生物化學(xué)：第五章酶

第五章

酶enzyme蛋白質(zhì)的一個重要生理功能是在生物體新陳代謝中作為生物催化劑——酶，生物體除了抗體酶和核酸酶以外幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)。生物體新陳代謝過程中所有的生化反應(yīng)都是在酶的作用下進(jìn)行的，沒有酶生物體的新陳代謝無法進(jìn)行，更不能有序地進(jìn)行。一.酶概念的建立1.我國對酶的認(rèn)識：比西方早得多。夏禹時代，周代，春秋戰(zhàn)國時代。2.西方對酶的認(rèn)識：1857年巴斯德認(rèn)為發(fā)酵是酵母細(xì)胞活動的結(jié)果。Liebig提出發(fā)酵是由于細(xì)胞液中的酶引起。1913年Michaelis和Menten提出米氏學(xué)說。3.1878年提出了酶這個名稱。1926年Summer第一次從刀豆中提取了脲酶結(jié)晶。30年代Northrop分離出結(jié)晶的胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，確立了酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)。4.核酸酶和抗體酶。二.酶學(xué)發(fā)展動態(tài)1.目前已經(jīng)鑒定出了3000多種酶，其中不少已得到結(jié)晶。2.人們已經(jīng)弄清了溶菌酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶等酶的結(jié)構(gòu)和作用機理。3.1979年Kakudo弄清了曲霉中的多元淀粉酶的空間結(jié)構(gòu)。4.目前酶學(xué)研究領(lǐng)域1）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新酶，并盡量得到結(jié)晶。2）酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究。3）酶作用機理的研究。4）酶催化反應(yīng)的動力學(xué)研究。5）酶在代謝中的地位及生物合成的遺傳機理。6）酶系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)性質(zhì)。7）酶在細(xì)胞分化過程的作用。8）酶工程研究。9）酶的應(yīng)用開發(fā)研究。三.酶的應(yīng)用1.利用酶工程生產(chǎn)生物制品2.工業(yè)上的應(yīng)用：淀粉酶，蛋白酶，脫脂酶，纖維素酶。3.醫(yī)藥上的應(yīng)用：酶進(jìn)行治療化驗。4.農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：利用酶的抑制劑生產(chǎn)殺蟲劑和除草劑。第一節(jié)

酶學(xué)概論一、

酶的概念及其作用特點1、酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的生物催化劑。生物催化劑：酶(enzyme

核酶(ribozyme)

脫氧核酶(deoxyribozyme)

抗體酶2、

酶與非生物催化劑相比的幾點共性：①催化效率高，用量少（細(xì)胞中含量低）。②加快反應(yīng)速度但不改變化學(xué)反應(yīng)平衡點。③降低反應(yīng)活化能。④反應(yīng)前后自身結(jié)構(gòu)不變。催化劑改變了化學(xué)反應(yīng)的途徑，使反應(yīng)通過一條活化能比原途徑低的途徑進(jìn)行。催化劑的效應(yīng)只反映在動力學(xué)上（反應(yīng)速度），不影響反應(yīng)的熱力學(xué)（化學(xué)平衡）。3.酶催化反應(yīng)的特點即作為生物催化劑的特點（1）、

催化效率更高酶催化反應(yīng)速度是相應(yīng)的無催化反應(yīng)的108-1020倍，并且高出非酶催化反應(yīng)速度至少幾個數(shù)量級?！镛D(zhuǎn)換數(shù)（TN)或催化常數(shù)（Kcat)表示酶的最大催化效率Kcat是一定條件下（[S]》Km）每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)（數(shù)值上Kcat=K3）王鏡巖p322表8-2一些酶的最大轉(zhuǎn)換數(shù)。碳酸酐酶為600000，溶菌酶為0.5（2）.專一性高酶對反應(yīng)的底物和產(chǎn)物都有極高的專一性，幾乎沒有副反應(yīng)發(fā)生。一種酶只作用于一種底物或一類底物。（3）、

反應(yīng)條件溫和常溫、常壓，中性pH環(huán)境。（4）、

活性可調(diào)節(jié)別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價修飾、酶的合成、活化與降解等。從而調(diào)節(jié)新陳代謝有序進(jìn)行。（5）、

酶的催化活性與輔酶、輔基、金屬離子有關(guān)（6）.酶易失活：一般催化劑因中毒而失活，酶容易變性而失活。因而，酶作用一般要求比較溫和的條件。二、

酶的化學(xué)本質(zhì)及其組成（一）

酶的化學(xué)本質(zhì)絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)證據(jù)（1）酸水解的產(chǎn)物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活，（2）具有蛋白質(zhì)的一切共性，凡是能使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶變性；（具有蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)）少數(shù)酶是RNA或DNA（核酶和脫氧核酶）★

ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）（1）80年代初，ThomasCech和SidneyAltman四膜蟲L19RNA具有生物催化功能，催化rRNA前體的剪接

（2）1983年Atman和PaceE.ColiRNaseP中的RNA具有加工tRNA前體的催化功能脫氧核酶(deoxyribozyme)：具有催化功能的DNA。20世紀(jì)90年代中后期發(fā)現(xiàn)?？贵w酶1.定義：利用某種酶底物類似物（半抗原）對動物進(jìn)行免疫，使動物產(chǎn)生相應(yīng)抗體，這種抗體又具有相應(yīng)酶的功能，叫抗體酶。2.舉例：利用酯酶水解產(chǎn)物中的過渡態(tài)物質(zhì)磷酸酯類似物免疫動物，使動物產(chǎn)生單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)這種抗體具有酯酶的活性。這個抗體酶服從米氏動力學(xué)。但Km,Kcat,Kcat÷Km,比真正的酯酶少三個數(shù)量級。但能使酯的水解速度提高1000倍。這個磷酸酯類似物是其競爭性抑制劑。3.應(yīng)用以及意義：用于開發(fā)可切割病毒，腫瘤等具催化活性的抗體酶；開發(fā)天然酶不能催化的反應(yīng)的抗體酶。（二）

酶的化學(xué)組成單純酶類(simpleenzyme)：僅由蛋白質(zhì)組成脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等結(jié)合酶類（conjugatedenzyme):全酶（holoenzyme)=脫輔基酶蛋白（apoenzye)+輔助因子(cofactor)：例如：超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脫氫酶（NAD+）★

酶的輔助因子主要有金屬離子和有機化合物金屬離子：Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn2+、、Mn3+、Mg2+、K+、Na+、Mo6+、Co2+等。有機化合物：NAD，NADP，F(xiàn)AD，生物素，卟啉等輔酶(coenzyme)：與酶蛋白結(jié)合較松，可透析除去。輔基(prostheticgroup)：與酶蛋白共價結(jié)合較緊，不易透析除去。P102表4-1金屬離子作為一些酶的輔助因子P102表4-2基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的輔酶和輔基?！锩傅鞍讻Q定酶專一性，輔助因子的功能是傳遞電子、原子或某些功能基團的作用，決定酶促反應(yīng)的類型和反應(yīng)的性質(zhì)。NAD+構(gòu)成專一性強的乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶的輔基。三、

單體酶、寡聚酶、多酶復(fù)合體、多酶融合體1、

單體酶由一條或多條共價相連的肽鏈組成的酶分子牛胰RNase124aa單鏈雞卵清溶菌酶129aa單鏈胰凝乳蛋白酶三條肽鏈等水解酶。2.寡聚酶：即為寡聚蛋白質(zhì)，由幾個甚至幾十個亞基組成。①含相同亞基的寡聚酶：蘋果酸脫氫酶（鼠肝），2個相同的亞基②含不同亞基的寡聚酶：琥珀酸脫氫酶（牛心），αβ2個亞基寡聚酶中亞基的聚合，有的與酶的專一性有關(guān)，有的與酶活性中心形成有關(guān)，有的與酶的調(diào)節(jié)性能有關(guān)?！锎蠖鄶?shù)寡聚酶是胞內(nèi)酶，而胞外酶一般是單體酶。3、

