。宜對mRNA純化工藝參數(shù)（如層析介質(zhì)的選擇、載量、上樣和洗脫溶液條件、超濾膜截留分子量、流速和跨膜壓等）進(jìn)行研究和優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)定的純化工藝。宜對mRNA純化工藝建立相應(yīng)的過程控制程序，包括純化產(chǎn)物檢測，如mRNA濃度、mRNA完整性、Poly（A）完整性、產(chǎn)品及工藝相關(guān)雜質(zhì)去除率等，確保mRNA的純度和結(jié)構(gòu)完整性。宜明確mRNA純化工藝中各單元操作的目的，進(jìn)行工藝相關(guān)雜質(zhì)清除研究。純化后mRNA原液的保存溶液和分裝規(guī)格應(yīng)與后續(xù)的LNP制備過程相適應(yīng)。并開展儲存穩(wěn)定性研究，制定合理的儲存時長和儲存條件。mRNA原液的標(biāo)簽需標(biāo)明mRNA名稱、貯存條件、批號、規(guī)格、生產(chǎn)日期等信息。circRNA純化circRNA純化所用原材料宜遵循《中國藥典》“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制規(guī)程”要求，并根據(jù)物料風(fēng)險等級建立相適應(yīng)的控制措施。circRNA純化生產(chǎn)過程宜遵循標(biāo)準(zhǔn)的實驗操作規(guī)程和安全規(guī)范，確?？芍貜?fù)性和安全性，保證無外源因子污染和交叉污染。宜采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐筊Nase污染，包括環(huán)境、耗材及原料中的RNase消除和殘留檢測。circRNA純化工藝單元的設(shè)定需考慮后續(xù)生產(chǎn)規(guī)模放大的可行性，宜采用可放大的超濾和層析操作單元。宜明確circRNA純化工藝中各純化步驟的目的，并研究各純化步驟的雜質(zhì)去除率。如采用T4連接酶法制備circRNA，所制的circRNA與前體片段大小相同，宜詳細(xì)說明其純度的評估方式。若采用RNaseR消除前體，宜評估RNaseR對環(huán)的結(jié)構(gòu)或完整性的影響。宜對circRNA純化工藝參數(shù)（如層析介質(zhì)的選擇依據(jù)、載量、雜質(zhì)去除率、上樣和洗脫溶液條件、超濾膜截留分子量、流速和跨膜壓、R酶消化等）進(jìn)行研究和優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)定的純化工藝。宜對circRNA純化工藝建立相應(yīng)的過程控制程序，包括純化產(chǎn)物檢測，如RNA濃度、RNA完整性、環(huán)化接口驗證、circRNA純度、R酶消化、產(chǎn)品及工藝相關(guān)雜質(zhì)去除率等，確保circRNA的純度和結(jié)構(gòu)完整性。circRNA原液成品的溶劑宜與LNP包封過程中的溶劑相同。宜對circRNA原液開展穩(wěn)定性研究，以確定合理的儲存條件和時長。circRNA原液的標(biāo)簽需標(biāo)明circRNA名稱、貯存條件、批號、規(guī)格、生產(chǎn)日期等信息。mRNA原液質(zhì)量控制線性mRNA原液質(zhì)量控制宜建立mRNA原液質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌按照—檢測。mRNA純度、DNA模板殘留量、mRNA含量、dsRNA殘留量按照.4—.7檢測。帽子類似物殘留量、加帽率、poly（A）尾長度、目的蛋白表達(dá)按照.13—.16檢測。mRNA測序可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9109標(biāo)準(zhǔn)核酸序列建立指導(dǎo)原則”，或選用sanger法、高通量測序技術(shù)進(jìn)行檢測。mRNA鑒別按照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測。A260/A230純度按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。NTP殘留（A、G、C、U）按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測?？偟鞍讱埩艨蓞⒄铡吨袊幍洹吠▌t“0731蛋白質(zhì)含量測定法”，或選用熒光法（詳見附錄D）進(jìn)行檢測。mRNA完整性可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”，或選用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。工具酶殘留如T7RNA聚合酶按照《中國藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”檢測。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表5。