《水環(huán)境監(jiān)測》課件-學習情景42 總大腸菌群的測定

室內環(huán)境檢測與控制技術專業(yè)資源庫ProfessionalResourceBaseofIndoorEnvironmentalInspectionandControlTechnology總大腸菌群的測定——多管發(fā)酵法一

預備知識總大腸菌群是指那些能37℃48h之內發(fā)酵乳糖產酸產氣的、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽孢桿菌。主要包括有埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等菌屬的細菌。糞便中存在有大量的大腸菌群細菌，在水體中存活的時間和對氯的抵抗力等與腸道致病菌，如沙門氏菌、志賀氏菌等相似，因此將總大腸菌群作為水體受糞便污染的指示菌是合適的。但在某些水質條件下，大腸菌群細菌在水中能自行繁殖，這是不利之處。一

預備知識總大腸菌群的檢驗方法中，多管發(fā)酵法可適用于各種水樣（包括底泥），但操作較繁，需要時間較長；濾膜法主要適用于雜質較少的水樣，操作簡單快速。多管發(fā)酵法是根據大腸菌群細菌能發(fā)酵乳糖、產酸產氣以及革蘭氏染色陰性、無芽孢、呈桿狀等有關特性，通過三個步驟進行檢驗，以求得水樣中的總大腸菌群數。一

預備知識多管發(fā)酵法是以最可能數簡稱MPN來表示試驗結果的。實際上它是根據統計學理論，估計水體中的大腸桿菌密度和衛(wèi)生質量的一種方法。如果從理論上考慮，并且進行大量的重復檢定，可以發(fā)現這種估計有大于實際數字的傾向。不過只要每一稀釋度試管重復數目增加，這種差異便會減少，對于細菌含量的估計值，大部分取決于那些既顯陽性又顯陰性的稀釋度。因此在實驗設計上，水樣檢驗所要求重復的數目，要根據所要求數據的準確度而定。二實訓準備準備事宜名稱方法樣品的采集和保存

水樣采集在經滅菌的玻璃瓶內，要盡快分析，一般不宜超過2h，否則應4℃保存，可保存12h。準備事宜名稱方法實訓試劑水蒸餾水或純水。乳糖蛋白胨培養(yǎng)液成分：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，乳糖5g，氯化鈉5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸餾水1000ml。制法：將蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000ml蒸餾水中，調節(jié)pH為7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混勻，分裝于含有倒置的小玻璃管的試管中，于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。二實訓準備準備事宜名稱方法

實訓試劑

三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述配方比例三倍（除蒸餾水外），配成三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，制法同上。伊紅美藍培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氫二鉀（K2HPO42.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，2%伊紅水溶液20ml，0.5%美藍水溶液13ml。制法：①貯備培養(yǎng)基：先將瓊脂加至900ml蒸餾水中，加熱融化，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使之溶解，再以蒸餾水補足至1000ml，調整pH為7.2~7.4。趁熱用脫脂棉或多層紗布過濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于燒瓶內，置高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min。貯存于冷暗處備用。②平板培養(yǎng)基：將貯備培養(yǎng)基加熱融化。以無菌操作，根據瓶內培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液及0.5%美藍水溶液加入已融化的貯備培養(yǎng)基內，并充分混勻（防止產生氣泡）。當混合好的培養(yǎng)基冷至45℃，便立即適量傾入已滅菌的空平皿內，待其冷卻凝固后，倒置冰箱內備用。二實訓準備三分析步驟生活飲用水飲用水源水和較清潔的地表水嚴重污染的地表水和廢水在二個裝有已滅菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內有倒管），以無菌操作各加入已充分混勻的水樣100ml將水樣作1︰10稀釋于各裝有5ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的五個試管中（內有倒管），各加10ml水樣初發(fā)酵試驗的接種水樣應作1︰10，1︰100，1︰1000或更高的稀釋在10支裝有已滅菌的5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內有倒管），以無菌操作各加入充分混勻的水樣10ml于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的10個試管中（內有倒管），其中5管各加入1ml水樣，另5管各加入1ml1︰10稀釋的水樣于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的15個試管中（內有倒管），其中5管各加入1ml1︰10稀釋的水樣，5管各加入1ml1︰100稀釋的水樣，5管各加入1ml1︰100稀釋的水樣初發(fā)酵試驗三分析步驟各管（瓶）混勻后置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h經初發(fā)酵試驗培養(yǎng)24h后，將產酸產氣及只產酸發(fā)酵試管，分別用接種環(huán)劃線接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上置37℃恒溫箱內培養(yǎng)18~24h挑選符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。①深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；②紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；③淡紫紅色，中心色較深的菌落。平板分離三分析步驟涂片鏡檢菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，挑選該菌落另一部分接種于普通濃度蛋白胨培養(yǎng)液中（內有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落1~3個。置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。有產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在。根據陽性管（瓶）數，按糞大腸菌群的方法報告每升水樣中總大腸菌群數。復發(fā)酵試驗三分析步驟樣品編號接種水量（ml）初發(fā)酵時水樣呈陽性數復發(fā)酵時水樣呈陽性數MPN值（個/100ml）總大腸菌群（個/L）備注

分析人

校對人