植物生物技術 植物遺傳標記與分子標記圖譜構建

植物遺傳標記與分子標記圖譜構建1本章要點：◆

遺傳標記類型◆

DNA分子標記技術◆

分子標記圖譜構建2第一節(jié)

遺傳標記3遺傳標記：是指可以穩(wěn)定遺傳的、易于識別的特殊的

遺傳多態(tài)性形式。41.

形態(tài)標記(morphological

markers)

：指能夠明確觀測的一類外部特征性狀，如植物的矮稈、

白化、黃化、變態(tài)葉、雄性不育等。5

優(yōu)點：簡單直觀、經(jīng)濟方便、容易觀察記錄。不足：數(shù)量有限，難以構建飽和的遺傳圖譜；人工培育形態(tài)標記材料的周期長；多態(tài)性差，易受環(huán)境因素的影響；一

些

形

態(tài)

標

記

對

植

株

的

表

型

影

響

太

大

，

與

不

良

性

狀

連

鎖

。62.細胞學標記(cytological

markers)：指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細胞學特征。染色體結構特征包括染色體核型（染色體數(shù)目、大小、

隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C、N、G帶等）分析

來測定基因所在的染色體及相對位置，或通過染色體代換

等遺傳操作來進行基因定位。7Cytogenetic

Mapping（1）染色體染色的方法區(qū)分染色體異染色質(zhì)和常染色質(zhì)、染色

體長短、臂比、中心粒位置等進行染色體分型。8Cytogenetic

Mapping（2）細

胞

遺

傳

學

基

因

定

位

示

意

圖

，

從

圖

中

可

以

看

出

，

不

同

基

因

定

位

于

染

色

體

不

同

位置上。9Cytogenetic

Mapping（3）采用熒光染色體原位雜交的方法進行細胞學遺傳學定位圖示：

不同的探針采用不同的熒光標記，從而可以進行熒光定位分析。10

細胞學

標記材料的選育

需要花

費大量的人力和

較長的

時

間

；某

些

物種對染色體數(shù)目和

結

構變異反應敏感或適

應

變異的

能力差而難以獲得這類標記；一

些

不涉及染色體數(shù)目、結構變

異或帶型變

異的性狀則

難

以用細胞學方法檢測。113.

生化標記(biochemical

markers)

：主要包括貯藏蛋白、同工酶等標記，也指以基因表達的蛋

白質(zhì)產(chǎn)物為主的一類遺傳標記系統(tǒng)?？梢灾苯臃从郴虮磉_

產(chǎn)物的差異，受環(huán)境的影響較小。不足：標記數(shù)量遠遠不能滿足實際的需要（大多數(shù)作物不

足30個）；存在組織和器官特異性。124.

分子標記(molecular

markers)

：

指在分子水平上可標識的遺傳多態(tài)性；廣義：是指基因組上任何位點上的相對差異（遺傳多態(tài)

性）；狹義：是指可標識核苷酸序列的多態(tài)性。13理想的分子標記具有的特點：（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，表現(xiàn)穩(wěn)定；

（2）數(shù)量多（整個基因組）、多態(tài)性高；（3）表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達；

（4）許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體

和雜合體；（5）檢測成本低。14

顯性標記(dominant

markers)：

指F1的多態(tài)性片段與其親本之一

完全相同。如RAPD、AFLP等。F1

P1

P2

共顯性標記(co-dominant

markers)：指雙親的兩個以上分

子量不同的多態(tài)性片段均在F1中

表現(xiàn)。如RFLP、SSR等。F1

P1

P215第二節(jié)

分子標記技術16CAPACITY分子標記的發(fā)展ResequencingDNA

arraySNPsMulti-SSRsRFLPsRAPDsSRAP,

TRAPAFLPsSSRs1985

1990

1995

20001718分子標記的類型和作用原理:基于分子雜交技術的分子標記（RFLP標分子標記記）基于PCR技術的分子標記（RAPD、AFLP、SSR、

SCAR

、CAPs和STS等

）基于DNA芯片技術的分子標記（DNA測序為核心

的分子標記技術

）191.