表5mRNA原液質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值鑒別mRNA測序《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（9108）；Sanger法；高通量測序技術(shù)應(yīng)與理論序列一致mRNA鑒別《中國藥典》三部電泳法（通則0541）應(yīng)與對照品條帶一致含量mRNA含量《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）；RiboGreen熒光檢測法、熒光PCR法、ddPCR法依據(jù)方案而定完整性mRNA完整性《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；瓊脂糖凝膠電泳≥85%純度mRNA純度《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）-《中國藥典》第三毛細(xì)管電泳法（通則0542）≥85%加帽率《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）≥90.0%《中國藥典》四部質(zhì)譜法（通則0431）-《中國藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）-Poly（A）尾長度《中國藥典》三部質(zhì)譜法（通則0431）、高效液相色譜法（通則0512）分布范圍：理論長度±20%《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）-dsRNA殘留量《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）；ELISA法≤0.50%總蛋白殘留《中國藥典》三部蛋白質(zhì)含量測定法（通則0731）≤1.0%熒光法-NTP殘留（A、G、C、U）T7RNA聚合酶殘留量《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）≤0.5μg/mgRNA《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）A、G、C、U均≤0.1%（w/wmRNA）帽子類似物殘留量《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）≤0.1%（w/wmRNA）DNA模板殘留量《中國藥典》三部外源性DNA殘留量測定法（通則3407）≤0.1%（w/wmRNA）無菌《中國藥典》三部無菌檢查法（通則1101）；ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用陰性細(xì)菌內(nèi)毒素《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法：凝膠限度試驗（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：光度測定法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定安全性pH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）無色澄明/澄清液體其他加帽率《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）≥90.0%《中國藥典》四部質(zhì)譜法（通則0431）-質(zhì)量研究目的蛋白表達(dá)《中國藥典》四部高效液相色譜法（通則0512）≥95%基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗-circRNA原液質(zhì)量控制宜建立circRNA原液質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。外觀、PH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌按照—檢測。circRNA純度、DNA模板殘留量、circRNA含量、dsRNA殘留量按照.4—.7檢測。preRNA、內(nèi)含子片段、nickedRNA按照3.3—3.5檢測?？偟鞍讱埩?、工具酶殘留如T7RNA聚合酶、序列完整性按照8—.0檢測。circRNA序列長度按照《中國藥典》通則“0541電泳法”檢測。環(huán)化接口逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，按照Sanger法檢測。環(huán)化效率按照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測。磁珠（如適用）可參照原子吸收光譜法（AAS）或感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）進(jìn)行檢測。有機(jī)溶劑按照《中國藥典》通則“3200化學(xué)殘留物測定法”檢測。circRNA體外翻譯活性使用基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗。RaseR耐受性酶按照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”檢測。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表6。