多酶復(fù)合體1.定義：由兩個或兩個以上的酶，靠非共價鍵結(jié)合而成，其中每一個酶催化一個反應(yīng)，所有反應(yīng)依次進(jìn)行，構(gòu)成一個代謝途徑或代謝途徑的一部分。大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合體由三種酶組成：①丙酮酸脫氫酶（E1）以二聚體存在2×9600②二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰基酶（E2）70000③二氫硫辛酸脫氫酶（E3）以二聚體存在2×56000

12個E1二聚體24×9600024個E2單體24×700006個E3二聚體12×56000總分子量：560萬4、

多酶融合體（多功能酶）★一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶，往往是基因融合的產(chǎn)物。例如：天冬氨酸激酶I---高絲氨酸脫氫酶I融合體（雙功能酶）該酶是四聚體α4，每條肽鏈含兩個活性區(qū)域：N-端區(qū)域是Asp激酶，C端區(qū)域是高Ser脫氫酶

第二節(jié)酶的分類及命名一、

習(xí)慣命名法1.依據(jù)底物來命名（絕大多數(shù)酶）：蛋白酶、淀粉酶2.依據(jù)催化反應(yīng)的性質(zhì)命名：水解酶、轉(zhuǎn)氨酶3結(jié)合上述兩個原則命名：琥珀酸脫氫酶。4.有時加上酶的來源胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶二、

國際系統(tǒng)命名★★基本原則：明確標(biāo)明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)（底物為水時可略去不寫）。酶國際系統(tǒng)命名法舉例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶的系統(tǒng)名稱：丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶★★

國際系統(tǒng)分類法及編號（EC編號）（1）按反應(yīng)性質(zhì)分六大類，用1、2、3、4、5、6表示。（2）根據(jù)底物中被作用的基團或鍵的特點，將每一大類分為若干個亞類，編號用1、2、3。（3）每個亞類又可分為若干個亞一亞類，用編號1、2、3表示。每一個酶的編號由4個數(shù)字組成，中間以“·”隔開。第一個數(shù)字表示大類，第二個數(shù)字表示亞類，第三個表示亞-亞類，第四個數(shù)字表示在亞-亞中的編號。乙醇脫氫酶EC1.1.1.1，乳酸脫氫酶EC1.1.1.27，蘋果酸脫氫酶EC1.1.1.37

第一個數(shù)字表示大類：氧化還原第二個數(shù)字表示反應(yīng)基團：醇基第三個數(shù)字表示電子受體：NAD+或NADP+第四個數(shù)字表示此酶底物：乙醇，乳酸，蘋果酸。三.酶的國際系統(tǒng)分類★分為六類：氧、轉(zhuǎn)、水、裂、異、合1、

氧化還原酶類催化氧化還原反應(yīng)：A·2H+B=A+B·2H

乳酸：NAD+氧化還原酶（EC1.1.1.27），習(xí)慣名：乳酸脫氫酶

2、

轉(zhuǎn)移酶類AB+C=A+BCAla：酮戊二酸氨基移換酶（EC2.6.1.2），

習(xí)慣名：谷丙轉(zhuǎn)氨酶3、

水解酶類催化水解反應(yīng)，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1），習(xí)慣名：Ile氨肽酶。4、

裂合酶類（裂解酶）催化從底物上移去一個基團而形成雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），

習(xí)慣名：醛縮酶5、

異構(gòu)酶催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化6-磷酸Glc異構(gòu)酶6、

合成酶（連接酶）催化一切必須與ATP分解相偶聯(lián)、并由兩種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)。UTP：氨連接酶（CTP合成酶）L-酪氨酸：tRNA連接酶（酪氨酰tRNA合成酶）T4DNA連接酶◆國際分類的盲區(qū)：忽略了酶的物種差異和組織差異SOD：EC1.15.1.1，只有一個名稱和編號2O2-+2H+→H2O2+O2

三類不同的SOD：CuZn-SOD真核生物細(xì)胞質(zhì)中Mn-SOD真核生物線粒體中Fe-SOD同是CuZn-SOD，來自牛紅細(xì)胞與豬紅細(xì)胞的，其一級結(jié)構(gòu)也有很大不同?！镌谟懻撘粋€具體的酶時，應(yīng)對它的來源與名稱一并加以說明。第三節(jié)酶的活力測定與分離純化一、

酶活力與酶促反應(yīng)速度酶活力：在一定條件下，酶催化某一反應(yīng)的反應(yīng)速度即能力（一般測初速度，避免了各種干擾）。用來測定酶量的大小。酶促反應(yīng)速度：單位時間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。單位：濃度/單位時間關(guān)系：酶反應(yīng)速度越快，酶活力越高；反之則越低。

研究酶促反應(yīng)速度，以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)(底物消耗≤5%）。二、

酶的活力單位（U）國際單位（IU單位）：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1umol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個國際單位（IU），1IU=轉(zhuǎn)化1umol底物的酶量/min國際單位（Katal,Kat單位）：在最適反應(yīng)條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱Kat單位實際工作中可以根據(jù)需要自己規(guī)定。最適條件：最適溫度（25℃或37℃）,最適pH、最適緩沖液離子強度、最適底物濃度。底物濃度（1）通常很大，使酶飽和（2）底物消耗≤5%[sucrose]V零級反應(yīng)[enzyme]V一級反應(yīng)但是實際工作中可以根據(jù)需要自己規(guī)定。例如：限制性核酸內(nèi)切酶3種定義：用粘度法測活性：30℃，1分鐘，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量為1個酶單位。轉(zhuǎn)化率法：5分鐘使1ug供體DNA殘留37%的轉(zhuǎn)化活性所需的酶量為1個酶單位。凝膠電泳法測活：37℃，1小時，使1ugλDNA完全水解的酶量為1個酶單位。淀粉酶兩種定義：A：1g可溶性starch，在1h內(nèi)液化所需的enzyme量。B：lml2%可溶性starch，在1h內(nèi)液化所需的enzyme量。1g酶制劑溶于1000mlH2O，取0.5ml與2%的starch20ml反應(yīng)，pH6.0，10分鐘完全液化，求酶活力。A：20×2%×1/0.5×1000×60/10=4800u/克enzyme制劑B：20/0.5×1000×60/10=240000u/克enzyme制劑三.酶的比活力

Specificactivity定義：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。單位：U/mg蛋白質(zhì)。有時也用每克酶制劑或每毫升酶制劑所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的含量與純度的重要指標(biāo)。一個酶的分離純化分為4步。步驟1234總活力（U）6432總蛋白質(zhì)（mg）201052比活力（U/mg）6/204/103/52/2

酶的提純過程中，總蛋白減少，總活力減少，比活力增高。

酶的純化倍數(shù)：

酶的回收率：×100%四、酶活力的測定方法酶促反應(yīng)速度：單位時間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。單位：濃度/單位時間。測量初速度。利用底物或產(chǎn)物的理化性質(zhì)而分別采樣不同的方法，哪個容易就測哪個。具體方法有：分光光度法熒光法同位素法電化學(xué)法化學(xué)滴定法等五.酶的分離純化1.分離純化的方法及操作步驟跟蛋白質(zhì)相似。2.注意事項：1）一般操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行0－5度；2）防止重金屬使酶失活，加入鰲合劑EDTA;3）防止含巰基的酶失活，常加入巰基乙醇；4）常不斷測定酶的比活力即不斷測酶的純度，指導(dǎo)提純工作正確進(jìn)行，直到得到純酶。3.保存：濃縮結(jié)晶的酶在－20度以下保存；不能結(jié)晶的酶采樣以下方法：1）保存濃縮的酶液，用硫酸氨沉淀或反透析濃縮；2）冰凍干燥，制成酶干粉；3）濃縮液加入等體積甘油后，在－20度以下保存。第四節(jié)