基于分子雜交技術的分子標記Molecular

Hybridization（核酸分子雜交）：不同來源

的單鏈DNA與單鏈DNA間，在長于20

bp的同源區(qū)域內(nèi)，

以氫鍵連接方式互補配對，形成穩(wěn)定的雙鏈結構的過程。20RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）標記

Restriction

Fragment

Length

PolymorphismRFLP標記原理利用限制性內(nèi)切酶識別并切割不同生物個體

基

因

組

DNA

，

會

產(chǎn)

生

大

小

不

等

的DNA

片

段

，

或

稱

限

制

性

等

位

片

段

；

通過

電

泳

分

離

檢

測

這

些

片

段

，

引

起

酶

解位

點

變

異

的

突

變

，

如

點

突

變

（

新

產(chǎn)

生和

去

除

酶

切

位

點

）

和

DNA

的

重

織

（

如插

入

和

缺

失

造

成

酶

切

位

點

間

的

長

度

變化

）

均

可

導

致

限

制

性

等

位

片

段

的

變

化

，從而產(chǎn)生RFLP。21ABAB限制性內(nèi)切酶位點與放射性探針結合部位①

限制性內(nèi)切酶酶切后；②

電泳分離DNA片段；③

轉移至硝酸纖維素薄膜；④

與放射性探針Southern雜交⑤

放射性自顯影或酶學檢測分析陽性條帶。

顯示出不同材料對該探針的限制性片段多態(tài)性

情況。22Southern雜交過程232432RFLP標記的特點:◆

遍布于整個基因組，數(shù)量多；◆

無表型效應，不受發(fā)育階段器官特異性限制；

◆

共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；◆

DNA需要量大，檢測中用放射性同位素（

P），易造

成環(huán)境污染，檢測技術繁雜周期長，難以用于大規(guī)

模的育種實踐中。252.基于PCR技術的分子標記

PCR技術（略）26（1）隨機擴增多態(tài)性DNA--RAPDWilliams等于1990年創(chuàng)立。

其原理與PCR技術基本一

致。27ABCRAPD標記原理:primer利用隨機引物（一般為8-10bp）通過PCR反應非定點擴增DNA片段，

然后用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴增片段多態(tài)性便

反映了基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性（如右圖）。2829RAPD標記的特點：◆

不需DNA探針，設計隨機引物也無須參考序列信息；◆

技術簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術；◆

顯性遺傳（極少數(shù)共顯性）不能鑒別雜合子和純合

子；◆

DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；

◆

實驗重復性較差，結果可靠性較低。30（2）擴增片段長度多態(tài)性—AFLP

(略)

Amplified

Fragment

Length

Polymorphism1993年由Marc和Pieter發(fā)明的一種DNA分子標記。

該技術是對限制性酶切片段的選擇性擴增，又稱基于

PCR的RFLP。31

AFLP原理：基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，酶切片段與特定的人

工接頭相連接，作為擴增的模板，接頭序列和鄰近的限制

性酶切位點序列作為引物結合位點，然后用特定的引物進

行PCR擴增。引物的3′端含有2～3個選擇性堿基，因此在基因組DNA酶

切片段中，只有那些與引物3′端互補的片段才能被擴增，

最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，多態(tài)性即以擴增片段長度

的不同被檢測出來。32AFLP標記原理33AFLP電泳圖1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

334(3)

簡單重復序列標記--SSRSSR(Simple

Sequence

Repeats)標記是一種以特異引物

PCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛(wèi)星DNA

(Microsatellite

DNA);是一類由幾個核苷酸(一般為1-6個)為重復單位組成的長

達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列,如(CA)

、(AT)、(GGC)

等重復,每個SSR兩側的序列一般是相對保守的單拷貝序列。35SSR標記的原理36SSR分子標記對18份山羊草基因型的擴增電泳圖37研究案例：（吳德志等，2011）38SSR標記的特點：◆

一般檢測到的是一個單一的復等位基因位點，信息量高；

◆

微衛(wèi)星以孟德爾方式遺傳，呈共顯性，可鑒別雜合子和純合子；◆

需DNA量少；◆

數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高；◆

由于開發(fā)標記時需重復序列兩端的序列信息（基因組或

片段序列信息），開發(fā)成本較高。39升級版：EST-SSR標記

Expressed

Sequence

Tag(

表

達

序

列

標

簽

)--

通

過

基

因

的

表

達

產(chǎn)

物

mRNA

（

信

使

RNA

）

反

轉

錄

為

cDNA

，

可

以

定

位

到

染

色

體

的

特

定

位

置

或

用

這

種

較

穩(wěn)

定

的

cDNA

作

為

探

針進行分子雜交，鑒別出于轉錄有關的基因；隨

著

植

物

EST

計

劃

的

實

施

，

公

共

數(shù)

據(jù)

庫

中

的

EST

序

列

迅

速增長。40（4）序列標簽位點--STS(略)