表6circRNA原液質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值理化性質(zhì)pH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）無色澄明/澄清液體鑒別circRNA序列長度《中國藥典》三部電泳法（通則0541）依據(jù)方案而定序列完整性《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；瓊脂糖凝膠電泳依據(jù)方案而定RaseR耐受酶《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）-環(huán)化接口Sanger法-含量circRNA含量《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）；熒光PCR法；ddPCR法依據(jù)方案而定純度circRNA純度《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）、毛細(xì)管電泳法（通則0542）電泳圖譜應(yīng)顯示單一清晰條帶，無雜質(zhì)峰環(huán)化效率《中國藥典》三部毛細(xì)管電泳法（通則0542）-產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)preRNA《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；RT-PCR和特異性引物-內(nèi)含子片段《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；特異性PCR不可檢出nickedRNA《中國藥典》四部毛細(xì)管電泳法（通則0542）；靈敏的電泳不可檢出dsRNA殘留量《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）；ELISA法-工藝相關(guān)雜質(zhì)總蛋白殘留《中國藥典》三部蛋白質(zhì)含量測定法（通則0713）≤1.0%熒光法-工具酶殘留如T7RNA聚合酶《中國藥典》三部免疫化學(xué)法（通則3429）≤0.5μg/mgRNADNA模板殘留量《中國藥典》三部外源性DNA殘留量測定法（3407）<1.0%磁珠（如適用）原子吸收光譜法、感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜法不可檢出有機(jī)溶劑《中國藥典》三部化學(xué)殘留物測定法（通則3200）-活性circRNA體外翻譯活性基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗依據(jù)方案而定安全性無菌《中國藥典》三部無菌檢測法（通則1101）；ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用陰性細(xì)菌內(nèi)毒素《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法：凝膠限度試驗（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定《中國藥典》三部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：光度測定法（通則1143）≤20EU/ml，或依據(jù)方案而定脂質(zhì)納米顆粒Mix配方與mRNA包封/裝載及純化脂質(zhì)納米顆粒Mix配方脂質(zhì)納米顆粒原材料脂質(zhì)納米顆粒原材料的質(zhì)量可能會對終產(chǎn)品RNA（包含mRNA、circRNA、saRNA）-LNP的粒徑與PDI、電荷、包封率、制備及純化工藝、免疫原性及活性產(chǎn)生重要的影響，宜對脂質(zhì)原材料進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)量控制。宜保留LNP各個脂質(zhì)原材料的選擇依據(jù)、來源（動物源、植物源；全合成、半合成等）、生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)純化工藝、特征鑒定、穩(wěn)定性及雜質(zhì)等研究資料。雜質(zhì)研究可考慮在合成或者生產(chǎn)過程中引入的有機(jī)溶劑或者重金屬殘留。多組分及（或）佐劑LNP通常由4個組分組成：可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)（磷脂）、膽固醇和聚乙二醇化脂質(zhì)（PEG脂質(zhì)）；目前國內(nèi)外部分前沿研究中已經(jīng)出現(xiàn)5組分LNP及（或）佐劑的添加。對于多出的組分或佐劑，宜重點說明添加的原理，確保不會影響脂質(zhì)納米顆粒關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)，宜保留多出組分或佐劑的安全性數(shù)據(jù)、提高產(chǎn)品藥效性能或穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)等。同時，鑒于mRNA遞送系統(tǒng)的復(fù)雜性及可能存在的佐劑作用、國內(nèi)外在研mRNA遞送平臺的實際情況，宜參照CDE《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指導(dǎo)要求，不建議添加單獨的佐劑成分。如需添加佐劑，應(yīng)保證添加的佐劑不會引起不可接受的毒性。臨床前須通過明確的功能指標(biāo)及試驗研究證實佐劑發(fā)揮的具體的免疫調(diào)節(jié)作用，同時關(guān)注添加該佐劑成分后可能引入的風(fēng)險，如，對mRNA結(jié)構(gòu)、非預(yù)期免疫反應(yīng)及免疫損傷和免疫病理等，對佐劑添加進(jìn)行全面的藥學(xué)研究。新型原材料的首次使用遵循國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心《新藥用輔料非臨床安全性評價指導(dǎo)原則》，對新型脂質(zhì)材料的作用機(jī)制、合成純化工藝、質(zhì)量控制、供應(yīng)商信息、生產(chǎn)批次、安全性、功效性等進(jìn)行充分研究及闡述。原材料的變更不同生產(chǎn)純化工藝、不同供應(yīng)商提供的脂質(zhì)材料，可能會在純度、雜質(zhì)或其他關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)方面有差異。