蘋果果皮中總黃酮的提取方法優(yōu)化研究

蘋果果皮中總黃酮的提取方法優(yōu)化研究摘要：我們以控制變量的方法，以蘋果果皮總黃酮得率為考察指標(biāo)，對(duì)影響蘋果皮總黃酮提取方法的因素進(jìn)行了探討，通過從蘋果皮中提取出來的黃酮的吸光度描繪出的曲線判斷其含量得出了蘋果皮總黃酮提取的優(yōu)化條件，從而找出它的優(yōu)化方法并測(cè)定了蘋果果皮中總黃酮的含量。結(jié)果表明，蘋果果皮總黃酮提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：水浴溫度為65℃，乙醇濃度為65%，提取時(shí)間為2h，pH=10，總黃酮得率為1.272%。關(guān)鍵詞：蘋果、總黃酮、提取方法前言黃酮類（英語：Flavones）是一類基于2-苯基色圓酮-4-酮（2-苯基-1-苯并吡喃-4-酮）骨架的黃酮類化合物。果中的重要抗氧化物質(zhì)來源。蘋果皮的營(yíng)養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值：黃酮化合物是廣泛存在水果和蔬菜中的一類次生代謝類物質(zhì)，近來發(fā)現(xiàn)它們具有很強(qiáng)的清除自由基能力，是蘋蘋果皮中含有很多生物活性物質(zhì)，例如：酚類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)，以及二十八烷醇等，這些活性物質(zhì)可以抑制引起血壓升高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，有助于預(yù)防慢性疾病，如心血管疾病、冠心病，降低其發(fā)病率。

此外，蘋果皮的攝入可以降低肺癌的發(fā)病率。國(guó)外研究表明，蘋果皮較果肉具有更強(qiáng)的抗氧化性，蘋果皮的抗氧化作用較其它水果蔬菜都高。普通大小蘋果的果皮抗氧化能力相當(dāng)于800mg維生素C的抗氧化能力。

蘋果皮中的二十八烷醇還具有抗疲勞和增強(qiáng)體力的功效。蘋果皮可以抑制齒垢的酶活性及口腔內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)，具有抗蝕作用，可以保護(hù)牙齒。還可以使皮膚白嫩，防止黑色素的生成，有美容功效。

蘋果皮含豐富的膳食纖維，能幫助消化。蘋果中將近一半的維生素C也在緊貼果皮的部位。蘋果皮比果肉抗氧化性更強(qiáng)。

目前已經(jīng)有很多廠家通過從蘋果皮中提取生物活性物質(zhì)來開發(fā)功能食品。蘋果皮粉作為一種很有價(jià)值的食品添加劑，可以用其生產(chǎn)強(qiáng)化食品，少量地添加蘋果皮粉就能夠增加食品中的多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)的含量。

1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理，加深掌握和熟悉了分光光度計(jì)的原理和使用操作。（2）了解了黃銅的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，學(xué)會(huì)了如何鑒定黃酮類化合物和學(xué)習(xí)植物中黃酮化合物的提取的一般方法，同時(shí)也了解了黃酮類化合物的藥性功效。（3）掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定原料藥含量的方法及鍛煉自己的實(shí)驗(yàn)操作技能。2材料的選擇研究表明，蘋果果實(shí)中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，主要集中在果皮部分，果肉和果心中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于果皮的黃酮含量。但是由于農(nóng)藥的殘留、空氣污染等諸多不利因素，人們?cè)谑秤锰O果時(shí)多將果皮棄去，卻沒有認(rèn)識(shí)到在去除果皮的同時(shí)卻丟棄了蘋果最有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的部分。而且，黃酮化合物是廣泛存在于水果和蔬菜中的一類次生代謝類物質(zhì),近來研究發(fā)現(xiàn),它們具有很強(qiáng)的清除自由基能力,是蘋果中的重要抗氧化物質(zhì)來源。蘋果果實(shí)中含有豐富的黃酮類物質(zhì),且主要集中在果皮部分,果肉和果心中的黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于果皮，蘋果皮中的總多酚含量達(dá)307mg/100g，總黃酮為184mg/100g，原花青素為105mg/100g，這些數(shù)據(jù)是果肉所望塵莫及的。所以在本次實(shí)驗(yàn)中我們挑選皮果皮來做實(shí)驗(yàn)原料。若存在一種科學(xué)有效的提取方法將蘋果皮中的總黃酮等抗氧化物質(zhì)提取分離，加以充分利用，為食品加工業(yè)、化妝品工業(yè)以及醫(yī)藥業(yè)提供天然抗氧化劑資源，將為蘋果的加工業(yè)開辟新的出路。目前提取分離蘋果中黃酮類物質(zhì)還沒有一個(gè)完善的方法，本研究旨在找到一個(gè)蘋果果皮中總黃酮提取的最佳方法，為蘋果的營(yíng)養(yǎng)鑒定提供一個(gè)確切的黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，并為蘋果的開發(fā)利用提供一個(gè)科學(xué)有效的理論依據(jù)。3實(shí)驗(yàn)原理3.1結(jié)構(gòu)黃酮類化合物(Flavonoids)，又稱物黃酮(Bioflavonoids)或植物黃酮。黃酮類化合物泛指擁有15個(gè)碳原子的多元酚化合物，其中兩個(gè)芳環(huán)(A環(huán)、B環(huán))之間以一個(gè)三碳鏈相連，其骨架可用C6-C3-C6表示[1]?；窘Y(jié)構(gòu)如圖1-1。