Sequence

Tagged

Sites是對以特定引物序進行PCR

特

異擴增的一

類分子標記

的統(tǒng)稱

。通過設計特定的引物，

使

其

與

基

因

組

DNA

序

列

中

特

定

結

合

位

點

結

合

，

從

而

可

用來擴增基因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。利

用

特

異

PCR

技

術

的

最

大

優(yōu)

點

是

它

產(chǎn)

生

信

息

非

常

可

靠

，

不像RFLP和RAPD那樣存在模糊性。41（5）酶切擴增多態(tài)性序列--CAPsCleaved

Amplified

Polymorphic

Sequence

tagged

sites

CAPs技術又可稱為PCR-RFLP；基本步驟是：先進行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物用

限制性內(nèi)切酶酶切，再用瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分

開，染色觀察；Neff等(1998)在此基礎上又發(fā)展出dCARs技術

(derived

CAPs)，這是檢測單核苷酸多態(tài)性的一種良

好方法。42CAPs標記的原理43CAPs標記的特點：◆

引物與限制性組合非常多，增加了揭示多態(tài)性

的機會，而且操作簡便，可用瓊脂糖電泳分析；◆

呈共顯性，即可區(qū)分純合基因型和雜合基因型；

◆

所需DNA量少；◆

結果穩(wěn)定可靠、操作簡便、快捷、自動化程度

高。44幾種主要分子標記技術比較標記類型RFLPRAPDAFLPSSRSTSCAPs主要原理限制酶切Southern雜交隨機PCR擴增限制性酶切結

合PCR擴增PCR擴增特異PCR擴增PCR擴增產(chǎn)物限制性酶切多態(tài)性水

平中等較高非常高高中等高檢測基因組區(qū)域單/低拷貝區(qū)整個基因組整個基因組重復序列單拷貝區(qū)整個基因組可靠性高中高高高高遺傳特性共顯性顯性/共顯性共顯性/顯性共顯性顯性/共顯性共顯性DNA質(zhì)量要

求5-30μg10-100ng50-100

ng10-100ng50-100

ng10-100

ng實驗周期長短較長短短短開發(fā)成本高低高高高高453.

基于DNA芯片技術的分子標記（DNA測序為核心的高通量分子標記技術

）核苷酸多態(tài)性(Single

Nucleotide

Polymorphism,SNP)

SNP標記是美國學者Lander

E于1996年提出的第3代DNA

遺傳標記;SNP

是

指

同

一

位

點

的

不

同

等

位

基

因

之

間

僅

有

個

別

核

苷

酸

的

差

異

或

只

有

小

的

插

入

、

缺

失

等

；

從

分

子

水

平

上

對

單

個

核

苷

酸

的

差

異

進

行

檢

測

，

SNP標記可幫助區(qū)分個體遺傳物質(zhì)的差異。46DNA芯片又叫做基因芯片(gene

chip)或基因微陣列(microarray)，寡核酸芯片，或DNA微陣列。它是通過微陣列技術將高密度

DNA片段

陣列以一定的排列方式使其附著在玻璃、尼龍等材料上面，由于常用

計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。4748DNA測序（DNA

sequencing）是指分析特定DNA片段的堿基序列，

也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排

列方式。4950思考題：如何選擇分子標記？

研究對象的相關信息

研究目的結果的可靠性和可重復性分子標記的遺傳特性

費用時間51第三節(jié)

遺傳圖譜構建52DNA分子標記在植物生物技術中的應用

◆

構建高密度的遺傳連鎖圖◆

基因定位◆

遺傳多樣性和物種親緣關系53

基因組包括4種圖譜：遺傳連鎖圖譜、物理圖譜、核苷

酸序列圖和基因圖。遺傳連鎖作圖

Genetic

mapping：采用遺傳學分析方法將基因

或其它DNA序列標定在染色體上構建連鎖圖

。遺傳圖距單位為厘摩(cM),

每單位厘摩定義為1%交換率。

物

理

作

圖

Physical

mapping

：

采

用

分

子

生

物

學

技

術

直

接

將

DNA分子標記、基因或克隆標定在基因組實際位置。核苷酸序列圖

Nucleotide

sequence基因圖

Gene

map54一、高密度遺傳連鎖圖譜構建

1.

概念及進展遺傳連鎖圖是指通過遺傳重組分析得到的基因在染色體上

線性排列圖，基因間的距離通常用遺傳重組值來表示。水稻遺傳圖譜552.

遺傳圖譜構建的原理（遺傳學相關內(nèi)容）其理論基礎是染色體的交換與重組。遺傳學：“基因定位與連鎖遺傳圖”分離重組、連鎖交換：兩點測驗、三點測驗確定基因間的

排序。563.