如脂質(zhì)材料的合成或生產(chǎn)工藝、純化工藝、供應(yīng)商等發(fā)生變更，宜當(dāng)對變更后的新材料進(jìn)行詳盡的質(zhì)量特性研究，確保變更不會對下游工藝及成品產(chǎn)生負(fù)面影響。RNA包封/裝載及純化RNA的包封/裝載主要是基于微流控或類似技術(shù)，將脂質(zhì)混合物的乙醇溶液RNA酸性溶液快速通過微流控混合器來達(dá)到包封的目的。RNA-LNP的純化、換液、濃縮主要采用切向流過濾，以除去游離的脂質(zhì)分子，RNA，乙醇等。不同的包封及純化工藝、緩沖液體系及其它輔助添加劑可能會對RNA-LNP的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)、功效性、免疫原性、穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。宜提交相關(guān)資料，說明包封/裝載及純化工藝步驟的合理性以及工藝參數(shù)控制范圍的合理性?？刹捎妹荛]式的生產(chǎn)工藝，以減少生產(chǎn)過程中的暴露環(huán)節(jié)和儲存環(huán)節(jié)。生產(chǎn)過程中中間產(chǎn)物如需儲存，宜開展穩(wěn)定性研究和相關(guān)驗證研究，明確儲存條件、儲存方式包封設(shè)備及耗材如采用微流控包封設(shè)備來制備RNA-LNP，宜說明包封設(shè)備的混合原理、包封設(shè)備接觸原液的管路的材料種類和性質(zhì)。LNP包封過程中，通常是在乙醇和酸性緩沖液共存的條件下混合制備，如果包封設(shè)備的管路表面為非生物兼容性材料，宜關(guān)注包封設(shè)備管路表面是否被腐蝕破壞，制備產(chǎn)品是否被污染。微流控芯片推薦使用GMP/FDA認(rèn)可的衛(wèi)生級金屬材質(zhì)，如316L。對于使用塑料材料為微流控芯片的LNP包封生產(chǎn)工藝，應(yīng)當(dāng)按照國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南（試行）》相關(guān)要求，基于風(fēng)險評估及必要的相容性研究，確認(rèn)上述塑料芯片組件系統(tǒng)的適用性。對于微流控芯片的質(zhì)量，應(yīng)當(dāng)建立合理的測試方案和指標(biāo)，確認(rèn)不同批次微流控芯片間的質(zhì)量穩(wěn)定性，以及重復(fù)使用芯片每次生產(chǎn)時的芯片質(zhì)量一致性。生產(chǎn)過程中設(shè)備應(yīng)對此相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行連鎖監(jiān)控，以確保設(shè)備在良好的狀態(tài)下穩(wěn)定生產(chǎn)。微流控包封設(shè)備的輸送泵、芯片、閥門、管道管件等部件應(yīng)當(dāng)可以進(jìn)行CIP，以確保所有接觸物料的部分均符合LNP生產(chǎn)的GMP要求。微流控包封設(shè)備的所有部件（包括芯片）應(yīng)當(dāng)能夠滿足高流速制備工藝產(chǎn)生的系統(tǒng)壓力（如≥10MPa的壓力），不宜因承壓不足而限制單個芯片或單組包封系統(tǒng)的混合流速（生產(chǎn)效率）。生產(chǎn)過程中使用的耗材和容器，如一次性儲液袋、移液管路、膜包等，宜具有穩(wěn)定的物理和化學(xué)特性，耗材與直接接觸的溶液、生產(chǎn)中間產(chǎn)物等宜有良好的相容性，需結(jié)合耗材的材質(zhì)、使用階段、供應(yīng)商提供的研究資料等對其評估或研究。包封/裝載工藝參數(shù)包封過程中，關(guān)鍵工藝參數(shù)包括：各個脂質(zhì)原材料的摩爾比例、濃度，RNA的濃度，脂質(zhì)與RNA的投料比例（或氮磷比），緩沖液的鹽離子種類、濃度及pH值的；包封混合過程中的流速、混合壓力、包封前后廢液體積等。采用抗體偶聯(lián)的LNP，宜考慮制劑過程中的參數(shù)與物質(zhì)對抗體活性的影響。純化工藝參數(shù)純化過程中，關(guān)鍵工藝參數(shù)包括：純化替換緩沖液的鹽離子種類、濃度、pH、跨膜壓、流速、中空纖維柱截留分子量、剪切力、除菌過濾等。納米顆粒質(zhì)量控制脂質(zhì)納米顆粒相關(guān)的性能指標(biāo)包括粒徑及分布、電荷、載藥濃度與包封率等，建議結(jié)合納米顆粒的制備工藝以及對下游工序與成品的影響程度，對粒徑及分布、Zeta電位、RNA濃度及包封率、各個脂質(zhì)組分的含量、溶劑殘留等進(jìn)行分析研究，并考慮是否作為生產(chǎn)過程控制的一部分或中間產(chǎn)物建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在選擇質(zhì)量控制方法時，應(yīng)關(guān)注擬表征的質(zhì)量屬性與擬采用的檢測方法之間的契合度，保證方法的適用性。mRNA-LNP制劑處方以及工藝制備工藝整體需求制備工藝需要在符合潔凈要求的生產(chǎn)車間進(jìn)行。宜明確mRNA-LNP制造工藝各單元操作要求，按照經(jīng)過驗證和批準(zhǔn)后的操作規(guī)程的要求進(jìn)行，并有相關(guān)記錄。工藝設(shè)備符合計量、確認(rèn)、驗證等要求。避免出現(xiàn)偏離工藝規(guī)程的偏差，如果出現(xiàn)偏差，宜采取必要措施進(jìn)行糾正。生產(chǎn)前后宜進(jìn)行清場和設(shè)備的清潔，避免產(chǎn)品間的交叉污染。