A

B

圖1-1

黃酮（A）和異黃酮（B）的分子結(jié)構(gòu)

根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、B環(huán)連接的位置（2-位或3-位）以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)等特點(diǎn)，可將黃酮類化合物進(jìn)行不同分類。

3.2性質(zhì)

游離的黃酮類化合物一般難溶或不溶于水，可溶于乙醇、乙酸乙脂、甲醇、乙醚等有機(jī)溶劑或稀堿中。其中黃酮醇、黃酮、查耳酮等，因?yàn)榉肿又写嬖诮徊婀捕篌w系，所以是一類平面型化合物，平面型分子堆砌得比較緊密，分子間引力較大，故很難溶于水。

黃酮類化合物分子中有多個(gè)酚羥基，顯酸性，可溶于乙醇.堿水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。3.3分光光度當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直照射某物質(zhì)的溶液后,由于一部分光被體系吸收,因此透射光的強(qiáng)度降至I,則溶液的透光率T為:

根據(jù)朗伯(Lambert)-比爾(Beer)定律:

A=abc

式中A為吸光度，b為溶液層厚度（cm），c為溶液的濃度（g/dm^3)，

a為吸光系數(shù)。其中吸光系數(shù)

與溶液的本性、溫度以及波長(zhǎng)等因素有關(guān)。溶液中其他組分（如溶劑等）對(duì)光的吸收可用空白液扣除。

由上式可知，當(dāng)固定溶液層厚度l和吸光系數(shù)

時(shí)，吸光度A與溶液的濃度成線性關(guān)系。在定量分析時(shí)，首先需要測(cè)定溶液對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收情況（吸收光譜），從中確定最大吸收波長(zhǎng)

，然后以此波長(zhǎng)

的光為光源，測(cè)定一系列已知濃度c溶液的吸光度A，作出A~c工作曲線。在分析未知溶液時(shí)，根據(jù)測(cè)量的吸光度A，查工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度?？傸S酮得率%=【量取液濃度（mg/mL）*體積（mL）*稀釋倍數(shù)】/[稱去樣品干重（g）*1000]6實(shí)驗(yàn)結(jié)果表一：不同波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響結(jié)果波波長(zhǎng)nm446044704480449055005510552055055405550吸光度A00.10400.11100.11300.11600.1190.12400.11200.10100.09200.087表二：不同波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響曲線表三：溶液分光光度測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度ug/ml010203040吸光度A0.0230.1240.2720.3420.415表四：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制圖表標(biāo)題圖表標(biāo)題00.10.20.30.40.501020304050蘆丁濃度（ug/mL）吸光度A吸光度A線性(吸光度A)由表一數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，以濃度（c，ug/ml）為橫坐標(biāo)，吸光值（A722）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：y=0.01002x+0.0348r2=0.9898表五：溫度對(duì)黃酮提取量的影響（乙醇濃度設(shè)為65%2h）溫度℃556575黃酮含量%0.6371.2721.166表六：乙醇濃度對(duì)黃酮提取量的影響（溫度設(shè)為65℃時(shí)間h）乙醇濃度%55%65%75%黃酮含量%0.8461.2720.833表七：提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響（溫度設(shè)為65℃乙醇濃度65%）時(shí)間h123黃酮含量%0.9331.2720.999表七：提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響（溫度設(shè)為65℃乙醇濃度65%時(shí)間2h）pH891011黃酮含量%1.0131.1511.2721.1157實(shí)驗(yàn)討論由所得數(shù)據(jù)得到絡(luò)合物于510

nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。用最小二乘法做線性回歸，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度A與濃度C的關(guān)系曲線的回歸方程為：Y=0.01002X+0.0348r2=0.9898比色溶液顯色后，在5小時(shí)內(nèi)的吸光度的變化小于5%，黃酮類物質(zhì)與鋁鹽生成的絡(luò)合物顯色穩(wěn)定，說明分光光度法以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定總黃酮含量穩(wěn)定可靠，且簡(jiǎn)單易行。由圖表知浴溫度對(duì)總黃酮得率的影響：黃酮提取量先隨溫度升高而升高，當(dāng)達(dá)到65℃以后又開始降低，所以低溫和較高溫度都不利于總黃酮的提取。溫度過低降低了黃酮的溶解度低，而不能充分地把果皮中總黃酮完全提取，而溫度較高時(shí)，黃酮類化合物的穩(wěn)定性差，易發(fā)生氧化作用而失效，造成總黃酮得率降低。(3)由圖表知乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響：黃酮提取量先隨乙醇濃度升高而升高，當(dāng)達(dá)到65%以后又開始降低，乙醇的濃度較大和較低時(shí)，總黃酮的得率都比較低，表明蘋果中的黃酮類化合物具有一定的水溶性。65%的乙醇兼有極性、非極性和中等極性的特點(diǎn)，適合提取混合物成分。另外，與甲醇相比，用乙醇作溶劑具有無毒、無異味、無殘留、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。(4)由圖表知提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響：黃酮提取量先隨時(shí)間升高而升高，當(dāng)達(dá)到2h以后又開始降低，所以并非時(shí)間越久越好，提取2個(gè)小時(shí)與提取3個(gè)小時(shí)差異不是很明顯，而且時(shí)間較久時(shí)提取量還有下降的趨勢(shì)，原因可能是因?yàn)辄S酮的穩(wěn)定性較差，時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)易發(fā)生氧化反應(yīng)，在高溫提取過程中分解變性，致使黃酮的率降低。(5)由圖表知pH對(duì)總黃酮提取的影響：黃銅提取量先隨著pH升高而升高，pH當(dāng)達(dá)到10時(shí)，黃銅提取量又開始降低，可能原因是pH較高時(shí)含有的NaOH溶質(zhì)較多，而造成分析結(jié)果出現(xiàn)干擾，因此pH=10時(shí)提取效果最好。(6)本體是一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)，按全面實(shí)驗(yàn)要求，須進(jìn)行3^3=27種組合的實(shí)驗(yàn)，且尚未考慮每一組合的重復(fù)數(shù)。全面試驗(yàn)的最大優(yōu)點(diǎn)是所獲得的信息量很多,可以準(zhǔn)確地估計(jì)各實(shí)驗(yàn)因素的主效應(yīng)的大小,還可估計(jì)因素之間各級(jí)交互作用效應(yīng)的大小;其最大缺點(diǎn)是所需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)最多,因此耗費(fèi)的人力、物力和時(shí)間也較多,當(dāng)所考察的實(shí)驗(yàn)因素和水平較多時(shí),研究者很難承受。8注意事項(xiàng)（1）蘋果皮的烘干度要一致，最好就一次性把整個(gè)實(shí)驗(yàn)所需的材料烘干好。（2）選擇合適的溶劑，所選的溶劑要對(duì)所提取的成分的溶解性大，對(duì)雜質(zhì)的溶解度小，而且毒性要小。（3）注意加入適量的溶劑，在水浴的過程中有必要的隔一段時(shí)間搖勻混合物。（4）關(guān)閉水嘴后要先加水到水位線，再接通電源，但水浴鍋的水位不能加得過高，以防止水溢出造成安全事故的發(fā)生，水浴鍋不使用或進(jìn)行修理時(shí)，應(yīng)切斷電源，以保證安全。（5）要從小到大依次稀釋提取液的倍數(shù)，使待測(cè)液的吸光度能在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。（6）采用NaNO2-Al(NO3)3比色測(cè)定時(shí)，每加入亞硝酸鈉，硝酸鋁或氫氧化鈉是都要搖勻后靜止，且要保證每次測(cè)定都要使搖勻時(shí)間保持一致。（7）比色皿使用完畢后要立即用蒸餾水沖洗干凈，并用吸水紙吸干比色皿中的水以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率，同時(shí)取拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光學(xué)表面。（8）為防