連鎖遺傳圖譜構建步驟①

通過連續(xù)多次二點或三點測驗，可以確定位于同一染

色體標記的位置和距離。②

連鎖群：存在于同一染色體上的全部標記。③

一種生物連鎖群數(shù)目與染色體對數(shù)一致，可暫時少于染

色體對數(shù)。如：

水稻n=12、玉米n=10、大麥n=7。④

繪制連鎖遺傳圖：以最先端標記為0，依次向下，不斷

補充變動。位于最先端基因之外的新發(fā)現(xiàn)基因，則應把0點

讓給新基因，其余基因作相應變動。574.

遺傳圖譜構建的主要環(huán)節(jié)

選擇適合作圖的分子標記，根據(jù)遺傳材料之間的多

態(tài)性確定親本組合；建立作圖群體，即具有大量分子標記處于分離狀態(tài)

的分離群體或衍生系；群體中不同植株或品系的標記基因型的分析；借助計算機程序建立標記之間的連鎖分析。585.

遺傳作圖群體

作圖群體（mappingpopulation）：是指用于遺傳作

圖的分離群體，如F2、BC1、DH、RIL等?；疽螅海?）群體要足夠大；（2）群體隨機分離；（3）雙親間的多態(tài)性高。596061F2BC1DHRIL群體形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化個體F2個體自交后代性狀研究對象個體個體品系品系準確度低低高高必要的群體規(guī)模大大中中分離比例1:2:3或3:11:11:11:162構建遺傳圖譜的常用軟件

軟件名稱及簡要介紹、操作系統(tǒng)、參考文獻及獲取

軟件的網(wǎng)址信息：

/soft/list.html

目前應用最為廣泛的作圖軟件之一：

/distrubution/software.mapmaker3636.

高密度（飽和）DNA標記連鎖圖譜遺傳圖譜飽和度：是指單位長度染色體上已定位的標記

數(shù)，或標記在染色體上的密度。通常用平均間距和最大間

距表示。連鎖框架圖：標記平均間隔≤20cM；主基因定位：標記平均間隔10～20cM或更?。籕TL定位：標記平均間隔＜10cM；基因克?。簶擞浧骄g隔＜1cM；基因組大小差異大，要求所需的標記數(shù)是不同的。64物種染色體基因組大小圖譜飽和度Base

pair（Mb）Map

length（cM）Physical

map（kb/cM）10cM5

cM1

cM0.5

cM人類2333003300100033066033006600酵母16144200342084042008400水稻12450170025017034017003400玉米102500150017001503006001200擬南芥5100500200501005001000番茄1295013007501302601300260065二、基因定位◆

質(zhì)量性狀（qualitative

character）呈現(xiàn)不連續(xù)變異、具有質(zhì)的區(qū)別的性狀。如：顏色等性狀。通常受一個或少數(shù)幾個基因控制，不易受環(huán)境影

響?！?/p>

數(shù)量性狀（quantitative

character）呈現(xiàn)連續(xù)變異、不能明確分組的性狀。如：株高、產(chǎn)量等性狀。通常受多個基因控制，容易受環(huán)境影響。66數(shù)量性狀質(zhì)量性狀671.

質(zhì)量性狀基因定位方法近等基因系分析法（Near

Isogenic

Lines

Analysis，

NIL）

群體分離分析法（Bulked

Segregation

Analysis，BSA）68NIL（近等基因系）分析法近等基因系（NIL）：兩個或多個形態(tài)上相似，遺傳背景

相同或相近，僅在個別染色體區(qū)段上存在差異的遺傳材料。如果一對近等基因系在目標性狀上表現(xiàn)差異，那么凡是能在這對近等

基因系之間揭示多態(tài)性的分子標記就可能位于目標基因的附近。

因此利用NIL材料，可以尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記。69NIL分析法基本步驟：1）篩選與目標基因連鎖的分子標記：利用分子標記技術分析一對近等基因系，篩選在兩者間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物或探針。

2）進行標記與目的基因連鎖的驗證：利用多態(tài)性標記/探針對近等基因系間雜交分離群體中的單株進行篩選，確定每個單株的標記

基因型。同步對分離群體中單株的目標性狀進行調(diào)查。3）基因定位：利用Mapmaker等軟件確定目標性狀與標記

之間的連鎖關系，并計算遺傳距離和繪制連鎖圖。70BSA（群體分離）分析法在作圖群體中，根據(jù)目標性狀表型的相對差異，將個

體分離成兩組