制備工藝：液體制劑：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂質(zhì)包封→超濾濃縮/換液→除菌過濾→DP制劑灌裝；凍干制劑：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂質(zhì)包封→超濾濃縮/換液→除菌過濾→制劑灌裝→凍干→軋蓋。mRNA-LNP脂質(zhì)包封明確脂質(zhì)組分配比，同時做好各LNP脂質(zhì)的質(zhì)量控制工作。包封過程中使用的混合芯片及管路宜使用一次性消耗品，包封設(shè)備在使用前后要進(jìn)行清潔和檢測。mRNA-LNP純化mRNA-LNP的純化宜去除包封工藝過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)乙醇，將其殘留控制在合理的范圍之內(nèi)。mRNA-LNP的純化過程宜建立合理的中間體質(zhì)量控制程序，檢測和控制LNP的粒徑、包封率、mRNA的質(zhì)量參數(shù)等。mRNA-LNP制劑成品分裝mRNA-LNP制劑成品在無菌條件下進(jìn)行分裝，分裝精度、規(guī)格、包材宜經(jīng)過確認(rèn)和驗證。制劑成品分裝宜建立批號管理程序。每批制劑批號唯一，并建立出入庫登記制度。制劑成品宜儲存在經(jīng)驗證和確認(rèn)過的合適的儲存條件及環(huán)境下。circRNA-LNP成品分裝成品制劑需按照《藥品包裝材料與藥物相容性試驗指導(dǎo)原則》《國家藥包材標(biāo)準(zhǔn)》原則開展包材相容性研究。mRNA/cirRNA制劑凍干工藝mRNA/cirRNA制劑在無菌條件下進(jìn)行灌裝，以半壓塞的形式轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)的凍干倉，用已驗證過的凍干工藝對樣本實施凍干處理，其中含水率宜≤3.0%。凍干制劑儲存于經(jīng)驗證和確認(rèn)的儲存條件和環(huán)境下，儲存溫度宜控制在2℃至8℃。mRNA-LNP中間品質(zhì)量控制宜建立mRNA-LNP中間品質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。外觀可參照《中國藥典》通則“0901溶液顏色檢查法”、“0902澄清度檢查法”、“0904可見異物檢查法”進(jìn)行檢測。微生物限度按照《中國藥典》通則“1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”檢測。mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E），或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測。包封率可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9014微粒制劑指導(dǎo)原則”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E）進(jìn)行檢測。粒徑、PDI可參照《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》選取采用動態(tài)光散射法（DLS）（詳見附錄F），或采用顯微成像技術(shù)[如透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）]、納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)（NTA）、小角X射線散射（SAXS）和小角中子散射（SANS）等也可提供納米藥物粒徑大小的信息。其中，SAXS對納米顆粒粒徑的表征方法可參考國際標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會發(fā)布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。Zeta電位可參照《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》選取采用相分析動態(tài)光散射法（PALS）（詳見附錄F），電泳光散射法（ELS）或可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)技術(shù)（TRPS）等。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表7。表7mRNA-LNP中間品質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值理化特性外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）乳白色懸濁液粒徑動態(tài)光散射法、小角X射線散射依據(jù)方案而定PDI動態(tài)光散射法≤0.2Zeta電位相分析動態(tài)光散射法、電泳光散射法依據(jù)方案而定有效性指標(biāo)包封率《中國藥典》四部微粒制劑指導(dǎo)原則（9014）；RiboGreen熒光檢測法≥80%mRNA含量《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）；RiboGreen熒光檢測法、熒光PCR法、ddPCR法依據(jù)方案而定安全性微生物限度《中國藥典》三部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（通則1105）視具體工藝和車間環(huán)境mRNA-LNP成品質(zhì)量控制mRNA-LNP成品質(zhì)量控制宜建立mRNA-LNP成品質(zhì)量控制要求，根據(jù)不同的mRNA-LNP制備工藝及研發(fā)側(cè)重點選取相應(yīng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。