酶促反應(yīng)動力學(xué)內(nèi)容：研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶促反應(yīng)速度的各種因素包括底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑與抑制劑等。意義：在酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究以及酶的作用機理的研究中，以及為了解酶在代謝中的作用和酶在某些藥物中的作用機理等，都需要了解掌握酶促反應(yīng)的規(guī)律，因此，酶促反應(yīng)動力學(xué)是酶學(xué)研究中一個既有理論意義又具實踐意義的重要課題。一、化學(xué)動力學(xué)基礎(chǔ)（自學(xué)）二、

底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響（條件：單底物單產(chǎn)物酶促反應(yīng)）（一）

中間復(fù)合物假說與米式方程1903Henrisucrose+H2Oglucose+fructoseacidV[sucrose][enzyme]V[sucrose]Venzymesucrose+H2Oglucose+fructose1、中間產(chǎn)物假說：

酶與底物先絡(luò)合成一個中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物進(jìn)一步分解成產(chǎn)物和游離的酶。一級反應(yīng)：反應(yīng)開始反應(yīng)速度V與底物濃度[S]成正比關(guān)系?；旌霞壏磻?yīng)：隨[S]增高，反應(yīng)速度并不按正比升高。零級反應(yīng)：隨[S]增高，V不再上升，趨向一個極限，趨向Vmax.說明酶可被底物飽和的現(xiàn)象，所有的酶都有此現(xiàn)象。中間產(chǎn)物假說：中間產(chǎn)物假說證據(jù)：（1）競爭性抑制實驗（2）底物保護酶不變性（3）結(jié)晶ES復(fù)合物的獲得?？焖倨胶饧僬f：酶與底物兩者反應(yīng)速度較快，迅速建立平衡。米氏學(xué)說：2、米氏學(xué)說：：1913年Michaelis和Menten提出，建立在以上兩個學(xué)說基礎(chǔ)上建立的V與[S]的定量關(guān)系，建立了米氏方程。Ks為底物解離常數(shù)（底物常數(shù)）（二）

米式方程的導(dǎo)出：1、

早年的米式方程基于快速平衡假說①

在反應(yīng)的初始階段，[S]遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于[E]，因此，[S]可以認(rèn)為不變。②

因為研究的是初速度，P的量很小，由P+E

ES可以忽略不記。③

游離的酶與底物形成ES的速度極快（快速平衡），而ES形成產(chǎn)物的速度極慢，故，[ES]

的動態(tài)平衡與ES

P+E沒有關(guān)系（即K1、K2＞＞K3）ES的生成速度：K1（[E]-[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E]-[ES]）[S]=K2[ES]反應(yīng)速度：KS現(xiàn)在稱為底物常數(shù)2、

“穩(wěn)態(tài)平衡假說”及其對米式方程的發(fā)展：Briggs和Haldane1925[ES]的動態(tài)平衡不僅與E+S

ES有關(guān)，還與ES

P+E有關(guān)。穩(wěn)態(tài)平衡假說的貢獻(xiàn)在于發(fā)展了快速平衡學(xué)說的第③點。所謂“穩(wěn)態(tài)”：ES的形成速度與分解速度相等、ES的濃度保持不變的反應(yīng)狀態(tài)ES生成速度：k1（[E]-[ES]）[S]ES分解速度：k2[ES]+k3[ES]以上兩個速度相等：k1（[E]-[ES]）[S]=k2[ES]+k3[ES]用穩(wěn)態(tài)假說推導(dǎo)米式方程：Vmax=k3[E]（米氏常數(shù)）當(dāng)Km及Vmax已知時，根據(jù)米氏方程可確定酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系。（單體酶）（寡聚酶）當(dāng)[S]《Km時當(dāng)[S]》Km時，即酶被底物飽和時。當(dāng)[S]=Km時（三）

米式方程中各參數(shù)的意義1、

快速平衡假說與穩(wěn)態(tài)平衡假說的實質(zhì)區(qū)別當(dāng)K1、K2》K3時，即ES

P+E是整個反應(yīng)平衡中極慢的一步：

“穩(wěn)態(tài)平衡=快速平衡+慢速平衡”：當(dāng)ES

P+E極慢（K3/K1極?。r，穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡

★都是K3惹的禍2、

Km的物理意義當(dāng)反應(yīng)速度v=1/2Vmax時，Km=[S]，Km的物理意義是：當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時底物的濃度。單位：mol·L-1或mmol·L-1，與底物濃度單位相同。Km是酶的特征常數(shù)之一。一般只與酶的性質(zhì)、底物種類及反應(yīng)條件（如pH值和溫度)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。

P112表4-4一些酶的Km值。3、

Km與天然底物Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物。因為：Km愈?。ㄟ_(dá)到Vmax一半所需的底物濃度愈?。┍硎綱對△[S]

越靈敏。V[S]1/2VmaxKm4、

Km、Ks與底物親和力★Km是ES分解速度（K2+K3）與形成速度（K1）的比值，它包含ES解離趨勢（K2／K1）和產(chǎn)物形成趨勢（K3／K1）?！颣s是底物常數(shù)，只反映ES解離趨勢（底物親和力），1/Ks可以準(zhǔn)確表示酶與底物的親和力大小。1/Ks越大酶與底物的親和力越大，反之越小。★只有當(dāng)K1、

K2》K3時，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物親和力的大小。1/Km越大酶與底物的親和力越大，反之越小?！锏孜镉H和力大不一定反應(yīng)速度大（反應(yīng)速度更多地與產(chǎn)物形成趨勢有關(guān)。即與K3／K1有關(guān)。問題：（1）

Km越小，底物親和力越大（X）（2）

Ks越小，底物親和力越大（√）（3）

天然底物就是親和力最大的底物（X）（4）

天然底物就是Km值最小的底物（√）（5）底物親和力越大酶促反應(yīng)速度越大（X）（6）對于不同的酶或同一種酶的不同底物，Km越小反應(yīng)速度越大（X）5、

Km與米式方程的實際用途（1）根據(jù)[S]求V（2）根據(jù)V（或相對速度a）求[S]設(shè)定達(dá)到最大反應(yīng)速度的0.9倍時，所需底物濃度為[S]0.9[S]0.9=9Km同理有：[S]0.8=4Km[S]0.7=2.33Km[S]0.6=1.5Km[S]0.5=1Km[S]0.1=1/9Km[S]0.9/[S]0.1=81[S]0.7/[S]0.1=21說明：米氏方程只適合一定條件下單底物，只形成一個酶底物復(fù)合物并只產(chǎn)生一個產(chǎn)物的酶促反應(yīng)。但對于形成多個中間物，不只一個底物和不只一個產(chǎn)物的酶以及多酶復(fù)合體則不能解釋。當(dāng)v=Vmax時，表明酶的活性部位已全部被底物占據(jù)，v與[S]無關(guān)，只和[E]成正比。當(dāng)v=1/2Vmax時，表示活性部位有一半被占據(jù)。（3）根據(jù)相對速度推測酶活性中心飽和度Y：（4）根據(jù)Km推測代謝的方向及程度★根據(jù)正逆反應(yīng)Km的差別及細(xì)胞內(nèi)正逆兩相底物的濃度推測酶促反應(yīng)的正逆方向。★根據(jù)代謝途徑中各個酶的Km及其相應(yīng)底物濃度判斷限速步驟（Km最大的步驟不一定是限速步驟）★根據(jù)Km值的大小判斷分支代謝的流向★酶工程與代謝工程中改造酶的Km調(diào)控代謝途徑（強化則降低Km，弱化則提升Km

