堿裂解提取質(zhì)粒各個試劑作用

質(zhì)粒提取試劑的原理堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒是從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室每天都要用的常規(guī)技術(shù)可是我收研究生十幾年了幾乎毫無例外的是我那些給人感覺什么都知道的優(yōu)秀學(xué)生卻對堿法質(zhì)粒抽提的原理知之甚少追其原因我想大概是因致我的學(xué)生誤入歧途的主要原因后來我發(fā)現(xiàn)其實(shí)是整個中國的相關(guān)領(lǐng)域的研究生水平都差不多甚至有很多“老師”也是這個狀態(tài)這就不得不讓人感到悲哀了為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液： 0M葡萄糖/5Ml/0MA，H0；溶液： 2NH/1%S；溶液I： 3M醋酸鉀/2M醋酸。讓我們先來看看溶液I的作用任何生物化學(xué)反應(yīng)首先要控制好溶液的因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)H值的l溶液是再自然不過的了那么0葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的液I中缺了葡萄糖其實(shí)對質(zhì)液IA呢？大家知道A是+和+配在分子制DNase液I中加入高達(dá)0M的A，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加A，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA質(zhì)粒的TE緩沖液中有A液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。輪到溶液II了這是用新鮮的4N的NaOH和2％的S等體積混合后使?jié)釴aOH稀釋制備0.4N的證NaOH沒有吸收空氣中的2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解這是由于細(xì)胞膜生了從（雙層膜結(jié)構(gòu)向（微囊結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致用了不新鮮的4NH有S也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒如果只用S當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒因?yàn)镾也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為讓基因組DNA變性以便沉淀這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA性復(fù)性的描述所導(dǎo)致有人不禁要問既然是NaOH溶解的細(xì)胞那為什么要S呢？那是為下一步操作做的鋪墊這一步要記住兩點(diǎn)第一時間不能過長千萬不要這時候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA組DNA因組DNA每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)最容易產(chǎn)生的誤解是當(dāng)S碰到酸性后發(fā)生的沉淀如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)顯然與S的加入有關(guān)系如果在溶液II中不加S會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然S不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1％的溶液中慢慢加入5N的，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是l而是，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（me）遇到（m,S而S是水不溶的因此發(fā)生了沉淀如此看來溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置了S中的鈉離子形成了不溶性的而高濃度的鹽使得沉淀更完全大家知道S專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了讓人高興的是大桿菌的基因組DNA這個過程不難想象因?yàn)榛蚪MDNA太長了，長長的DNA自然容易被S給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2M和NaO，因?yàn)殚L時間的堿性條件會打斷DNA所以要中和之基因組DNA一旦發(fā)生斷裂是50－100b大小的片斷，就沒有辦法再被S共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組A混入，脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性也好DNANaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了S沉淀更充分一點(diǎn)。不要以為S沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白酚/氯仿/質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DN的DNase用1的酚/氯仿異戊醇是有很多道理的這里做個全面的介紹（）對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重碰到高濃度的鹽溶（比如4M，離心后酚相會跑到上層不利于含質(zhì)粒的水相的回收但加入氯仿后可以增加比重使得/氯仿始終在下層方便水相的回收還有一點(diǎn)酚與水有很大的互溶性如果單獨(dú)用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中而酚會抑制很多酶反（比如限制性酶切反應(yīng)，因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行至于異戊醇的添加其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰也方便了水相的回收?；厥蘸蟮乃嗪凶銐蚨嗟柠}因此只要加入2倍體積的乙醇在室溫放幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。這時候如果放到－20反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點(diǎn)不同于普通的DNA分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，并用p將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)樣品一般用含RNas（0l的TE緩沖液進(jìn)行溶解不然大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認(rèn)為你看到的是超螺旋線性和開環(huán)這三條帶堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA用I來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