外觀、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌按照—檢測。粒徑、PDI、Zeta電位按照.5—.6檢測。平均粒徑可參考《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》選取采用動態(tài)光散射法（DLS），按照GB/T29022粒度分析動態(tài)光散射法獲得平均流體動力學(xué)粒徑?；騾⒖紘H標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會發(fā)布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。mRNA序列可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9108DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則”，或選用sanger法進(jìn)行檢測。mRNA含量可參照《中國藥典》通則“0401紫外-可見分光光度法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E），或選用“熒光PCR法”、“ddPCR法”進(jìn)行檢測。包封率可參照《中國藥典》指導(dǎo)原則“9014微粒制劑指導(dǎo)原則”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”RiboGreen熒光檢測法（詳見附錄E）進(jìn)行檢測。dsRNA殘留量可參照《中國藥典》通則“3429免疫化學(xué)法”，或選用《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”ELSA法（詳見附錄C）進(jìn)行檢測。加帽率可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0431質(zhì)譜法”檢測、“0512高效液相色譜法”進(jìn)行檢測。可見異物按照《中國藥典》通則“0904可見異物檢查法”檢測。不溶性微粒按照《中國藥典》通則“0903不溶性微粒檢查法”檢測。裝量/裝量差異按照《中國藥典》通則“0102注射劑”、“0942最低裝量檢查法”檢測。水分（劑型：凍干粉）按照《中國藥典》通則“0832水分測定法-費休氏法”檢測。滲透壓摩爾濃度按照《中國藥典》通則“0632滲透壓摩爾濃度測定法”檢測。遞送系統(tǒng)組分含量可參照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”，或參考《美國藥典》“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案”使用HPLC-CAD法進(jìn)行檢測。截短序列RNA按照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”檢測。加帽不完全的mRNA可參照《中國藥典》通則“0542毛細(xì)管電泳法”、“0431質(zhì)譜法”進(jìn)行檢測。去磷酸不完全的mRNA按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。修飾過度的mRNA按照《中國藥典》通則“0512高效液相色譜法”檢測。乙醇?xì)埩舭凑铡吨袊幍洹吠▌t“0521氣相色譜法”檢測。異常毒性按照《中國藥典》通則“1141異常毒性檢查法”檢測。蛋白翻譯功能可參照ELISA、FACS、WesternBlot進(jìn)行檢測。質(zhì)量控制指標(biāo)匯總見表8。表8mRNA-LNP成品質(zhì)量控制指標(biāo)匯總表質(zhì)量屬性質(zhì)量控制指標(biāo)推薦檢測方法參考限值鑒別mRNA序列《中國藥典》四部DNA測序技術(shù)指導(dǎo)原則（9108）；Sanger法關(guān)鍵元件與理論序列相符含量mRNA含量《中國藥典》三部紫外-可見分光光度法（通則0401）；RiboGreen熒光檢測法、熒光PCR法、ddPCR法依據(jù)方案而定包封率《中國藥典》四部微粒制劑指導(dǎo)原則（9014）；RiboGreen熒光檢測法≥80%遞送系統(tǒng)組分含量《中國藥典》三部高效液相色譜法（通則0512）；HPLC-CAD法依據(jù)方案而定理化特性平均粒徑動態(tài)光散射法、小角X射線散射依據(jù)方案而定粒徑動態(tài)光散射法、小角X射線散射依據(jù)方案而定PDI動態(tài)光散射法≤0.2Zeta電位相分析動態(tài)光散射法、電泳光散射法依據(jù)方案而定pH《中國藥典》三部pH值測定法（通則0631）依據(jù)方案而定外觀《中國藥典》三部溶液顏色檢查法（通則0901）、澄清度檢查法（通則0902）、可見異物檢查法（通則0904）乳白色懸濁液滲透壓摩爾濃度《中國藥典》三部滲透壓摩爾濃度測定法（通則0632）依據(jù)方案而定可見異物《中國藥典》四部可見異物檢查法（通則0904）符合藥典規(guī)定不溶性微?！吨袊幍洹匪牟坎蝗苄晕⒘z查法（通則0903）符合藥典規(guī)定裝量/裝量差異《中國藥典》四部注射劑（通則0102）-《中國藥典》三部最低裝量檢查法（通則0942）-水分（劑型：凍干粉）《中國藥典》三部水分測定法-費休氏法（通則0832）≤3.0%生物學(xué)活性蛋白翻譯功能ELISA、FACS、WesternBlot視翻譯機(jī)理安全性無菌《中國藥典》三部無菌檢測法（通則1101）；ATP生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計數(shù)、呼吸作用陰性