）6、

Vmax與K3（

Kcat）的意義在一定的酶濃度下，Vmax是一個常數(shù)，它只與底物的種類及反應(yīng)條件有關(guān)。

Vmax=K3[E]K3代表酶被底物飽和時每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)（或催化常數(shù)，Kcat），表明酶的最大催化效率P113表4-5一些酶的最大轉(zhuǎn)換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個酶分子每催化一個底物分子所需的時間。乳糖脫氫酶轉(zhuǎn)換數(shù)為1000/秒，則它的催化周期為10-3秒7、Kcat/Kmrepresentsactualcatalyticefficiencybecause

invivo[S]/Km=0.01-1.0[S]<<Km時：Kcat/Km的上限是K1，既生成ES復(fù)合物的速度(酶促反應(yīng)的速度不會超過ES的形成速度K1，在水相中不會超過108~109）只有Kcat/Km可以客觀地比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率（四）

Km和Vmax的求解方法1、

Lineweaver-Burk

雙倒數(shù)作圖法1/Vmax1/Km1/[S]1/V斜率=Km/Vmax選底物濃度應(yīng)考慮能否得到1/[S]的常數(shù)增量：[S]為1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10時1/[S]為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常數(shù)增量。[S]為常數(shù)增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10時，1/[S]為0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常數(shù)增量，點多集中在1/v軸附近。2、

Eadie-HofsteeV—V/[S]作圖法見p115。3、Hanes-Woolf作圖法見p115。（4）Eisenthal作圖法見王鏡巖p363。（5）Hill作圖法-LogKmLog[S]（寡聚酶）三、

多底物的酶促反應(yīng)動力學(xué)（一）多底物酶促反應(yīng)有

二種動力學(xué)機理1.sequentialreactions（single-displacementreactions):序列反應(yīng)或單－置換反應(yīng)1）Orderedreaction(orderedBiBi)，即有序反應(yīng)2）Randomreactions(randomBiBi)，即隨機反應(yīng)2.Pingpongreactions（double-displacementreactions)，即乒乓反應(yīng)或雙－置換反應(yīng)1、有序反應(yīng)機理（orderedreactions,orderedBiBi)只有Leadingsubstrate(領(lǐng)先底物A)首先與酶結(jié)合，然后B才能與酶結(jié)合，形成的三元復(fù)合物EAB（ternarycomplex)轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，B的產(chǎn)物P先釋放，A的產(chǎn)物Q后釋放?！镌谌鄙貯時，B不能與E結(jié)合E→AE→AEB→QEP→QE→EABPQ★A與其產(chǎn)物Q相互競爭地結(jié)合EPEAAEAEBQEPBQEQ★反應(yīng)的總方向決定于A、Q的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)NAD與NADH相互競爭E上的NAD結(jié)合部位2、

隨機反應(yīng)機理（randomreactions)(randomBiBi)底物A、B與酶結(jié)合的順序是隨機的，形成的三元復(fù)合物AEB→QEP，產(chǎn)物P、Q的釋放順序也是隨機的。

示意圖p119圖4－11（b)★限速步驟是AEB→QEP★A與Q相互競爭E上的底物結(jié)合部位A，B與P相互競爭E上的底物結(jié)合部位B★反應(yīng)的總方向決定于A、B、Q、P的濃度和反應(yīng)的平衡常數(shù)糖原磷酸化酶：糖原與小糖原競爭E上糖原結(jié)合部位，Pi與G-1-Pi競爭E上Pi結(jié)合部位3、乒乓反應(yīng)機理Pingpongreactions（double-displacementreactions)底物A先與E結(jié)合成AE二元復(fù)合物，AE→PE’（修飾酶形式），釋放第一個產(chǎn)物P，接著底物B與E’形成E’B，E’B→EQ，釋放第二個產(chǎn)物Q示意圖p119圖4－11(c)★A與Q競爭自由酶形式E，B與P競爭修飾酶形式E’★整個反應(yīng)歷程中只有二元復(fù)合物形式，沒有三元復(fù)合物形式谷氨酸：草酰乙酸氨基轉(zhuǎn)移酶符合雙置換、雙底物機制的酶★谷氨酸(A)與天冬氨酸(Q)競爭性結(jié)合E-磷酸吡哆醛，a-酮戊二酸(P)與草酰乙酸(B)競爭性結(jié)合E’-磷酸吡哆胺（二）雙底物反應(yīng)的動力學(xué)方程1、乒乓機制的動力學(xué)方程KmA：[B]達(dá)到飽和濃度時A的米氏常數(shù)KmA’：A的表觀米氏常數(shù)Vmax：[A][B]都達(dá)到飽和濃度時的最大反應(yīng)速度乒乓機制的動力學(xué)曲線(見p121圖4－14）★乒乓機制的動力學(xué)曲線是兩組平行直線★表觀米氏常數(shù)KmA’（KmB’）隨[B]（[A]）濃度的增大而增大★表觀最大反應(yīng)速度Vmax’隨[B]（[A]）的增大而增大2、序列機制的底物動力學(xué)方程序列機制的動力學(xué)曲線(見p121圖4－12和圖4－13）★序列機制的動力學(xué)曲線是兩組相交直線（交于X軸負(fù)側(cè)）★交點在X軸：表觀KmA’（KmB’）不隨[[B]（[A]）濃度變化而變化（KmA’=KmA、KmB’=KmB）★交點在X軸上：表觀KmA’（KmB’）隨[[B]（[A]）濃度的增加而減小★交點在X軸下：表觀KmA’（KmB’）隨[[B]（[A]）濃度的增加而增大★表觀最大反應(yīng)速度Vmax’隨[B]（[A]）的增大而增大四、

pH對酶促反應(yīng)速度的影響1.pH影響酶活力的因素①影響酶蛋白構(gòu)象，過酸或過堿會使酶變性。②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。③影響酶和底物分子中另外一些基團解離，這些基團的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構(gòu)象。2．酶的最適pH和穩(wěn)定性pH最適pH：使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時的介質(zhì)pH。

最適pH與底物種類、濃度及緩沖液成分有關(guān)。幾種酶的最適pH，見P117。

★雖然大部分酶的pH—酶活力曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。五、

溫度對酶促反應(yīng)速度的影響。1．最適溫度及影響因素溫度對酶促反應(yīng)速度的影響有兩個方面：①提高溫度，加快反應(yīng)速度。②提高溫度，酶變性失活。最適溫度：在一定溫度下，酶反應(yīng)速度即酶活力最高，此溫度叫酶的最適溫度。溫度—酶活力曲線一般也是鐘形溫度系數(shù)Q10：溫度升高10℃，反應(yīng)速度與原來的反應(yīng)速度之比，大多數(shù)酶的Q10一般為1~2。溫血動物的酶，最適溫度35℃—40℃，植物酶最適溫度40℃—50℃，細(xì)菌TaqDNA聚合酶70℃。最適溫度不是酶的特征常數(shù)，它與底物種類、作用時間、pH、離子強度等因素有關(guān)。2、酶的穩(wěn)定性溫度在某一時間范圍內(nèi)，酶活性不降低的最高溫度稱該酶的穩(wěn)定性溫度。

酶濃度高、不純、有底物、抑制劑和保護劑會使穩(wěn)定性溫度增高。六、

激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。無機離子或簡單有機化合物對酶的激活。無機離子或蛋白酶對酶原的激活。1、

無機離子的激活作用（1）金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+（2）陰離子：cl-、Br-、PO43-（3）氫離子

★不同的離子激活不同的酶?！锊煌x子之間有拮抗作用和可替代作用，如Na+與K+、Mg+與Ca+之間常常拮抗，但Mg+與Zn+常可替代?！?/p>

激活劑的濃度要適中，過高往往有抑制作用，1~50mM2、

簡單有機分子的激活作用①還原劑（如Cys、還原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。②金屬螯合劑（EDTA）能去除酶中重金屬離子，解除抑制作用。3、蛋白酶對酶原的激活七、

抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響變性作用(denaturation)：失活作用：凡使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用。抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或喪失但并不引起酶蛋白變性變性劑沒有選擇性抑制劑：能對酶起抑制作用的物質(zhì)。有不同程度的選擇性研究抑制劑對酶的作用有重大的意義：（1）藥物作用機理和抑制劑型藥物的設(shè)計與開發(fā)（2）了解生物體的代謝途徑，進(jìn)行人為調(diào)控代謝或代謝控制發(fā)酵（3）通過抑制劑試驗研究酶活性中心的構(gòu)象及其化學(xué)功能基團，不僅可以設(shè)計藥物，而且也是酶工程和化學(xué)修飾酶、酶工業(yè)的基礎(chǔ)（一）抑制程度的兩種表示方法★相對活力分?jǐn)?shù)（殘余活力分?jǐn)?shù)★相對活力百分?jǐn)?shù)（殘余活力百分?jǐn)?shù)）2、抑制率★抑制分?jǐn)?shù)★抑制百分?jǐn)?shù)1、相對活力（二）抑制作用的類型1、不可逆的抑制作用：抑制劑與酶活性中心（外）的必需基團共價結(jié)合，使酶的活性下降，無法用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。專一性的不可逆抑制：用來研究酶的專一性即酶活性中心基團性質(zhì)。非專一性的不可逆抑制：用來研究酶蛋白中哪些基團是必需的，以及研究酶的構(gòu)象。2、

可逆的抑制作用抑制劑與酶蛋白非共價鍵結(jié)合，可以用透折、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活。根據(jù)抑制劑與底物的關(guān)系可以分為三種類型。（1）競爭性抑制（Competitiveinhibition）

抑制劑具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，競爭酶的活性中心，并與酶形成可逆的EI復(fù)合物，阻止底物與酶結(jié)合?？梢酝ㄟ^增加底物濃度而解除此種抑制。P結(jié)構(gòu)式丙二酸、戊二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制（2）非競爭性抑制底物和抑制劑可以同時與酶結(jié)合，但是，中間的三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。抑制劑與酶活性中以外的基團結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物無關(guān)。不能通過增加底物的濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用某些重金屬離子對酶的抑制屬于非競爭性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+（3）、

反競爭性抑制酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合。E+S→ES+I→ESI≠P常見于多底物的酶促反應(yīng)中（三）可逆抑制作用與不可逆抑制作用的鑒別1、通過透析、超濾、凝膠過濾等2、通過V-E速度曲線

王鏡巖P370圖9-189-193、通過可逆抑制劑的動力學(xué)曲線可以區(qū)分三種可逆抑制作用（四）可逆抑制作用的動力學(xué)推出三種抑制方程。1、

競爭性抑制：E+S—ES—E+P,E+I—EI相對活力：抑制分?jǐn)?shù)：動力學(xué)方程：（Ki為EI的解離常數(shù)）★抑制程度決定于[I]、[S]、Km和Ki★Vmax不變★Km變大，而且隨[I]濃度的增大而增大交于y軸競爭性抑制作用小結(jié)：（1）

Vmax不變，Km變大。（2）抑制程度決定于[I]、[S]、Km和KiA.抑制程度與[I]成正比，與[S]成反比[I]一定，增加[S]，可減少抑制程度。[S]一定，增加[I]，可增加抑制程度。B.在一定[I]和[S]下，Ki越大，抑制作用越小，Km值愈大，抑制程度愈大。2.非競爭性抑制E+S—ES—E+P,E+I—EI+S—ESI,ES+I—ESI相對活力：抑制分?jǐn)?shù)：

★抑制程度決定于[I]和Ki

，與底物的Km和[S]無關(guān)動力學(xué)方程：交于x軸★Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）非競爭性抑制小結(jié)：（1）Km不變，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）（2）抑制程度決定于[I]和Ki

，與底物的Km和[S]無關(guān)：

抑制程度與[I]成正比在一定[I]

下，Ki越大，抑制作用越小3.反競爭性抑制E+S—ES—E+P,ES+I—ESI相對活力：抑制分?jǐn)?shù)：動力學(xué)方程：★抑制程度決定于Km、Ki、[S]、[I]★Km及Vmax都變小一組平行直線反競爭性抑制小結(jié)：（1）Km及Vmax都變小(2)抑制程度決定于Km、Ki、[S]、[I]抑制程度既與[I]成正比，又與[S]成正比在一定的[S]、[I]下，Ki越大，抑制程度越?。籏m越大，抑制程度越小。P122表4-7小結(jié)：三種可逆抑制作用的酶促反應(yīng)速度V與Km值（五）一些重要的抑制劑1、

不可逆抑制劑：

（1）、

非專一性不可逆抑制劑

與酶的活性中心以及活性中心外的某一類或幾類必需基團反應(yīng)1）、

有機磷的?；锒惐柞７―FP，神經(jīng)毒氣）和許多有機磷農(nóng)藥。Ｐ374結(jié)構(gòu)式：磷?；瘎┡cDFPP374反應(yīng)式：磷酰化劑與膽堿酯酶形成磷?；憠A酯酶抑制機理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂鍵。毒理：強烈抑制乙酰膽堿脂酶（神經(jīng)毒劑）。

解毒劑：PAM（解磷定）可以把酶上的磷?；鶊F除去。2)、有機汞、有機砷化合物抑制機理：使酶的巰基烷化,抑制含巰基的酶。

P：對氯汞苯甲酸（PCMB）與巰基酶的反應(yīng)

毒理：主要與還原型硫辛酸輔酶反應(yīng)，抑制丙酮酸氧化酶系統(tǒng)。解毒劑：二巰基丙醇（BAL）、Cys、GSH等過量的巰基化合物。3)重金屬

Ag、Cu、Hg、Cd、Pb在高濃度時能使大多數(shù)酶變性失活，低濃度時產(chǎn)生抑制作用，EDTA可解除。4)、烷化物含鹵素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、鹵乙酰苯等）常作用于酶中的巰基.氨基.羧基.咪唑基等，鑒定酶中巰基。5)氰化物、硫化物、CO與含鐵卟啉的酶中的Fe2+結(jié)合，阻抑細(xì)胞呼吸。6)青霉素：與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位絲氨酸羥基共價結(jié)合，使酶失活，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。（2）

專一性不可逆抑制劑此類抑制劑僅僅和某一種酶的活性部位的必需基團反應(yīng)。1)、

Ks型不可逆抑制劑（親和標(biāo)記試劑，親合修飾試劑）具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，可與酶活性中性非共價結(jié)合，同時還帶有一個能與酶活性中心外的必需基團進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活潑基團，從而抑制酶的活性。因抑制是通過對酶的親合力來對酶進(jìn)行修飾標(biāo)記的，故稱為親和標(biāo)記試劑。專一性程度取決于它與活性中心非共價結(jié)合的解離常數(shù)及與活性中心外的基團共價結(jié)合的Ks之比。故這類抑制劑稱為Ks型不可逆抑制劑。王鏡巖P376

圖9-25胰蛋白酶的底物及其Ks型不可逆抑制劑胰蛋白酶的最佳底物：對-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯(TLME)Ks型不可逆抑制劑：對一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TLCK）-CH2-cl與酶活性部位外的必須基團一個His-咪唑基距離很近，很易使之烷基化，引起不可逆的失活。2）、

Kcat型不可逆抑制劑（自殺性底物,suicidesubstrate）具有與底物相似的結(jié)構(gòu)，也是酶的底物，不僅能與酶結(jié)合，而且有一個潛伏的反應(yīng)基團（latentreactivegroup）能被酶催化而活化，并與酶活性中心必需基團進(jìn)行不可逆結(jié)合而使酶失活。有人稱他為酶的自殺性底物。

王鏡巖P376圖9-26β-氯代-D-Ala抑制丙氨酸消旋酶的機制。此酶使D-Ala變成L-Ala。舉例1：E.coli.β-羥基癸酰硫酯脫水酶：催化的反應(yīng)：P反應(yīng)式Kcat型不可逆抑制劑：（3，4-葵炔酰-N-乙酰半胱胺）此抑制劑能被酶催化生成連丙二烯結(jié)構(gòu)，連丙二烯易與His咪唑反應(yīng)，使酶失活。

P反應(yīng)式舉例2：炔類化合物是以FMN、FAD為輔基的單胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制劑。單胺氧化酶能氧化某些血管舒張劑（如組胺），引起高血壓。

由于迫降靈是一種單胺氧化酶的自殺性底物，因而能抑制一些血管舒張劑（如組胺）的氧化，降低血壓。

2、

可逆抑制劑

★競爭性抑制劑（Competitiveinhibition）

許多代謝類似物都是競爭性抑制劑，可用作抗菌藥物和抗癌藥物?！锘前奉愃幬锛捌渥饔脵C理:對氨基苯磺酰胺或其衍生物對氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，競爭性抑制細(xì)菌的二氫葉酸合成酶活性;抗菌增效劑TMP是二氫葉酸還原酶的競爭性抑制劑。蝶呤對氨基苯甲酸Glu二氫葉酸合成酶二氫葉酸四氫葉酸嘌呤核苷酸二氫葉酸還原酶一碳單位磺胺類藥物磺胺類藥物的抗菌機理：細(xì)菌不能利用外源葉酸，只能合成。TMP★抗癌藥:氨基葉酸、阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等。★抑制劑與藥物開發(fā)Kcat型不可逆抑制劑的專一性程度很強，前景廣闊底物類似物型的競爭性抑制劑最易開發(fā)過度態(tài)底物類似物型藥物最具價值(高效\特異)

八.酶濃度對酶反應(yīng)速度的影響條件:1.[s]足夠大，使酶飽和，則v與酶濃度成正比。2.酶必須是純酶制劑或抑制劑的粗酶制劑。[enzyme]V一級反應(yīng)九、

有機介質(zhì)中的酶促反應(yīng)傳統(tǒng)觀點：酶是水溶性生物大分子，只能在水介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)，有機介質(zhì)會使酶變性。其實在細(xì)胞中，許多生物膜上的酶就是在低極性的微環(huán)境中發(fā)揮催化功能的。優(yōu)點：①利于疏水性底物的反應(yīng)。②可提高酶的熱穩(wěn)定性，提高催化溫度。③能催化在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)。④可改變反應(yīng)平衡移動方向。⑤可控制底物專一性。⑥防止由水引起的副反應(yīng)。⑦可擴大pH值的適應(yīng)性等等。1、

有機介質(zhì)中酶促反應(yīng)的條件（1）、

必需水（結(jié)合水、束縛水）：脂肪酶：幾個水分子/每個酶分子胰凝乳蛋白酶：50個水分子/每個酶分子乙醇脫氫酶：幾百個水分子/每個酶分子可把有機介質(zhì)中酶促反應(yīng)理解為宏觀上是在有機介質(zhì)中，而在微觀上仍是水中的酶促反應(yīng)。（2）、對酶的要求：具有對抗有機介質(zhì)變性的能力。（3）、合適的溶劑及反應(yīng)體系（4）、合適的pH2、

有機介質(zhì)對酶性質(zhì)的影響（1）、穩(wěn)定性a.熱穩(wěn)定性提高豬胰脂肪酶在醇和酯中進(jìn)行催化反應(yīng)，在100℃半衰期長達(dá)12h，其活性比25℃時還高幾倍b.儲存穩(wěn)定性提高胰凝乳蛋白酶在20℃時，在水中半衰期只幾天。在辛烷中，可放6個月，仍保持全部活性。（2）、活性升高活性降低活性酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。（3）、專一性脂肪酶在有機介質(zhì)中有合成肽鍵的功能。（4）、反應(yīng)平衡有機介質(zhì)能改變某些酶催化的反應(yīng)平衡。例如：水解酶類（蛋白水解酶）在水介質(zhì)中，水的濃度為55.5mol/L，平衡趨向水解方向，在含水量極低的有機介質(zhì)中，平衡向合成方向偏移。（酶）合成產(chǎn)物溶劑合成收率枯草桿菌蛋白酶核糖核酸酶甘油90%50%無色桿菌蛋白酶胰島素乙醇30%80%

凝血酶人生長素甘油80%20%（5）、分子印跡和pH記憶酶在凍干前可用配體作印跡。競爭性抑制劑，可誘導(dǎo)酶活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，而此種構(gòu)象在除去抑制劑后，因酶在有機介質(zhì)中的高度剛性而得到保持。pH記憶：酶在有機介質(zhì)中能“記住”它最后存在過的水溶液的pH值，因該pH值決定了酶分子上有關(guān)基團的解離狀態(tài)，這種狀態(tài)在凍干過程和分散到有機介質(zhì)中之后仍得到保持。第五節(jié)

酶的作用機理一

酶的活性中心1、活性中心的概念：活性中心：酶分子中結(jié)合底物并起催化作用的少數(shù)氨基酸殘基，包括底物結(jié)合部位、催化部位。頻率最高的活性中心的氨基酸殘基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。

不需要輔酶的酶：活性中心是酶分子在三維結(jié)構(gòu)上比較靠近的少數(shù)幾個氨基酸殘基或是這些殘基的某些基團。需要輔酶的酶：輔酶分子或輔酶分子的某一部分結(jié)構(gòu)往往就是活性中心的組成部分。2、

活性中心的結(jié)構(gòu)特點：

接觸殘基：R1、R2、R6、R8、R9、R163輔助殘基：R3、R4、R5、R164、R165結(jié)構(gòu)殘基：R10、R162、R169非貢獻(xiàn)殘基：其它酶蛋白必需殘基非必需殘基活性中心活性中心外接觸殘基輔助殘基結(jié)構(gòu)殘基結(jié)合殘基催化基團（1）接觸殘基：結(jié)合基團，催化基團。（2）輔助殘基：不與底物接觸，輔助酶與底物結(jié)合，協(xié)助接觸殘基上述兩類基團構(gòu)成酶活性中心。（3）結(jié)構(gòu)殘基維持酶分子三維構(gòu)象，與酶活性相關(guān)，但不在酶活性中心范圍內(nèi)，屬于酶活性中心以外的必需殘基。上述三類殘基統(tǒng)稱酶的必需基團（4）非貢獻(xiàn)殘基（非必需基團）可能在免疫，酶活性調(diào)節(jié)，運輸轉(zhuǎn)移，防止降解等方面起作用。3、研究活性中心的方法（1）通過酶的專一性（2）酶的化學(xué)修飾法（3）親合標(biāo)記法（4）X射線晶體衍射法（5）分子生物學(xué)的方法4、活性中心的一級結(jié)構(gòu)與分子進(jìn)化一些酶的活性中心一級結(jié)構(gòu)與催化機理相似，可把它們歸為一族。蛋白水解酶：（1）絲氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等）（2）鋅蛋白酶家族（羧肽酶等）（3）巰基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等）（4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等）絲氨酸蛋白酶族活性中心：胰蛋白酶（牛）Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys胰凝乳蛋白酶（牛）Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn彈性蛋白酶（豬）Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn凝血酶（牛）…Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro這4個源于哺乳動物的酶活性中心，都含有一個包括Ser在內(nèi)的完全相同的六肽：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Prou

同源的趨異進(jìn)化來自胰臟的胰蛋白酶（Lys、Arg）、胰凝乳蛋白酶（Phe、Tyr、Trp、）和彈性蛋白酶（疏水殘基），活性中心Ser附近的aa順序相同，且分子一級結(jié)構(gòu)中有40%aa順序相同，三維結(jié)構(gòu)也相似，表明它們起源于共同的祖先，但是它們的底物專一性不同，這叫同源的趨異進(jìn)化?！飦碓从诠餐嫦?，經(jīng)基因突變而得出不同專一性的結(jié)果稱為同源的趨異進(jìn)化。

u

異源的趨同進(jìn)化絲氨酸蛋白酶族活性中心：枯草桿菌蛋白酶：-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser

胰臟的胰凝乳蛋白酶等：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro電荷中繼網(wǎng)：枯草桿菌蛋白酶：Asp32-His64-Ser221胰凝乳蛋白酶：Asp102-His57-Ser195★枯草桿菌蛋白酶與胰凝乳蛋白酶等來源不同，功能特征相同，稱異源的趨同進(jìn)化。二、

專一性的機理（一）

酶專一性類型1、

結(jié)構(gòu)專一性（1）、相對專一性★鍵專一性（如酯酶，對底物結(jié)構(gòu)要求最低）★基團專一性GroupSpecificity不僅對鍵有要求，還對鍵一端的基團有要求，但對另一端基團要求不嚴(yán)格。α—D—Glc苷酶，水解蔗糖和麥芽糖。（2）、

絕對專一性只能作用于一個底物，或只催化一個反應(yīng)。麥芽糖酶只作用于麥芽糖，脲酶只催化尿素水解。2、

立體異構(gòu)專一性（1）、

旋光異構(gòu)專一性：如L-氨基酸氧化酶。（2）、

幾何異構(gòu)專一性反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成蘋果酸

立體化學(xué)專一性還表現(xiàn)在酶能區(qū)分從有機化學(xué)觀點看屬于對稱分子中的兩個等同的基團，并只催化其中一個，而對另一個無作用。a.

甘油激酶只催化甘油中的一個CH2OH磷酸化。b.

順-烏頭酸酶只作用于檸檬酸的兩個-CH2COOH中的一個。立體專一性在實踐中的應(yīng)用：藥物的不對稱合成或不對稱拆分。用乙?；钢苽銵—氨基酸（二）

酶作用專一性的解釋1、鎖鑰模型(lock-keyhypothesis)Fisher1894酶活性中心的形狀與底物分子形狀互補。底物分子或其一部分像鑰匙一樣，專一地插入酶活性中心，通過多個結(jié)合位點的結(jié)合，形成酶—底物復(fù)合物。酶活性中心的催化基團正好對準(zhǔn)底物的有關(guān)敏感鍵，進(jìn)行催化反應(yīng)。

王鏡巖p334圖8-5鎖鑰模型較好地解釋了立體異構(gòu)專一性。但不能解釋可逆反應(yīng)。2、

誘導(dǎo)楔合模型(induced-fithypothesis)Koshland1958酶分子與底物分子接近時，酶蛋白質(zhì)受底物分子誘導(dǎo)，構(gòu)象發(fā)生有利于與底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補楔合，進(jìn)行反應(yīng)。三、

酶催化高效性的機理

1、鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)鄰近效應(yīng)：酶與底物形成中間復(fù)合物后使底物之間、酶的催化基團與底物之間相互靠近，提高了反應(yīng)基團的有效濃度。定向效應(yīng)：由于酶的構(gòu)象作用，底物的反應(yīng)基團之間、酶與底物的反應(yīng)基團之間正確取向的效應(yīng)酶把底物分子從溶液中富集出來，使它們固定在活性中心附近，反應(yīng)基團相互鄰近，同時使反應(yīng)基團的分子軌道以正確方位相互交疊，反應(yīng)易于發(fā)生。鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)對反應(yīng)速度的影響：是主要因素，可使酶反應(yīng)速度提高10的8次方倍。①使底物濃度在活性中心附近很高

②酶對底物分子的電子軌道具有導(dǎo)向作用

③酶使分子間反應(yīng)轉(zhuǎn)變成分子內(nèi)反應(yīng)④鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)對底物起固定作用

2、底物形變和誘導(dǎo)契合的催化效應(yīng)酶中某些基團可使底物分子的敏感鍵中某些基團的電子云密度變化，產(chǎn)生電子張力，降低了底物的活化能。①酶從低活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚孕问?，利于催化。②底物形變，利于形成ES復(fù)合物。③底物構(gòu)象變化，過度態(tài)結(jié)構(gòu)，大大降低活化能。3、

酸堿催化酶分子的一些功能基團起瞬時質(zhì)子供體或質(zhì)子受體的作用。

Specificacid-basecatalysis:即H+,OH-的催化。Generalacid-basecatalysis王鏡巖p391表10－4酶分子中可作為廣義酸堿的功能基團。Glu,Asp;Lys,Arg;Tyr;Cys;His等氨基酸殘基。

影響酸堿催化反應(yīng)速度的兩個因素⑴酸堿強度(pK值）。組氨酸咪唑基的解離常數(shù)為6，在pH6附近給出質(zhì)子和結(jié)合質(zhì)子能力相同，是最活潑的催化基團。⑵給出質(zhì)子或結(jié)合質(zhì)子的速度。咪唑基最快，半壽期小于10-10秒4、

共價催化酶作為親核基團或親電基團，與底物形成一個反應(yīng)活性很高的共價中間物，這個中間物很易變成過渡態(tài)，因此反應(yīng)的活化能大大降低，底物可以越過較低的能域而形成產(chǎn)物，從而提高反應(yīng)速度。王鏡巖p392表10-5形成共價ES復(fù)合物的某些酶親核基團：能提供自由電子的基團。如酶中的Ser-OH，Cys-SH，His-N：親電基團：能接受電子的基團。如底物磷酰基（-P=O），?；?C=O），糖基（Glu-C-OH）；酶中的Tyr,Lys。酶中的親核基團和親電基團分別與底物中的親電基團和親核基團作用形成共價中間物，提高反應(yīng)速度。因此，Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys常是酶的活性中性氨基酸殘基。

5、活性中心金屬離子的催化作用金屬酶（metalloenzyme):含緊密結(jié)合的金屬離子Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+，金屬-激活酶（metal-activatedenzyme):含松散結(jié)合的金屬離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+

金屬離子主要以三種方式參與催化過程：（1）通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向（2）通過自身價數(shù)的改變參加氧化還原反應(yīng)（3）屏蔽底物或酶活性中心的負(fù)電荷或靜電穩(wěn)定。6、

活性中心的微環(huán)境⑴疏水環(huán)境介電常數(shù)低，加強極性基團間的作用。⑵電荷環(huán)境在酶活性中心附近，往往有一電荷離子，可穩(wěn)定過渡態(tài)的離子四、

某些酶的活性中心及其作用機理（一）、

絲氨酸蛋白酶的作用機理：胰蛋白酶(trypsin)胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin)彈性蛋白酶（elastase)凝血酶（thrombin)枯草桿菌蛋白酶（subtilisin)纖溶酶（plasmin)乙酰膽堿酯酶（acytalcholinesterase)1、絲氨酸蛋白酶家族的底物專一性即結(jié)構(gòu)特點1）絲氨酸蛋白酶家族具有類似的Ser

-His-Asp催化三聯(lián)體（電荷中繼網(wǎng)）。王鏡巖p407圖10-34胰凝乳蛋白酶的催化三聯(lián)體電荷中繼網(wǎng)：Ser195—His57—Asp102氫鍵體系,Ser的羥基與His的咪唑基以及Asp的羧基與His的咪唑基形成氫健。通過電荷中繼網(wǎng)進(jìn)行酸堿催化及共價催化。但它們活性中心的底物結(jié)合部位不同，底物專一性也不同。2）絲氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋內(nèi)的微環(huán)境（疏水性、電荷性質(zhì)）決定了絲氨酸蛋白酶的底物專一性王鏡巖p408圖10-35和教材p144圖4－35胰臟中的三種蛋白酶的底物結(jié)合部位胰凝乳蛋白酶：口袋較大，主要由疏水氨基酸殘基圍成，開口較大（由兩個Gly組成），底部為絲氨酸，因此需要底物有一個疏水基團（芳香環(huán)Phe、Tyr、Trp及大的非極性側(cè)鏈）定位。裂解芳香族氨基酸羧基側(cè)的肽鍵胰蛋白酶：

口袋較大，上部為兩個甘氨酸，底部有Asp，利于Lys.、Arg結(jié)合，裂解堿性氨基酸殘基羧基側(cè)的肽鍵彈性蛋白酶：

口袋較淺，開口較小（由Val，Thr組成），底部為絲氨酸只能讓Ala等小分子進(jìn)入，裂解小的中性氨基酸殘基羧基側(cè)的肽鍵2、胰凝乳蛋白酶的動力學(xué)研究圖10-36研究胰凝乳蛋白酶作用機制的人工底物圖10-37胰凝乳蛋白酶的動力學(xué)曲線（1）（乙）?；A段：（2）脫（乙）酰化階段圖10-383、胰凝乳蛋白酶的催化機制1）絲氨酸蛋白酶家族具有類似的Ser

-His-Asp催化三聯(lián)體（電荷中繼網(wǎng)）。王鏡巖p407圖10-34胰凝乳蛋白酶的催化三聯(lián)體電荷中繼網(wǎng)：Ser195—His57—Asp102氫鍵體系。通過電荷中繼網(wǎng)進(jìn)行酸堿催化及共價催化。王鏡巖p407圖10-40在胰凝乳蛋白酶中催化三聯(lián)體的作用沒有底物時，Ser195—His57—Asp102形成一個氫鍵體系，His57是去質(zhì)子化狀態(tài)，Asp102的COO-通過氫鍵定位并固定His57。結(jié)合底物時：His57從Ser195接受一個質(zhì)子，增加了Ser195羥基氧原子對底物的親核攻擊性，Asp102的COO-穩(wěn)定過度態(tài)中His57的正電荷形式。2）

王鏡巖p410

圖10-42和教材p145圖4－36胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機制

第一階段：?；疭er195---OH中的氧攻擊肽鍵的羰基碳（共價催化），酶的His57咪唑H+與底物中的-NH形成氫鍵（酸堿催化），形成四聯(lián)體過渡態(tài)（Ser195—O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+

），肽鍵斷裂，氨基產(chǎn)物釋放，底物的羧基部分酯化到Ser195的羥基上。第二階段：脫酰電荷中繼網(wǎng)從水中吸收一個質(zhì)子，結(jié)果產(chǎn)生的OH-攻擊連在Ser195上底物的羰基C原子，形成四聯(lián)體過渡態(tài)，然后His57供出一個質(zhì)子給Ser195上的氧原子，底物中的酸成分從Ser195上釋放。（二）溶菌酶的作用機制（三）天冬氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特點與作用機制第六節(jié)

多酶體系與酶活性的調(diào)節(jié)控制一、

多酶體系及其分類多酶體系：在完整細(xì)胞內(nèi)的某一代謝途徑中，由幾個酶連在一起形成的反應(yīng)鏈體系?？扇苄缘亩嗝阁w系（分散性的）：每個酶單獨存在，彼此之間沒有結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。如細(xì)胞基質(zhì)中的糖酵解。結(jié)構(gòu)化的多酶體系（多酶復(fù)合體）：各個酶非共價地結(jié)合在一起形成一定的結(jié)構(gòu)形成多酶復(fù)合體。如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，脂肪酸合成酶復(fù)合體。定位在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的多酶體系（結(jié)構(gòu)化程度更高）：一般定位在細(xì)胞器的上，如呼吸鏈和光合鏈。

★

多酶體系具有自我調(diào)節(jié)能力（1）第一步反應(yīng)往往是限速步驟，控制著全部反應(yīng)序列的總速度。（2）反饋抑制與底物激活催化第一步反應(yīng)的酶，大多都是別構(gòu)酶，能被全部反應(yīng)序列的最終產(chǎn)物所抑制，有的則是反應(yīng)序列分叉處的酶或第一步的反應(yīng)受到最終產(chǎn)物的抑制，稱為反饋抑制；有的被底物激活；

二、

酶活性的調(diào)節(jié)控制和調(diào)節(jié)酶酶活性的調(diào)節(jié)有兩種情況：1調(diào)節(jié)酶濃度：酶的誘導(dǎo)與阻遏2調(diào)節(jié)酶活性：反饋抑制、抑制劑與激活劑的調(diào)節(jié)、別構(gòu)調(diào)節(jié)、可逆的共價修飾、酶原激活、同工酶形式的調(diào)節(jié)、激素及特異調(diào)控蛋白對酶活性的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)酶：活性可被調(diào)節(jié)的酶，主要是別構(gòu)酶和共價修飾酶。（一）別構(gòu)酶活性的別構(gòu)調(diào)控1、

別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特點和性質(zhì)（1）

已知的別構(gòu)酶都是寡聚酶，通過次級鍵結(jié)合（2）具有活性中心和別構(gòu)中心（調(diào)節(jié)中心），活性中心和別構(gòu)中心處在不同的亞基上或同一亞基的不同部位上。（3）多數(shù)別構(gòu)酶不止一個活性中心，活性中心間有同位效應(yīng)，底物就是調(diào)節(jié)物：有的別構(gòu)酶不止一個別構(gòu)中心，可以接受不同的代謝物的調(diào)節(jié)。（4）不遵循米式方程，動力學(xué)曲線是S型（正協(xié)同效應(yīng)）或表觀雙曲線（負(fù)協(xié)同效應(yīng)）。2.別構(gòu)效應(yīng)（或變構(gòu)效應(yīng)）：調(diào)節(jié)物（效應(yīng)物）與別構(gòu)酶分子中的別構(gòu)中心（調(diào)節(jié)中心）非共價結(jié)合后，誘導(dǎo)出或穩(wěn)定了酶分子的某種構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)酶活性中心對底物的結(jié)合與催化作用受到影響即酶活性受到影響，從而調(diào)節(jié)美的反應(yīng)速度及代謝過程，此種效應(yīng)稱為酶的別構(gòu)效應(yīng)。

3.調(diào)節(jié)物1）負(fù)調(diào)節(jié)物：當(dāng)調(diào)節(jié)物同別構(gòu)部位結(jié)合后，能降低或關(guān)閉別構(gòu)酶酶的催化活性，這種調(diào)節(jié)物叫負(fù)調(diào)節(jié)物或負(fù)效應(yīng)物。它常常是一個代謝途徑的末端產(chǎn)物，是底物以外的分子。2）正調(diào)節(jié)物：有的別構(gòu)酶可被它的專一性調(diào)節(jié)物激活，這樣的調(diào)節(jié)物稱為正調(diào)節(jié)物或正效應(yīng)物。常是酶的底物或其它分子。同位效應(yīng)或同促效應(yīng)：別構(gòu)酶受底物調(diào)節(jié)的效應(yīng)。異位效應(yīng)：別構(gòu)酶受底物以外的分子調(diào)節(jié)的效應(yīng)。有抑制和激活兩種情況。3、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶—正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶（aspartatetranscarbamylase,ATCase）ATCase催化的反應(yīng)底物氨甲酰磷酸和天冬氨酸的結(jié)合是正協(xié)同的即具同位效應(yīng)。圖10-46ATCase的別構(gòu)效應(yīng)CTP終產(chǎn)物反饋抑制：降低酶與底物的親和力，即具異位效應(yīng)，不改變Vmax，ATP激活：增加酶與底物的親和力，